作物应答高盐、低温胁迫的分子机理

项目名称： 作物应答高盐、低温胁迫的分子机

起止年限：依托部门：理

武维华 中国农业大学 2006.1至2010.12 教育部 中国科学院

首席科学家：

一、研究内容

下述6个方面分别为6个课题的主要研究内容： 1、植物细胞感受、传递、响应高盐、低温等胁迫的细胞信号转导分子机理：包括探讨植物小分子与多肽激素、类受体激酶、胞内钙信使、细胞骨架、蛋白质可逆磷酸化等参与的逆境信号转导途径组分及其相互间的网络关系等。具体研究内容包括：（1）、介导高盐、低温逆境信号感受与传递的质外体多肽、类受体激酶及渗透敏感膜蛋白的分子鉴定与作用机制研究；（2）钙、磷脂酶D/磷脂酸及H2O2等第二信使在植物响应高盐、低温胁迫信号转导中的分子作用机制；（3）钙信使上游的钙离子通道、下游的钙依赖型蛋白激酶（CDPK）和CBL/CIPK基因家族成员参与植物应答高盐、低温胁迫的的功能基因组研究；（4）细胞微管和微丝骨架感受或传递高盐、低温胁迫信号的分子机理；（5）蛋白激酶PKSs对H+-ATPase的分子机制及在植物耐碱性状表达中的功能。 2、作物响应高盐、低温等胁迫的基因转录机理：包括对逆境诱导转录因子家族（如WRKY、NAC、MYB、bZIP等家族）成员及其作用的启动子元件的克隆和功能分析等。本课题主要研究内容可概括为转录因子上游因子、转录因子、转录下游机制三个层次（见以下示意图），具体内容包括：（1）ERFs类转录因子的上、下游基因的克隆及其编码蛋白的生化分析和其启动子区域元件的研究，分析此类转录因子在乙烯及ABA信号途径中的分子作用机制；（2）依赖ABA的转录中的上游调节因子的鉴定及功能分析，研究其相应转录因子的机制及参与ABA和非生物胁迫信号转导的网络机制；（3）分析与植物响应高盐、低温胁迫密切相关的一些重要转录因子（如WRKY6、WRKY78、bZIP2、bMyb3、bHLH、Dof2）及转录因子结合蛋白（如TTG1等）的功能与作用机制，克隆与逆境应答相关的新的转录因子并对其功能和作用进行分析；（4）与课题1合作，分析研究WRKY、bZIP、bMyb和bHLH等家族部分成员活性受磷酸化的分子机制，鉴定并研究3-5个重要的转录因子蛋白激酶；（5）与课题3、4合作，鉴定所克隆的转录因子的、与逆境应答相关的靶基因，分析这些基因的产物所参与或调节的抗逆代谢过程（如细胞壁成分、色素等次生代谢途径及小分子渗透物质、无机离子等的积累与分配）。 3、模式植物和作物耐盐、耐低温性状和关键代谢途径相关的重要新基因的克隆和功能分析：具体研究内容包括：（1）利用已经获得的2个耐高盐（skc1和st1）、2个耐低温水稻突变体（qsct1和qsct5）、5个耐高盐拟南芥突变体（hst1  hst5）和3个耐低温拟南芥突变体（ltt1, ltt2, lts1）克隆重要耐盐和耐低温相关基因，并研究这些基因的表达和生化功能；（2）研究对渗透胁迫敏感、编码膜通道蛋白的OSR家族10个成员（OSR1  OSR10）的功能；（3）通过对拟南芥和水稻在高盐、低温处理下的基因表达谱（基因芯片）的分析获得耐高盐、耐低温新基因信息（已完成盐胁迫诱导的拟南芥和水稻基因芯片分析），利用相应基因的T－DNA插入突变体进行耐盐、耐低温表型分析鉴定及相关的遗传学研究，详细分析研究其中显著影响植株耐盐、耐低温表型的基因的功能；（4）与课题1、2、4、5合作，分析研究并建立上述与耐盐、耐低温相关的基因之间的互作关系及网络。 4、重要耐逆资源植物重要耐盐、耐低温性状和关键代谢途径相关的重要新基因的克隆和功能分析：课题拟开展的研究工作内容主要包括：（1）利用野生稻和栽培稻杂交选育的渗入品系，从中筛选出一些具有明显耐低温、耐盐的材料；利用Affymetrix最新的水稻全基因组芯片对这些渗入品系进行表达谱分析，结合对亲本和杂交后代的基因型分析、验证，鉴别出与耐低温、耐盐等抗逆表型密切相关的基因，并对其中的重要新基因进行功能和表达分析；（2）根据小盐芥与拟南芥基因表达谱的比较分析，克隆由盐胁迫特异诱导的、可能与小盐芥的特殊耐高盐性状密切相关的一些基因，如ATHB7和NAC等编码转录因子的基因及表达受这些转录因子的一些重要基因KIN1、KIN2、COR47、COR78（RD29A）、LTI65（RD29B）等（见附图）；（3）利用小盐芥和野生稻的EMS诱变或T-DNA插入突变体库筛选高度耐盐或对盐胁迫高度敏感、耐低温的突变体，并进行基因克隆与基因功能分析；（4）利用生活在不同极端生态环境条件下（低温、盐碱、高海拔）的不同生态型拟南芥及其杂交后代筛选高度耐盐或对盐胁迫高度敏感、耐低温的株系并进行基因的克隆与功能分析等；（4）、与课题5合作，通过基因表达谱比较分析，研究小盐芥与拟南芥、不同生态型拟南芥之间应答高盐、低温胁迫的分子网络机制。 5、基于生物信息学的不同作物和模式植物比较基因组及植物逆境信号转导与基因表达网络机理研究：具体研究内容包括：（1）基于基因芯片、cDNA微阵列及已发表文献的数据库，以模式植物拟南芥和水稻逆境相关基因表达谱数据和基因功能研究结果为重点，构建植物耐盐、耐低温等抗逆性状相关的基因数据库，通过对大规模基因表达谱的分析，寻找未知的与逆境反应相关的基因及其转录途径，运用系统方法（全基因组定位分析、转录因子网络等）和计算机算法（贝叶斯网络模型、基因模块等）建立植物应答高盐、低温等胁迫的信号转导和基因表达分子网络模型（目前已经构建的植物应答高盐、低温等胁迫的分子网络模型见以下附图，应用美国Stratagene的网络分析软件PathwayAssist分析得出的模型）；同时根据本项目及国内外他人的新研究进展对提出的网络模型不断修改、调整和补充；（2）通过拓朴分析，筛选出处于上述网络模型中各子网络中心的节点和处于关键连接位置的节点以及与之相关的基因信息，建立新的信号传递途径工作模型，提出本项目课题1、2、3、4拟进一步进行生物学研究的方案；进而根据项目其它课题的研究结果不断完善植物应答高盐、低温的分子网络；（3）应用比较基因组研究分析手段，利用模式植物拟南芥和水稻的全基因组信息以及其它作物（小麦、玉米、棉花、大豆、油菜等）的已知信息，寻找不同作物种类中的同源抗逆基因，预测并验证植物抗逆关键基因在作物抗逆中的功能及生物学效应。 