RNA干涉及其在棉花研究中的应用

专题介绍Review

RNA干涉及其在棉花研究中的应用

洪伟东李付广*

刘传亮

张朝军

武芝侠

张雪妍

中国农业科学院棉花研究所,农业部棉花遗传改良重点开放实验室,安阳,455000*通讯作者,Lifg@cricaas.com.cn

摘要RNA干涉(RNAinterference,RNAi)技术是一门新兴的基因阻断技术，可通过将外源双链RNA导

使靶基因表达沉默，是一种转录后的基因沉默现象。目前，RNA入细胞介导同源靶基因mRNA序列的降解，

干涉技术在植物研究中已经得到广泛应用。本文简介了植物的RNA干涉研究及RNAi表达载体的构建，综述了RNAi在棉花基因功能和功能基因组学研究、棉花品质性状的遗传改良和棉花的抗虫抗病研究中的应用进展及其在棉花研究中存在的主要问题和应用前景。

关键词

RNA干涉,棉花,病毒诱导的基因沉默,遗传改良

TheApplicationofRNAInterferenceinCottonResearch

HongWeidongLiFuguang*LiuChuanliangZhangChaojun

Anyang,455000

*Correspondingauthor,Lifg@cricaas.com.cnDOI:10.3969/gab.028.000601

WuZhixiaZhangXueyan

CottonResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofCottonGeneticImprovement,MinistryofAgriculture,

AbstractRNAinterferenceisanewgenesuppressiontechnology,mediatingdegradationofhomologousmRNA

bydouble-strandedRNAtosilencetargetgenes.Itisakindofpost-transcriptionalgenesilencing(PTGS).Atpre-sent,theRNAitechnologyiswidelyusedinplantresearch.ThisarticleintroducestheRNAiinplantandthecon-structionofRNAivectors,reviewstheapplicationofRNAiincottongenefunctionresearch,geneticimprovementandresistantresearch,andanalyzesitsproblemsandapplicationprospectsincottonresearch.Keywords

RNAinterference,Cotton,Virus-inducedgenesilencing,Geneticimprovment

良和棉花抗虫抗病研究等方面的应用进展，并展望

了RNAi在棉花研究中的应用前景。

RNA干涉是将双链RNA(doublestrainedRNA,dsRNA)导入细胞内引起特异靶基因mRNA降解的一种细胞反应过程，它是一种转录后的基因沉默(PTGS)现象。RNAi是一门新兴的特异基因下调表达技术，在1998年Fire等率先提出后就迅速成为研究热点。RNAi作为生物一种防御外源核酸入侵的机制，广泛存在于各类真核生物中(Hannon,2002)。凭借它的高效性和高度特异性，RNAi现已广泛应用于生物学研RNAi在植物领域已开展广泛的研究和应用，在棉花研究上也已得到应用。本文综述了RNAi在棉花基因功能及功能基因组学研究、棉花品质性状遗传改

www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.028.000601基金项目：本研究由国家863计划(2006AA100105)资助

1植物中的RNAi

RNAi现象最先是在植物中发现的。1990年Napoli等在研究矮牵牛色素基因时发现了他称为共抑制的转基因沉默现象。随着1998年RNAi的提出及其机理的不断阐明，植物中RNAi的研究和应用得

植物中进行RNAi研究，需要在细胞中产生小干扰RNA(shortinterferenceRNA,siRNA)来介导特异基因mRNA的降解。通常通过向细胞中导入

究中，为生物学研究提供了一个强有力的研究工具。到广泛的开展。

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dsRNA来产生siRNA，触发植物的RNAi。根据dsRNA来源的不同，植物中触发RNAi的主要技术可分成两类：转基因RNAi技术和病毒诱导的基因沉默技术(virus-inducedgenesilencing,VIGS)。

转基因RNAi技术是通过构建可转录为发卡RNA(hairpinRNA,hpRNA)的植物表达载体转化植物来产生RANi，因此构建高效的RNAi表达载体是在启动子下游利用转基因RNAi的关键。研究表明：

插入反向重复片段的重组双元载体，是产生RNAi的基本结构。而内含子的有无、启动子的强弱和目的片段的大小等因素会影响RNAi的效率(Wesleyetal.,2001)。用含内含子的发夹RNA(intron-containinghairpinRNA,ihpRNA)结构表达dsRNA的植物中，超过90%的植株都能表现出沉默效应，而且转录有拼接功能的间隔内含子比无功能性的间隔序列在介导基因沉默上更为有效(Smithetal.,2000)。构建RNAi植物表达载体时，选择50~950bp大小的片段都能成功