6、根据逆境基因转录机理建立作物抗逆性状改良的遗传转化分子操控技术体系，对重要耐盐、耐低温基因的生物学整合效应进行分析研究：主要研究内容包括：（1）、逆境特异诱导型和组织特异表达型启动子的分析与构建：（a）转录水平特异启动子的鉴定和分析：通过对高盐和低温条件下拟南芥和水稻不同器官和特定细胞类型（包括幼苗、根、叶、幼穗、花粉和保卫细胞）中基因表达谱的DNA芯片分析，鉴定组织特异表达且受高盐和/或低温特异诱导的候选基因；通过生物信息学方法分析和鉴定控制这些基因表达的特异启动子。（b）转译水平特异启动子的鉴定和分析：用NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Centre)的GUS启动子捕捉群体筛选组织特异及高盐和低温特异诱导的候选启动子，利用标签信息克隆这些启动子、并用信息学方法进行分析和鉴定。通过以上两方面的鉴定，对部分拟南芥和水稻中的组织特异及高盐和低温特异诱导的启动子进行改造（如增强子的添加、组织特异及逆境特异诱导元件的融合等），然后用启动子功能高通量检测载体分析改造后启动子基因表达的效果。(2)、多基因遗传转化方案及转基因作物生物学效应研究：利用Gateway重组技术将多个（如3-5个）与耐盐、耐低温等抗逆性状密切相关的基因同时与上述鉴定的组织特异及高盐或低温特异诱导的启动子融合，转化水稻或拟南芥。同时，分别将每个基因分别与各自特异的启动子融合，用构建的多个载体同时转化水稻或拟南芥。对以上两种方法获得的转基因植株进行生物学效应（耐盐或耐低温性状）分析，并进一步在水稻、玉米、棉花或番茄等作物中进行验证，探讨作物抗逆性与基因协同效应的关系。 项目拟解决的关键科学问题包括： 1、“类受体激酶-钙-细胞骨架”（R-C-C）介导的作物响应高盐/碱、低温等环境胁迫的信号转导分子网络机制； 2、作物应答高盐/碱、低温等胁迫的部分重要功能基因的转录机理； 3、作物重要耐盐、耐低温等性状新基因的克隆与功能分析及抗逆基因分子互作机制； 4、作物应答高盐、低温与应答水分胁迫之间通过渗透调节交汇点的分子网络机制； 5、重要耐盐、耐低温基因的生物学整合效应分析（耐盐、耐低温相关基因的多基因表达合理操控方案研究）。

二、预期目标

总体目标：克隆一批有自主知识产权、对改良作物耐盐、耐低温等抗逆性状有重要作用、可用于我国作物抗逆新品种培育的重要基因，提出我国作物耐盐、耐低温性状改良分子育种的设计方案，为我国利用分子设计育种方法培育作物抗逆新品种做出贡献。阐明数个在植物响应盐碱、低温等逆境胁迫的信号转导、基因转录及代谢研究领域的重要科学问题，发表一些在国际科学界有影响的高水平研究论文。培养一批能够从事相关领域高水平研究的优秀年轻人才，组织和形成一支具有团结协作精神、国内水平一流并在国际上有一定影响和积极参与国际竞争的研究队伍。 五年预期目标：通过项目实施，克隆30个以上对植物抗逆性状表达有重要功能或作用的新基因并完成对其功能的解析；初步建立23个植物应答高盐、低温等环境胁迫的信号转导和基因表达分子网络途径，完成对其中关键因子的详尽分析；在国际学术期刊发表研究论文100篇以上（或论文累计SCI影响因子400以上）；获得20个以上对改良作物抗逆性状有应用价值的新基因发明专利。初步完成23种主要农作物耐盐、耐低温性状改良的分子育种技术设计，并获得3-5个耐盐、耐低温作物新品系等。培养具有博士和硕士学位的优秀年轻人才100人、博士后30人，使其中部分优秀年轻人才具有今后从事相关领域高水平研究的综合能力。（各课题的详细目标分解见下述“研究方案”中各课题预期目标）。

三、研究方案

1、整体思路： 根据项目拟解决的关键科学问题和主要研究内容（见第三、六部分），项目整体上分为植物应答高盐和低温胁迫的“信号转导、转录、代谢”分子机制三个层次的实验研究（课题1、2、3、4）；同时利用生物信息学的理论与方法，结合国内外研究进展和本项目的研究结果，建立植物应答高盐、低温、高渗胁迫的分子“网络”机制模型（课题5）；并在上述工作基础上，通过构建“智慧型”（适时、适地、适量）基因表达启动子和多基因表达载体，应用多基因作物遗传转化方法，对重要耐盐、耐低温基因的生物学整合效应进行分析（课题6）。 2、整体技术方案（详细内容见下述各课题研究方案和技术路线）： （1）、课题1、2、3、4拟利用项目组成员多年积累的耐盐、耐低温、耐高渗胁迫的拟南芥和水稻突变体及T-DNA插入突变体库，综合应用遗传分析、图位克隆、生物化学、细胞生物学、功能基因组和蛋白质组等研究方法，克隆一批新的重要逆境信号转导因子、转录因子和抗逆功能基因，详细解析这些新基因的生化功能及与其它相关基因的互作机制。 （2）、课题5则主要利用生物信息学和比较基因组学的理论与方法，分析课题1、2、3、4的研究结果，结合国内外研究进展进行进一步分析整合，利用PathwayAssist等网络分析方法，建立植物应答高盐、低温、高渗胁迫的分子“网络”机制工作模型。通过数据和结果的整合与分析逐步完善分子网络模型，并根据模型随时对课题1、2、3、4的研究内容进行必要调整。 （3）、课题6则综合利用上述课题的研究结果（包括重要抗逆基因、转录因子、基因互作机制等），通过对基因表达启动子和多基因表达载体的改造或构建，建立能实现抗逆基因适时、适地、适量表达的作物遗传转化技术，对重要耐盐、耐低温基因的生物学整合效应进行分析。 3、项目的创新性和特色： （1）从项目的整体思路上，提出了植物应答高盐和低温胁迫的“信号转导、转录、代谢”分子机制三个层次的研究方案。提出的“植物应答高盐、低温胁迫的RCC信号转导途径”和以“转录因子和蛋白激酶”为中心的转录和代谢途径工作模型等包含了一些有明显创新性的研究内容。整体研究方案有利于系统、全面地探讨植物应答高盐、低温胁迫的分子机理，也有助于逐步阐明植物应答逆境胁迫的信号转导、转录、代谢等之间的复杂网络机制。 （2）在研究方案中，特别注重充分利用最新的生物信息学和比较基因组学的理论与方法，综合植物抗逆生物学和功能基因组学研究的海量数据，进一步建立植物应答高盐、低温胁迫的分子“网络”机制模型，并随时根据研究进展不断完善相关的网络模型。有可能在35个途径和23个网络机制方面获得有创新意义的重要进展或突破。 （3）获得一批对植物耐盐、耐低温性状表达有重要功能或作用、并有重要应用前景的新基因并完成对其功能的解析。 （4）提出作物耐盐、耐低温性状改良的分子育种设计方案，实现对重要耐盐、耐低温基因的生物学整合效应的分析研究。 4、课题设置、各课题主要研究内容、参加人员及单位等： 课题1、植物细胞响应高盐、低温胁迫的信号转导分子机理 本课题主要以模式植物（拟南芥、水稻）的重要细胞模型（如气孔保卫细胞、根毛等）为研究系统，探讨作物感受、传递、响应高盐、低温渗等非生物胁迫信号的跨膜及细胞内转导的分子机理。课题组人员已经获得了一系列重要的前期研究结果，包括：Ca2+/CaM 可能参与逆境信号途径中转录因子活性调节、盐胁迫下水稻类受体激酶WAK的转录增加、盐胁迫诱导质外体多肽类受体激酶DUF26转译增加、细胞骨架对离子通道有广泛的作用、获得了与耐盐碱胁迫相关的拟南芥PKS5突变体、证明了细胞质膜钾和钙离子通道受细胞骨架和蛋白激酶、证明了至少有2个CDPKs参与盐胁迫信号转导、发现了一个可能作为渗透胁迫感受器（osmo-sensors）的包括10个成员的基因家族等等。根据这些研究结果，提出了RCC途径作为进一步研究的工作模型（见以下RCC途径示意图），其中重点研究胞外多肽和植物激素（乙烯和ABA）、类受体激酶、钙信使、磷酯酶D和磷酯酸（PLD/PA）、细胞骨架、蛋白激酶（CDPK / CIPK / PKS等）、离子通道等参与的逆境信号转导途径中上、下游信号组分的作用及相互间的网络关系。 具体研究内容包括：（1）、介导高盐、低温逆境信号感受与传递的质外体多肽、类受体激酶及渗透敏感膜蛋白的分子鉴定与作用机制研究；（2）钙、磷脂酶D/磷脂酸及H2O2等第二信使在植物响应高盐、低温胁迫信号转导中的分子作用机制；（3）钙信使上游的钙离子通道、下游的钙依赖型蛋白激酶（CDPK）和CBL/CIPK基因家族成员参与植物应答高盐、低温胁迫的的功能基因组研究；（4）细胞微管和微丝骨架感受或传递高盐、低温胁迫信号的分子机理；（5）蛋白激酶PKSs对H+-ATPase的分子机制及在植物耐碱性状表达中的功能。 课题研究内容的创新性和预期的可能突破点：上述研究内容中涉及的信号转导因子在植物响应高盐、低温胁迫过程中的作用和分子互作机理均属未知，而我们尚未发表的前期研究结果已初步证明它们在植物的逆境信号转导中有重要作用，因此具有明显的创新性。预期的可能突破点有：明确鉴定2-3种在植物感受和传递高盐、低温胁迫信号中有重要功能的受体激酶并阐明其分子作用机理；阐明细胞骨架动态变化与植物细胞感受和传递逆境胁迫信号的关系；明确鉴定3-5种在植物感受和传递高盐、低温胁迫信号中有重要功能的CDPK、CBL/CIPK等钙依赖型蛋白激酶并阐明其分子作用机理；阐明通过CBL/CIPK、蛋白激酶PKSs和H+-ATPase响应碱性环境胁迫的信号途径。 课题预期目标：完成对植物响应逆境信号转导途径中10个以上新关键组分的鉴定、功能和机制分析，包括：明确35个与逆境信号转导相关的质外体多肽及其作用的类受体激酶的分子作用机制，鉴定并分析23个对植物耐盐、耐低温信号转导相关的CDPKs和CBL/CIPKs在逆境信号转导中的生化功能；完成对与PSK5相互作用并在盐胁迫信号中发挥作用的新细胞因子的鉴定；鉴定受２３个磷脂酶D和磷脂酸作用的下游靶分子，阐明磷脂对靶分子的分子作用机理。在上述工作基础上与课题5密切合作，分析不同因子间的分子互作关系，建立植物响应高盐、低温等逆境胁迫的信号转导网络途径模型。发表SCI论文30篇（其中影响因子大于5的论文8篇以上）。培养博士后6人、博士及硕士研究生20人。 课题负责人：孙大业 主要承担单位：河北师范大学，北京生命科学研究所，南京农业大学 主要学术骨干：孙大业、郭岩、章文华 专项经费比例：18.83 % 课题2、植物响应高盐、低温胁迫的基因转录： 本课题围绕植物应答高盐、低温胁迫过程中基因的转录网络机理的重要科学问题开展研究。重点研究一些项目组成员前期工作中已取得重要结果的、在响应高盐或低温信号中有重要作用的转录因子及其作用的启动子元件，并分析它们所的基因表达种类和模式等。本课题主要研究内容可概括为转录因子上游因子、转录因子、转录下游机制三个层次（见以下示意图），具体内容包括：（1）ERFs类转录因子的上、下游基因的克隆及其编码蛋白的生化分析和其启动子区域元件的研究，分析此类转录因子在乙烯及ABA信号途径中的分子作用机制；（2）依赖ABA的转录中的上游调节因子的鉴定及功能分析，研究其相应转录因子的机制及参与ABA和非生物胁迫信号转导的网络机制；（3）分析与植物响应高盐、低温胁迫密切相关的一些重要转录因子（如WRKY6、WRKY78、bZIP2、bMyb3、bHLH、Dof2）及转录因子结合蛋白（如TTG1等）的功能与作用机制，克隆与逆境应答相关的新的转录因子并对其功能和作用进行分析；（4）与课题1合作，分析研究WRKY、bZIP、bMyb和bHLH等家族部分成员活性受磷酸化的分子机制，鉴定并研究3-5个重要的转录因子蛋白激酶；（5）与课题3、4合作，鉴定所克隆的转录因子的、与逆境应答相关的靶基因，分析这些基因的产物所参与或调节的抗逆代谢过程（如细胞壁成分、色素等次生代谢途径及小分子渗透物质、无机离子等的积累与分配）。 课题预期目标：克隆参与耐盐、耐低温逆境应答的重要的新转录因子及相关的蛋白激酶基因8－10个，完成对ERF、ABP、Myb、WRKY、bHLH等转录因子家族中参与植物耐盐、耐低温等转录过程的部分关键因子的分子作用机制研究。通过与课题1、3、5的合作，初步建立植物响应及适应高盐、低温等逆境胁迫的转录网络模型，为今后作物抗逆性状的分子改良设计提供理论模型。申请发明专利810项；发表SCI论文20篇（其中影响因子大于5的论文8篇以上）。培养博士后6人、博士及硕士研究生20人。 课题负责人：陈受宜 承担单位：中科院遗传与发育研究所，中国农科院生物技术所 主要学术骨干：陈受宜，黄荣峰，周奕华 专项经费比例：18.83 % 课题3、重要耐盐、耐低温新基因的克隆与功能研究 充分利用拟南芥、水稻的耐盐、耐低温突变体克隆与耐逆性状（重要表型和关键代谢途径）相关的重要新功能基因，并进行其表达和功能机理的研究。