员同时进行沉默，因此RNAi技术是研究基因家族功能的理想工具(Kusaba,2004)。目前RNAi技术已经广泛地应用于基因功能的反向遗传学研究，利用RNAi技术对拟南芥、烟草、番茄、水稻、玉米、棉花和小麦等植物已进行了大量的基因功能分析和功能基因组学研究。

棉花的主要栽培品种陆地棉为异源四倍体，基因组比较复杂，采用传统基因敲除技术来产生功能特异性缺失突变体效率低下。由于RNAi的高效性、以及在对基因家族和多倍体研究上的优越性使得RNAi在棉花基因分析上的具有广阔的应用前景。目前已经开始应用RNAi对棉花基因的功能进行分析Li等(2005)利用转基因RNAi技术研究细胞骨验证。

架肌动蛋白在棉花纤维发育中的作用。通过对在棉花中克隆得到的GhACT1基因的RNA干涉，结果在得到的阳性转化植株中，该基因mRNA和蛋白质水平显著降低，并且纤维中肌动蛋白细胞骨架网络

地诱导目的基因沉默(HelliwellandWaterhouse,2003)，被破坏，观察不到纤维中的可辨认的肌动蛋白网但是发现较短的片段沉默效率较低，较长的发夹结构络，随之棉花纤维的伸长也被抑制，从反向证明了在寄主细菌中容易发生重组，采用300~600bp大小的片段更容易获得比较有效的基因沉默，而不管目的编码区还是在3'UTR中，沉默片段在基因的5'UTR、

目的基因时都会取得一样的效果。

VIGS在植物中的应用方法是将靶基因的部分序列克隆到病毒载体后侵染植株，病毒在植物体内传播复制产生dsRNA后引发植物的RNAi。受侵染的寄主植物不仅对病毒产生抑制作用，也可抑制与插入片段同源的内源基因的表达，使寄主植物表现出目标基因缺失表型。研究表明目的克隆的插入片段在300~500bp时沉默效果较好。相对于转基因RNAi技术，瞬时VIGS具有研究周期短、不需要遗传转化等优点，此技术正在发展成为一种简单、快速、有效、高通量的分析基因功能的方法(王宏芝等,2005)。但是VIGS引起的表型变化是瞬时的，不可遗传，不适合用于植物的遗传改良。

GhACT1基因并非是在纤维起始期而是在纤维伸长

期扮演重要作用。

VIGS最早应用于烟草的基因功能分析。目前已经开发了许多VIGS载体，在拟南芥、番茄、大豆、大麦和小麦等植物中广泛应用(Robertson,2004)。由于VIGS研究周期短、不需要遗传转化，相对于转基因RNAi能更方便的应用于基因功能分析。在棉花中也Tuttle等(2008)用棉花皱已开展了VIGS的应用研究。

叶病毒(CLCrV)开发了一个可用于棉花的VIGS载体，并用它介导了对棉花内源基因镁离子熬合酶亚基Ⅰ基因和八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的沉默，在病取得了良毒接种2~3周就可以看到相应的沉默表型，好的沉默效果。该载体也可以用于棉花其他基因的功能分析，为VIGS在棉花中的应用打开了通路。

目前，在棉花中应用RNAi验证基因功能的报道还很少，主要原因是棉花中的RNAi转基因验证周期长，支出大，转化效率低，棉花组织培养技术还不够成熟。VIGS进行基因功能分析，无需进行遗传转化，也更加经济高效，但VIGS在棉花中的研究也才刚刚起步，还有待进一步开发适用于棉花的病毒载体，进一步优化其技术体系，才能有效的应用VIGS进行新基因功能分析。

随着后基因组时代的到来，植物功能基因组学已成为生物学研究的热点。高通量测序技术的成熟

2RNAi在棉花中的应用

2.1RNAi在棉花基因功能分析中的应用

RNAi技术相对于传统的基因功能研究技术如

反义RNA技术、插入突变技术等具有高效性、高特

稳定性等优点，是研究植物基因功能的强有力异性、工具。RNAi技术还能够通过选择不同的作用位点分别或同时作用于同一基因家族，对整个基因家族成

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使得植物核酸序列信息与日俱增。目前在NCBI的GenBank数据库中，棉花的EST序列超过了5×105条。面对如此海量的未知序列，大规模功能基因组学的研究势在必行。RNAi为大规模功能基因组学的研究找到了方法。采用Gateway克隆技术开发了高通

特异基因达到或接近完全失活，可使植物不良性状的相关基因表达下调或不表达，从而达到改良植物性状的目的。RNAi通过抑制植物本身具有的某些不良性状相关基因的表达，达到对植物进行遗传改良的而且，对目的，是对基因工程育种技术的扩展和补充。