具体研究内容包括：（1）利用已经获得的2个耐高盐（skc1和st1）、2个耐低温水稻突变体（qsct1和qsct5）、5个耐高盐拟南芥突变体（hst1  hst5）和3个耐低温拟南芥突变体（ltt1, ltt2, lts1）克隆重要耐盐和耐低温相关基因，并研究这些基因的表达和生化功能；（2）研究对渗透胁迫敏感、编码膜通道蛋白的OSR家族10个成员（OSR1  OSR10）的功能；（3）通过对拟南芥和水稻在高盐、低温处理下的基因表达谱（基因芯片）的分析获得耐高盐、耐低温新基因信息（已完成盐胁迫诱导的拟南芥和水稻基因芯片分析），利用相应基因的T－DNA插入突变体进行耐盐、耐低温表型分析鉴定及相关的遗传学研究，详细分析研究其中显著影响植株耐盐、耐低温表型的基因的功能；（4）与课题1、2、4、5合作，分析研究并建立上述与耐盐、耐低温相关的基因之间的互作关系及网络。 课题预期目标：完成对植物耐盐、耐低温等胁迫性状表达有重要作用的10个以上新功能基因的克隆、表达及功能分析，为今后应用基因工程技术进行作物抗逆性改良的分子设计育种提供有自主知识产权的重要功能基因。申请发明专利810项；发表SCI论文25篇（其中影响因子大于5的论文8篇以上）。培养博士后6人、博士及硕士研究生20人。 课题负责人：武维华 承担单位：中国农业大学，中科院上海植生所，中科院植物研究所 主要学术骨干：武维华，高继平，李香花 专项经费比例：18.33 % 课题4、特殊生境资源植物中重要耐盐、耐低温基因的克隆与功能研究 本课题拟选择有代表性耐盐或耐低温性状、与模式植物有一定可比性、便于做遗传转化、生长发育周期较短的资源植物种类，利用理化诱变和T-DNA插入等方法建立突变体库，通过筛选耐盐或耐低温突变体，克隆与耐盐或耐低温性状相关的重要新功能基因，探讨植物在特殊生境下适应高盐或低温逆境的分子途径。 拟选择的资源植物材料主要包括：以我国特有的野生稻资源（如江西东乡野生稻等）作为禾本科植物的野生代表材料，以生长在我国沿海盐碱滩涂和戈壁滩的小盐芥（Thellungiella halophila）及我国特有的分布在和等特殊生境条件下的不同生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为双子叶植物的野生代表材料。小盐芥是与模式植物拟南芥同属十字花科的高度耐盐（300 mM NaCl）野生植物，具有基因组小（仅是拟南芥基因组的约2倍）、生活周期短等与拟南芥极为相似的特点。而采集自我国、等地的拟南芥生态型则由于其生活环境的特殊，很可能具有一些特别重要的抗逆基因资源。我国江西东乡的野生稻具有特别耐寒的优良性状，是克隆重要耐寒基因及研究植物应答低温胁迫的很好野生植物资源。 课题组成员已经取得的前期研究结果主要有：（1）已经完成了对不同生态型小盐芥（山东、、加拿大）的收集与生长、发育及逆境应答特性的观测和评估。其中，山东生态型小盐芥（2个）主要表现耐盐性状；生态型小盐芥主要表现耐干旱性状；加拿大生态型小盐芥主要表现耐低温和干旱的性状。已获得不同生态型小盐芥的杂交后代分离群体；建立了小盐芥的基因转化技术方法。构建了小盐芥cDNA文库并进行了随机克隆测序，已完成5000余条盐诱导EST的测序及获得了数百条受盐胁迫诱导的基因的全长cDNA。应用化学诱变（EMS）和T-DNA插入方法分别获得一批突变体。还利用小盐芥完成了其基因表达谱（利用拟南芥基因芯片）的分析，发现了一些可能与其高度耐盐性状相关的基因表达谱信息，并利用PathwayAssist网络分析软件构建了小盐芥响应高盐胁迫的部分基因表达网络工作模型（见附图）等。（2）已搜集了十多个分布在我国、等特殊生态环境下的拟南芥生态型，并已开展了与经典拟南芥生态型（Col）的比较基因组研究及耐盐、耐低温表型比较分析等。（3）利用江西东乡野生稻与栽培稻杂交获得的基因渗入品系，对其基因表达谱与栽培稻进行比较分析，已获得了一些有意义的结果。例如：对一表现显著耐低温性状的基因渗入材料的基因表达谱与栽培稻基因表达谱的生物信息学比较分析结果表明，可能杂交渗入品系的耐低温性状与一个与氧化胁迫相关基因的可变剪切表达型式发生变化相关。 课题拟开展的研究工作内容主要包括：（1）利用野生稻和栽培稻杂交选育的渗入品系，从中筛选出一些具有明显耐低温、耐盐的材料；利用Affymetrix最新的水稻全基因组芯片对这些渗入品系进行表达谱分析，结合对亲本和杂交后代的基因型分析、验证，鉴别出与耐低温、耐盐等抗逆表型密切相关的基因，并对其中的重要新基因进行功能和表达分析；（2）根据小盐芥与拟南芥基因表达谱的比较分析，克隆由盐胁迫特异诱导的、可能与小盐芥的特殊耐高盐性状密切相关的一些基因，如ATHB7和NAC等编码转录因子的基因及表达受这些转录因子的一些重要基因KIN1、KIN2、COR47、COR78（RD29A）、LTI65（RD29B）等（见附图）；（3）利用小盐芥和野生稻的EMS诱变或T-DNA插入突变体库筛选高度耐盐或对盐胁迫高度敏感、耐低温的突变体，并进行基因克隆与基因功能分析；（4）利用生活在不同极端生态环境条件下（低温、盐碱、高海拔）的不同生态型拟南芥及其杂交后代筛选高度耐盐或对盐胁迫高度敏感、耐低温的株系并进行基因的克隆与功能分析等；（4）、与课题5合作，通过基因表达谱比较分析，研究小盐芥与拟南芥、不同生态型拟南芥之间应答高盐、低温胁迫的分子网络机制。 课题预期目标：自特殊生境野生资源植物中克隆10个以上重要耐盐、耐低温新功能基因，为今后应用基因工程技术进行作物抗逆性改良的分子设计育种提供有自主知识产权的重要功能基因；阐明1-2条特殊生境植物应答高盐、低温胁迫的分子途径，并与课题1、2、3、5合作，分析不同植物应答高盐、低温胁迫的分子机制的异同，并期望从中发现开展进一步研究的重要信息。申请发明专利810项；发表SCI论文15篇（其中影响因子大于5的论文4篇以上）。培养博士后2人、博士及硕士研究生15人。 课题负责人：赵彦修 承担单位：山东师范大学，北京大学 主要学术骨干：赵彦修，张慧，范六民 专项经费比例：14.67 % 课题5、植物应答高盐、低温胁迫的分子网络机制研究 根据本项目前期研究结果和拟重点开展的研究内容，结合基因组学、分子生物学在植物逆境信号转导与基因表达方面的已有成果和数据库信息，利用生物信息学的理论与方法，围绕本项目重点内容研究植物应答盐碱、低温胁迫的分子网络机制。本课题的工作流程见下页附图，具体研究内容包括：（1）基于基因芯片、cDNA微阵列及已发表文献的数据库，以模式植物拟南芥和水稻逆境相关基因表达谱数据和基因功能研究结果为重点，构建植物耐盐、耐低温等抗逆性状相关的基因数据库，通过对大规模基因表达谱的分析，寻找未知的与逆境反应相关的基因及其转录途径，运用系统方法（全基因组定位分析、转录因子网络等）和计算机算法（贝叶斯网络模型、基因模块等）建立植物应答高盐、低温等胁迫的信号转导和基因表达分子网络模型（目前已经构建的植物应答高盐、低温等胁迫的分子网络模型见以下附图，应用美国Stratagene的网络分析软件PathwayAssist分析得出的模型）；同时根据本项目及国内外他人的新研究进展对提出的网络模型不断修改、调整和补充；（2）通过拓朴分析，筛选出处于上述网络模型中各子网络中心的节点和处于关键连接位置的节点以及与之相关的基因信息，建立新的信号传递途径工作模型，提出本项目课题1、2、3、4拟进一步进行生物学研究的方案；进而根据项目其它课题的研究结果不断完善植物应答高盐、低温的分子网络；（3）应用比较基因组研究分析手段，利用模式植物拟南芥和水稻的全基因组信息以及其它作物（小麦、玉米、棉花、大豆、油菜等）的已知信息，寻找不同作物种类中的同源抗逆基因，预测并验证植物抗逆关键基因在作物抗逆中的功能及生物学效应。 课题预期目标：通过对基因组和文献数据库信息的挖掘、分析和整合，结合本项目各课题组研究结果和进展，运用系统方法和计算机算法，建立植物应答高盐、低温等胁迫的信号转导和基因表达分子网络模型并不断予以修改调整；分析筛选出8-10个处于网络中心位置和关键连接位置的节点及与之相关的重要新基因，并与课题1、2、3、4合作完成生物学验证工作；力争在建立2-3条有明显创新性的植物应答高盐、低温等胁迫的分子网络途径方面有所突破。发表SCI论文10篇（其中影响因子大于5的论文4篇以上）。培养博士后2人、博士及硕士研究生10人。 课题负责人：苏震 承担单位：中国农业大学，中科院遗传所 主要学术骨干：苏震、徐文英、阎红 专项经费比例：13.83 % 课题6、重要耐盐、耐低温基因的生物学整合效应分析研究 本课题拟通过对根组织、叶片或气孔中特异表达和在盐、低温等非生物逆境下特异诱导表达的启动子进行分析和改造，以期实现对一些与作物耐盐、耐低温等抗逆性状密切相关的重要功能基因或因子进行合理的分子操控（基因重组），以有效地实现对多个抗逆相关主效基因时空特异表达的操纵，为作物抗逆性状改良的分子育种设计提供可行的理论与技术指导。特别注重转基因作物生物学整合效应的分析，以实现在不影响作物其它优良农艺性状的前提下较大幅度提高作物耐盐、耐低温性状的目的。主要研究内容包括： 1、逆境特异诱导型和组织特异表达型启动子的分析与构建：（1）转录水平特异启动子的鉴定和分析：通过对高盐和低温条件下拟南芥和水稻不同器官和特定细胞类型（包括幼苗、根、叶、幼穗、花粉和保卫细胞）中基因表达谱的DNA芯片分析，鉴定组织特异表达且受高盐和/或低温特异诱导的候选基因；通过生物信息学方法分析和鉴定控制这些基因表达的特异启动子。（2）转译水平特异启动子的鉴定和分析：用NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Centre)的GUS启动子捕捉群体筛选组织特异及高盐和低温特异诱导的候选启动子，利用标签信息克隆这些启动子、并用信息学方法进行分析和鉴定。通过以上两方面的鉴定，对部分拟南芥和水稻中的组织特异及高盐和低温特异诱导的启动子进行改造（如增强子的添加、组织特异及逆境特异诱导元件的融合等），然后用启动子功能高通量检测载体分析改造后启动子基因表达的效果。 2、多基因遗传转化方案及转基因作物生物学效应研究：利用Gateway重组技术将多个（如3-5个）与耐盐、耐低温等抗逆性状密切相关的基因同时与上述鉴定的组织特异及高盐或低温特异诱导的启动子融合，转化水稻或拟南芥。同时，将每个基因分别与各自特异的启动子融合，用构建的多个载体同时转化水稻或拟南芥。对以上两种方法获得的转基因植株进行生物学效应（耐盐或耐低温性状）分析，并进一步在水稻、玉米、棉花或番茄等作物中进行验证，探讨作物抗逆性与基因协同效应的关系。 本课题研究工作的主要创新点：利用多种手段研究组织特异性及高盐或低温诱导的启动子，构建“智慧型”表达模式启动子，以达到抗逆基因适时、适地、适量表达，以达到在不影响作物其它优良农艺性状的前提下，为较大幅度提高作物抗逆性的分子改良技术提供理论指导和技术支撑的目的。 课题预期目标：分离鉴定并构建4-5个具有自主知识产权的作物根组织、叶片组织或气孔细胞特异表达、高盐或低温特异诱导的启动子；用启动子缺失与突变技术分离鉴定抗逆基因表达的顺式作用元件2-3组；建立作物多基因遗传转化和启动子技术体系。申请发明专利4-5项，发表SCI论文15篇以上（其中影响因子大于5的论文4篇以上），培养博士后2人、博士研究生10人。 课题负责人：王学臣 承担单位：中国农业大学，山东农业大学 主要学术骨干：王学臣、郑成超，王喜庆 专项经费比例：15.5 % 四、年度计划

研究内容 第1、2、3、4、6课题全面启动实验工作。主要研究内容包括：利用已有突变体和转基因植物材料克隆相关基因及信号转导和转录因子等；构建必要的新实验材料等。具体包括： 1、蛋白质组学、基因组学的方法寻找与逆境胁迫相关的质外体多肽与质膜蛋白（受体激酶）；克隆新的细胞骨架结合蛋白基因；拟南芥PLD突变体耐盐性鉴定，野生型与突变体耐盐生理机制研究。磷脂信号在NaCl和ABA诱导的气孔运动中的作用与分子机理研究。开始水稻耐低温材料的筛选；筛选T-DNA插入及EMS诱变的PKS5突变体，对其进行表型分析；通过real time PCR等方法不同亚型CaM在逆境胁迫下的表达变化；PKS5突变体的筛选、鉴定和表型分析；PKS5各突变蛋白表达载体的构建。 2、筛选大豆应答盐、低温胁迫的转录因子；运用酵母系统筛选与目的转录因子基因互作的基因；转化JERFs基因，分析其可能的基因；克隆与玉米转录因子ABP9相互作用的蛋白的基因；筛选水稻、大豆盐、低温胁迫应答的蛋白激酶基因。 3、克隆拟南芥耐盐、耐低温性状相关基因；精细定位水稻耐盐、耐渗透胁迫相关QTL/基因；克隆水稻抗逆新基因的全长cDNA，构建过量表达载体、RNAi载体等；鉴定耐盐导入系相互配制的F2的耐盐性和标记基因型，进行LD和耐盐性关联分析，鉴定耐盐QTL并解析耐盐性的遗传网络系统；重叠精细定位主效QTL，鉴定与其紧密连锁的分子标记。