量的RNAi载体，使大规模基因功能分析成为可能。内源基因的抑制可与转入外源基因的表达同步进行，应用高通量的RNAi技术已经在拟南芥、玉米以便更好地进行转基因遗传改良。RNAi在植物的遗(McGinnisetal.,2007)中进行大规模基因功能的分析(Matthew,2004)。

由于VIGS无需遗传转化，简便快捷，对于大规模在番茄中已可用VIGS功能基因组学的研究应用更广。

进行大规模功能基因组学的研究。但是VIGS载体大都

传改良中已得到了广泛的应用(Mansooretal.,2006)。由表1可以看出，RNAi遗传改良已应用到多种植物上，用来提高植物的有益成分，降低植物的有害物质，进行工业应用等。而改良的基因大都与代谢途径相关(TangandGalili,2004)，如淀粉合成途径、乙烯

花色等，这些基因网络明确，有宿主，棉花上高通量的VIGS研究尚未见报道。的合成途径、

VIGS在大规模功能基因组学的研究中具有巨大的潜方便进行有目的的改良。力，在棉花中发展高通量VIGS技术意义重大。

随着棉花基因组测序的开展和大量棉纤维发育相关基因、抗病基因、耐旱基因等优质基因的克隆和研究，RNAi技术必将在棉花基因功能研究和棉花功能基因组学中得到更大的应用。2.2RNAi在棉花品质遗传改良中的应用

RNAi作为高效的基因阻断工具，能够使相应的

表1近期植物中应用RNAi进行遗传改良的例子

Table1ExamplesofgeneticsimprovementusingRNAiinplantsrecently性状特征Trait

增加砷的吸收Increasedarsenicuptake降低棉籽酚含量Reducetoxicgossypol减少烟草降烟碱生成Reducednornicotinecontent产生红花Produceredflower减少直链淀粉含量Reduceamylosecontent除去花生过敏原Eliminateallergen除去Patatins的污染Lesscontaminationofpatatins减少催泪刺激物Reducetearstimulator提高青蒿素含量Increaseartemisinin

SQSLFSPatatinArah2GBSSIFLS,F3'H,DFRCYP82E4CDNS靶基因TargetgeneACR2

植物Hostplant拟南芥Arabidopsis棉花Cotton烟草Tobacco烟草Tabacco红薯Sweatpotato花生Peanut马铃薯Potato洋葱Onion黄花蒿Artemisiaannua

潜在效益Potentialbenefit土壤修复

Phytoremediationofsoils有利食用

Beneficialforconsumption有利健康Healthy花色改良

Improveflowercolor工业应用

Industrialapplication降低花生过敏性Reducepeanutallergy生物反应器Bioreactors利于食用

Convenientforconsumption制药Fordrug

Zhangetal.,2009Eadyetal.,2008Kimetal.,2008Dodoetal.,2008Otanietal.,2007Nakatsukaetal.,2007Gavilanoetal.,2006Sunilkumaretal.,2006文献References

Dhankheretal.,2006

在棉花中，Liu等(2002)和Sunilkumar等(2006)率先采用RNAi技术成功对棉花进行遗传改良。棉籽中含有大量的棉籽油，是世界上重要的植物油来源。普通棉籽油含26%的棕榈酸、15%油酸及58%亚油酸，其中饱和脂肪酸含量相对较高，不利于降低胆固醇，增加了人体心血管疾病的发病几率，因此Liu等(2002)利用RNAi技术对棉籽油成份进行了改良。他们构建了种子特异启动子驱动的，分别以脂肪酸

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去饱和酶关键基因Δ9－去饱和酶编码基因ghSAD1和ω6－去饱和酶编码基因ghFAD2－1这两个基因为目标的hpRNA载体并转化棉花，使这两个基因在棉籽中的表达受到抑制。结果将棉籽油中硬脂酸含量从2%~3%提高到40%，油酸从15%提高到77%，并分别得到了硬脂酸和油酸含量较高的转化植株。通过将这两种转化植株进行杂交，获得了同时含高硬脂酸和高油酸的棉花植株。改造后的棉籽油不仅食用更健康，而且可用于制作人造黄油、糖果生产，具有更大的利用价值。

棉花含有棉酚等有毒的次生物，这可以增加棉花对害虫和病原体的抗性，但也影响了棉籽中蕴含的大量棉籽油和棉籽蛋白的食用性。Sunilkumar等(2006)采用RNAi技术对棉籽进行遗传改良，使棉籽酚的水平降低，达到国际安全食用标准的要求。通过构建棉籽特异性启动子驱动的发卡结构的干涉载体，对棉酚生物合成关键酶δ－杜松烯合酶基因表达进行RNA干涉，抑制棉酚在棉籽中的合成，而其他器官如叶片、花的棉酚含量变化不大，不影响棉花的抗虫抗病性。改良后的棉籽利用价值大大提升了，提高了人们对现有资源的利用水平。