不同主效耐盐QTL近等基因系的培育。 4、完成小盐芥T-DNA插入突变体库的构建；从EMS突变体库中筛选耐盐株系；完成大规模Knock-down突变体载体的构建；植物泌盐基因的克隆；盐芥、野生稻、野大豆与拟南芥耐盐、耐低温关键基因表预期目标 1、获得1～3个与逆境相关的候选质外体多肽、受体激酶、骨架结合蛋白等基因，完成PSK5突变体的筛选，确定与胁迫相关的CaM亚型；发现磷脂酶D在拟南芥耐盐中的生理作用，揭示磷脂在NaCl和ABA诱导的气孔运动中信号转导的分子机理；建立合适的PKS5突变体筛选体系，获得表型稳定的PKS5突变体株系。 2、鉴定出8－10个大豆应答盐、低温胁迫的转录因子；克隆与玉米转录因子ABP9相互作用的蛋白的基因； 转录组水平分析JERFs的功能；获得水稻、大豆2－3个对盐和/或低温应答的激酶基因。 3、克隆5个拟南芥耐盐、耐低温性状相关基因；精细定位水稻耐盐、耐渗透胁迫相关QTL/基因1-2个；克隆3-4个水稻抗逆重要新基因；鉴定种质资源中的耐盐基因及其遗传网络；精细定位3-5个显著影响耐盐性的主效QTL。 4、建立盐芥高效转化体系；获得2万个T-DNA插入突变体；完成盐芥的RNAi 载体构建；克隆1个泌盐相关基因全长cDNA；获得1-3个耐逆基因的元件。 5、完成基因芯片的实验室管理系统（LIMS）的搭建；初步整理约1000张拟南芥基因芯片数据，包括不同生长时期和不同条件处理；收集约30个野生拟南芥居群的种子，并建立相关的种质信息；绘制耐冷水稻的基因组表达谱，鉴定出与水稻低温胁迫相关的候选基因。 第 一 年 研究内容 达元件的克隆等。 5、建立一整套与基因芯片相关的实验和生物信息学分析平台；收集、整合现有的模式植物（拟南芥、水稻）的基因表达谱数据；收集与高盐、低温等逆境相关的拟南芥和水稻等植物材料，设计一系列实验，充实已有的基因芯片数据和基因组数据，为网络的建立奠定良好基础。提出植物应答盐、低温胁迫的分子网络模型，同时开展植物应答盐、低温胁迫的基因表达谱实验和分析工作，与其它课题分析讨论，进一步明确实验研究内容等。 6、分离高盐、低温诱导型启动子；利用细胞悬浮系快速鉴定高盐、低温诱导型启动子的活性；利用转基因植株鉴定高盐、低温诱导型启动子的活性；根组织和叶片组织特异启动子的分离。 一、第1、2、3、4课题在分别继续克隆相关基因及信号转导和转录因子等，以及开始利用新功能基因转化作物的同时，将工作重点逐步转到对新基因功能的分析研究方面；进一步构建必要的新实验材料等。具体包括： 1、用RNAi, anti-sense和dominate negative及过表达等方法, 研究胞外多肽及受体激酶在逆境胁迫下的表型变化，并做相应的分子水平鉴定；分析新发现的微丝及微管结合蛋白的结合及微丝或微管骨架的特性，通过转基因植物研究骨架结合蛋白的生物学功能；分析这些蛋白在逆境下的表达及分布特性，以及它们在逆境条件下对细胞骨架的作用；开展盐处理下，野生型和PLD突变体中磷脂酶D、蛋白激酶、磷酸酶的表达与活性变化，及其与耐盐性的关系。开始耐低温水稻与PLD关系的研究；植物体内、体外实验证明受PA调节的蛋白激酶、磷酸酶、NADPH氧化酶等与PA结合； 预期目标 6、分离高盐、低温诱导型启动子4个；鉴定高盐、低温诱导型高活性启动子2个。 7、发表SCI论文5-6篇，申请专利3-5项。 第 二 年 1、鉴定出受盐诱导的、与磷脂酶（D）有关的蛋白激酶和蛋白磷酸酶；鉴定到2～3个新的微丝和微管结合蛋白，完成其克隆和转基因植株的建立；确定PKS5各结构域的功能；明确PKS5与其相关蛋白之间的关系。 2、获得5－6个全长应答转录因子；完成对其转录特性的分析；得逆境下互作蛋白基因在玉米中的表达谱，以及互作蛋白的表达对植物抗逆性的影响；在蛋白组水平分析JERFs基因的功能；获得应答盐、冷胁迫全激酶基因2－3个。 3、克隆1-2个水稻耐盐、耐渗透胁迫相关QTL/基因。获得3-4个水稻抗逆重要新基因的转基因稻株，鉴定耐盐功能；构成3-4个水稻抗逆重要新基因的GUS融合载体和GFP融合载体；确定重要位点QTL的位置候选基因；获得重要耐盐基因的NILs；获得20个以水稻转基因株系，2、克隆应答盐、冷胁迫的全长转录因子在对转基因植株进行其耐盐和耐低温性基因，对其结构和转录因子特性作分析；状分析的基础上，确定要深入研究的重要分析逆境下互作蛋白基因在玉米中的表侯选基因；建成作图群体2-3个，完成对 研究内容 达谱，以及互作蛋白的表达对植物抗逆性的影响；对转JERFs基因植株进行蛋白组分析；克隆筛选的水稻、大豆应答盐、冷胁迫全激酶基因。 3、完成对3个拟南芥耐盐耐低温相关基因的功能分析；克隆水稻耐盐、耐渗透胁迫相关QTL/基因；水稻抗逆新基因转化水稻，鉴定耐盐功能；构建水稻抗逆新基因的GUS融合载体和GFP融合载体；获得P5C合成酶表达及相关的拟南芥突变体，并完成对突变体表型、相关生理指标的分析；利用基因组序列信息确定重要位点QTL的位置候选基因。培育出不同QTL组的主要耐盐位点的QTL-NILs；利用20个以上与高盐和低温应答相关的未知功能基因转化水稻，对转基因植株进行耐盐和低温表型鉴定。构建作图群体，对耐冷基因CS18进行功能分析。 4、继续盐芥T-DNA 插入突变体库的构建；EMS 突变体的筛选、遗传与生理分析；Knock-down突变体载体大规模转化盐芥；泌盐基因结构与功能分析；盐芥的氧化还原蛋白质组分析。 二、第5课题根据其它课题研究工作进展及对基因表达谱的生物信息学分析等，逐步修改植物应答盐、低温胁迫的分子网络模型，与其它课题分析讨论，明确各课题进一步的研究内容等。 三、第6课题ABA和Ca2+诱导型启动子的分离；利用细胞悬浮系快速鉴定ABA和Ca2+诱导诱导型启动子的活性；利用转基因植株鉴定高盐、低温诱导型启动子的活性；根组织和叶片组织特异启动子的转基因植株活性鉴定；利用Gateway重组技术构建多基因融合载体并进行鉴定。开始利用新功能基因转化玉米、小麦、油菜等作物。 四、项目进行前两年研究工作全面总结及完成中期考核。 预期目标 耐冷基因CS18的功能分析。 4、获得4万个T-DNA插入突变体；完成1万个T-DNA插入突变体侧翼序列分析；获得1000个盐芥RNAi knock-down突变体；完成1万个T-DNA插入突变体侧翼序列分析；完成泌盐基因的表达分析，证实泌盐基因的功能，完成其离子转运活性分析。 5、基因芯片的实验室管理系统（LIMS）标准化；实现数据交换和共享平台；初步确定基因表达网络算法；建立在低温、高盐胁迫条件下，不同野生拟南芥居群的表达谱；研究不同野生居群应答低温、高盐胁迫的基因表达差异，并建立表达差异与相应的环境的相关性分析；对由芯片鉴定出的与水稻低温胁迫相关的候选基因的表达谱进一步实验验证。 6、分离ABA和Ca2+诱导型启动子2个；分离根组织和叶片组织特异启动子3个；鉴定ABA和Ca2+诱导型高活性启动子2个。 7、发表论文10-15篇，申请专利5项。 研究内容 第1、2、3、4课题全面展开对新基因功能的分析研究。具体包括 1、以质外体多肽、G蛋白、受体激酶等的缺失表达、过表达或野生型为遗传背景，以转有水母发光蛋白的植物为材料，研究Ca2+在胁迫中的变化特性，或用膜片钳技术研究质膜钙通道的活性变化；利用大肠杆菌表达系统，研究磷脂（磷脂酸和其它磷脂 ）与蛋白激酶、磷酸酶、NADPH氧化酶的结合（离体试验）。研究PLD调节水稻低温胁迫的生理机制。继续克隆PSK5相关基因，筛选与PKS5相互作用的蛋白。 预期目标 第 三 年 1、初步阐明逆境下Ca2+, K+, H+-ATPase 等变化及其被的机制；发现2～3个受磷脂（或磷脂酶D）结合的靶分子；克隆得到2－3个相关的基因，获得与PKS5相互作用的蛋白。 2、获得转化转录因子基因的转基因植株，完成表型分析；筛选出3－4个与耐盐、耐冷相关的基因；初步阐明互作蛋白调节ABP9活性的机制，以及ABA和非生物逆境信号对这种机制的影响；阐明JERFs与哪些顺式作用元件结合；获得转激酶基因的转基因植株。 3、完成对1-2个水稻耐盐、耐低温胁迫相关QTL/基因的克隆；明确3-4个水稻2、利用应答盐、低温冷胁迫的转录因子抗逆重要新基因的耐盐功能；获得3-4个转化拟南芥和水稻，观察分析表型及逆水稻抗逆重要新基因（GUS融合载体和境相关基因的表达模式；分析ABP9互GFP融合载体）的转基因稻株；明确重要作蛋白的作用及机制，以及与ABA调QTL等位基因的互作机制；明确重要位点控的关系等；研究JERFs作用的顺式作QTL的复等位基因功能多样性；明确重要用元件，完成对JERFs启动子的克隆与QTL等位基因的生理功能及全基因组表功能分析；利用克隆的蛋白激酶新基因达谱；鉴定1-2个表达谱途径获得的候选转化拟南芥和水稻，进行表型观察和遗基因的功能；鉴定突变体筛选途径获得的传分析等。 1-2个基因的功能；定位一批新的耐盐和3、完成对5个拟南芥耐盐耐低温相关基低温的主效QTL。 因的功能分析；完成水稻耐盐、耐渗透胁 迫相关QTL/基因的转基因功能互补试4、获得6万个T-DNA插入突变体；完成验；完成对水稻新基因的耐盐功能鉴定；3万个T-DNA插入突变体侧翼序列分析；水稻抗逆新基因的GUS融合载体和GFP获得EMS诱变盐芥盐敏感突变体或自由融合载体转化水稻；研究P5C突变体对基敏感突变体；完成盐芥RNAi 一些激素的反应,对突变基因进行图位克knock-donw突变体Real-Time PCR表达隆；完成对不同位点重要QTL等位基因分析；获得1-2个泌盐基因的基因全的互作效应与互作机制分析；QTL等位基长cDNA；获得泌盐基因启动子序列并完因的分子与功能多样性分析；不同QTL成其元件分析。 组主要耐盐位点的QTL-NILs的生理功能 及全基因组表达分析；重要候选基因的转5、保证项目整体数据交换平台的运行；基因植株的耐盐和低温性状重复鉴定和完成对植物应答高盐、低温分子网络基因的功能分析。对1万个以上的水稻突模型的可视化，并首先在项目内部实现共变体材料进行筛选；构建作图群体，完成享；建立较完善的比较基因组学（包括比耐盐和低温遗传分析和QTL作图。 较功能基因组学）的系统方法；运用4、EMS 突变体的筛选、遗传与生理分析；Real-time PCR，建立50－100个低温、高大规模盐芥的转化与插入位点的分析；盐盐胁迫应答基因的表达差异及相应的分芥与拟南芥比较蛋白质组分析；泌盐基因子动力；揭示中国野生拟南芥基因组的核克隆与功能分析；野生稻等资源植物耐低 研究内容 温基因元件分析。 5、完善并保持生物信息学分析平台的运行，对整合的数据进行管理和挖掘；结合基因组学、功能基因组学和蛋白组学数据，初步建立植物应答高盐、低温分子网络；利用比较基因组学的方法，预测其它作物中抗逆相关基因并进行初步功能分析；不同居群拟南芥芯片数据的验证。 6、继续分离水稻或拟南芥高盐、低温等逆境胁迫诱导表达的基因及其根系、叶片、气孔等感受逆境胁迫的重要器官特定表达的基因及其启动子；利用细胞悬浮系快速鉴定诱导诱导型启动子的活性；利用转基因植株鉴定组织或细胞特异启动子的活性；多基因转化水稻等作物，鉴定抗性基因的协同效应。开始较大规模地利用新功能基因转化玉米、小麦、油菜等作物，并逐步开始对新功能基因的整合生物学效应进行分析。 第1、2、3、4课题继续开展对新基因功能的全面系统分析研究。具体包括： 1、PKS5的激酶活性结构域的体外研究；突变及野生PKS5转基因植物在逆境中的表型；CaM结合蛋白的遴选及其与抗逆的关系；利用原生质体表达系统，研究磷脂（磷脂酸和其它磷脂）与蛋白激酶、磷酸酶、NADPH氧化酶的结合（活体试验）。研究盐和低温处理下，植物细胞微管结构的变化；细胞骨架结合蛋白与各种逆境信号之间的关系；通过遗传学及生理生化分析对所克隆的基因的功能进行研究，寻找有利于提高作物耐盐性的基因，尝试转化水稻等农作物。 2、筛选目的转录因子基因和被的基因；分析互作蛋白和ABP9在玉米中所的基因表达网络；利用酵母双杂交系统筛选JERFs互作蛋白及其上游基因筛选；激酶转基因植株表型及其基因作分析，探讨其参与的信号途径。 3、重复验证8个拟南芥耐盐耐低温相关预期目标 苷酸变异率。第5课题开始发表有关“植物应答盐、低温胁迫的分子网络模型”的论文。 6、分离诱导型启动子2个；分离根组织、叶片组织和气孔细胞特异表达启动子3个；鉴定诱导型和组织细胞特异高活性启动子3个。开始获得部分耐盐、耐低温转基因作物株系。 7、发表SCI论文20-25篇，申请专利5-。 1、阐明PSK5，CaMBP（CaMK/CaMPP）等的活性与逆境的关系；阐明磷脂对靶分子调节的分子、生化机理，以及这种结合在植物耐盐中的生理作用与意义。 2、初步得到目的转录因子的基因及被的基因；了解互作蛋白和ABP9在玉米中所的基因表达网络；到候选互作基因和上游基因；初步确定得到的蛋白激酶所参与的信号传递途径。 3、阐明1-2个水稻耐盐、耐渗透胁迫相关QTL/基因的抗逆功能和作用机理；明确3-4个水稻抗逆重要新基因的组织和亚细胞功能；明确2-3个水稻抗逆重要新基因或耐盐、耐渗透胁迫相关QTL/基因的信号转导途径；克隆1-2个突变基因，初步明确脯氨酸积累的信号转导途径与其他盐应答的信号转导途径的相互作用；克第 四 年 研究内容 基因的生化功能，并对其参与信号或代谢网络的分子机制进行整合分析；利用这些基因对水稻、油菜等作物的转化；水稻耐盐、耐渗透胁迫相关QTL/基因的生物学功能研究。水稻抗逆新基因的组织和亚细胞定位分析。研究水稻抗逆新基因或耐盐、耐渗透胁迫相关QTL/基因的可能信号转导途径；进一步研究脯氨酸代谢途径参与植物耐盐、耐渗透胁迫的分子机理，对P5C合成酶基因上、下游元件及与其相互作用的蛋白因子进行鉴定分析；克隆重要耐盐QTL的候选基因；完成RNAi或候选基因敲除及功能互补试验；分析水稻高盐和低温胁迫的基因表达谱，对30个以上与高盐和和低温应答的未知功能基因进行表达验证，分离全长，构建载体等。对耐盐基因T040进行功能分析。 4、完成盐芥T-DNA 插入突变体库的构建；EMS 突变体的筛选、遗传与生理分析；大规模盐芥的转化与插入位点的分析；泌盐基因克隆与表达分析。 5、利用基因功能验证实验体系，结合计算机模拟，完善植物应答高盐、低温分子网络；将野生拟南芥居群和水稻的数据整合以补充并丰富此分子网络；与其它课题合作，设计实验以证实网络的正确性。 6、鉴定各类启动子中的关键元件，以关键元件序列为诱饵，利用酵母单杂交技术筛选与其作用的DNA结合蛋白；利用共转化技术，研究DNA结合蛋白与启动子的相互作用；多基因转化策略转化水稻等作物，鉴定抗性基因的协同效应。同时继续较大规模地利用新功能基因转化玉米、小麦、油菜等作物，并逐步开始对新功能基因的整合生物学效应进行分析。 预期目标 隆重要耐盐QTL基因1-3个；明确主要耐盐基因的功能；获得水稻高盐和低温胁迫的基因表达谱，分离到20个以上真实的高盐和低温应答的未知功能基因的全长并进行初步鉴定；获得新的耐盐或低温的种质资源；完成耐盐基因T040的功能分析。 4、获得8-10万个T-DNA插入突变体；完成6万个T-DNA插入突变体侧翼序列分析；获得EMS诱变盐芥盐敏感突变体或自由基敏感突变体 实现泌盐基因组织特异性表达。 5、在完善和补充植物应答高盐、低温分子网络模型的基础上，提出多个可供验证的候选基因；完成验证实验的设计，建立数据信息反馈机制；保证整个数据交换平台的更新和运行。进一步完善“植物应答盐、低温胁迫的分子网络模型”。 6、分离关键元件3-5个；分离DNA结合蛋白2-3个；初步阐明多个抗性基因转化植株的协同效应。获得耐盐、耐低温转基因作物株系。 7、发表SCI论文30-35篇，申请专利8-10项。 研究内容 第1、2、3、4课题进一步重复验证对新基因功能的分析研究，具体包括： 1、双杂交、BiFC, BiCORE，FRET等方法验证信号蛋白的相互作用， clone-based functional proteomics等方法建立逆境信号下蛋白质相互作用的信号网络；完善以受体激酶-钙-细胞骨架（RCC途径）为核心的植物细胞逆境信号转导的若干途径及其网络关系。继续研究对根毛微管结构重组、质膜结构（流动性）和组分的影响，揭示磷脂酶D在调节微管、质膜结构和耐盐（低温）中的作用及机制。 2、对所筛选、克隆的上、下游基因的转基因植株的分析，了解目的转录因子的途径；分析靶基因表达网络所调节的玉米耐逆生理反应；对得到的候选基因进行鉴定。通过乙烯突变体分析JERFs在乙烯信号途径中的作用及JERFs对乙烯和ABA诱导表达的功能基因的作用；4通过下游基因的转基因植株的表型及分子分析，验证目的蛋白激酶参与的信号传递途径。 3、深入研究拟南芥和水稻耐盐、耐低温基因或QTL的功能及参与植物应答高盐、低温胁迫的分子作用机制，筛选鉴定其中重要新基因的上游或下游互作因子；研究拟南芥和水稻对各种非生物胁迫（耐盐、抗旱、耐冷、高温）应答途径的交互作用机制； 4、T-DNA 插入突变体库的构建；EMS突变体的筛选、遗传与生理分析；泌盐基因功能分析。 5、在植物应答高盐、低温分子网络模型的基础上，通过算法调整、实验验证、文献数据挖掘等手段，详细分析其中关键节点的作用。在对利用基因表达谱获得的重要基因功能分析的基础上，综合课题1、2、3、4的研究结果，由第5课题全面系统地分析植物应答高盐、低温胁迫的分子网络机制，提出较完善的植物应答盐、低温胁迫的分子网络模型，与其预期目标 1、建立“R-C-C”网络中各个信号组分间相互作用的网络；揭示磷脂酶D在调节微管、质膜结构和耐盐（低温）中的作用及分子机制。 2、阐明目的转录因子的途径；阐明玉米中非生物逆境/ABA所诱导的活性氧（ROS）的ABP9信号传导途径的组成和所的基因表达网络；确认候选基因。阐明JERF1/3/4在提高植物抗逆性中的网络；步阐明新的蛋白激酶所参与的信号传递途径。 3、全面完成对30个以上与耐盐、耐低温性状相关的新基因的功能分析。完成8-9万个T-DNA插入突变体侧翼序列分析；克隆EMS诱变盐/自由基敏感突变体相关基因；完成盐芥氧化还原蛋白质组分析；获得具有泌盐功能的转基因株系。 4、提出较完善的“植物应答盐、低温胁迫的分子网络模型”，初步阐明拟南芥、水稻耐盐/耐低温性状表达的分子机理，明确少数重要基因的遗传网络与代谢网络的对应关系。初步阐明拟南芥、水稻对各种非生物胁迫响应的交叉机制。争取在基础理论方面获得2-3项较重要突破。 5、分离DNA结合蛋白2-3个；阐明多个抗性基因转化植株的协同效应机制与应用；获得具有显著耐盐、耐低温性状的转基因作物株系。 6、发表SCI论文35-40篇，申请专利8-10项。 全面完成预期的目标任务，完成项目总结验收。 第 五 年 研究内容 它课题分析总结，明确项目需进一步开展的研究工作。 6、鉴定各类启动子中的关键元件，以关键元件序列为诱饵，利用酵母单杂交技术筛选与其作用的DNA结合蛋白；利用共转化技术，研究DNA结合蛋白与启动子的相互作用；多基因转化策略转化水稻等作物，鉴定抗性基因的协同效应。同时对转基因作物进行全面的新功能基因的整合生物学效应分析。 预期目标