目前，棉花的遗传改良研究才刚起步，在棉花中可以进行许多遗传改良研究工作。棉花的花大而美丽，具有开发作为观赏花卉的潜力。我们可以应用RNAi对棉花的花色、花被轮次等进行遗传改良，开发观赏棉花新品种。天然彩色棉由于不用再进行染色，具有很大的市场前景，但其纤维品质差，产量低。如果能够应用RNAi对棉花色素相关基因进行有效的，彩色棉的培育进程将大大加快。也可对棉花其他代谢途径相关基因进行，如一些影响棉花品质的反馈抑制途径，棉花本身产生的一些不良品质性状等，都可以应用RNAi进行改良。当然，这一切都只能建立在对棉花相关的组织代谢网络和时空等分子机理有深入研究的基础上。

随着棉花功能基因的不断开发和棉花遗传转化技术的不断进步，RNAi在棉花的遗传改良中将起到越来越大的作用。目前，棉花纤维品质和棉花抗逆的分子机理的研究都在积极的开展，RNAi除了可以验证相关基因的功能，还可以在对棉花的进行遗传改良，如提高棉花纤维品质，增强棉花耐旱性等方面发挥重要作用。

2.3RNAi在植物抗虫、抗病研究中的应用

植物病毒病是重要的植物病害。RNAi是生物抵

御病毒入侵、维持自身基因稳定的一种自我保护机制(Waterhouseetal.,2004)，应用RNAi技术可以实现对病毒的有效防治。把源自病毒的基因构建成反向重复结构转入植物体内，其转录后产生的dsRNA会将入侵病毒的同源序列降解，使转基因植株获得Waterhouse和Helliwell(2002)首次报对病毒的抗性。

道RNAi技术在防治马铃薯Y病毒(PVY)抗病的应用，利用PVY蛋白酶基因片段构建载体进行烟草转化，使植株完全免疫。RNAi现已广泛应用于植物抗病毒的研究，在水稻、小麦、烟草、番茄等作物的抗病毒研究中均取得重要研究进展(Tenlladoetal.,2004)。

棉花病虫害是棉花生产大敌，每年可造成棉花印度等热带大量减产。棉花曲叶病毒在巴基斯坦、

地区经常肆虐，造成大量的棉花减产和经济损失。Asad等(2003)通过构建含棉花曲叶病毒DNA的载体转化烟草，表达病毒正义和反义的RNAs，结果25%的转基因烟草显示稳定的病毒抗性。对抗病毒说转基因烟草进一步研究发现了dsRNA和siRNA，明了转录后基因沉默是最有可能引起抗病毒的机制。这为以后在棉花上应用RNAi进行抗棉花曲叶病毒研究指明了方向，也为其他抗病毒研究工作提供了有益的参考。

目前还没有利用RNAi在棉花上成功实现抗病毒的报道。尽管RNAi抗病毒研究中还存在一些问病毒蛋白对RNAi的抑题，如抗病毒的遗传稳定性、制以及对各种病毒的相关基因的研究不够等，但随着对这些问题的研究和解决，RNAi必将成为遗传育种工作者培育抗病毒植物的有力手段。

除了抗病毒，在植物抗细菌病、真菌病、线虫和虫害等方面，RNAi也都取得了重要进展。棉花的虫害较多，严重影响了棉花生产，而棉铃虫是棉花的主Mao等(2007)发展了利用RNAi抗棉铃要虫害之一。

虫的新技术。他们从棉铃虫中克隆了一个细胞色素P450基因(CYP6AE14)，它能够让棉铃虫耐受棉花代谢物棉酚。当幼虫饲喂带有表达针对CYP6AE14基因的dsRNA的植物材料时，棉铃虫中CYP6AE14基因的mRNA水平降低，幼虫生长迟缓，在存在棉酚时受到极显著的抑制。对昆虫饲以含有表达dsRNA的植物材料可以作为一个普遍策略来触发昆虫体内RNAi，抑制昆虫生长。该方法对于昆虫学研究和农田害虫控制提供了一个全新的思路。利用这种棉花抗虫新方法进行深入研究可进一步控制棉铃虫、棉蚜和棉蝽蟓等棉花害虫。

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3结语

RNAi具有的许多优点，如高度的特异性、高效性和可传递性以及在植物体内能以孟德尔方式遗但传，使得RNAi技术在植物学领域得到广泛应用。在棉花中应用RNAi的研究报道较少，这主要是由于以下原因造成的：首先，由于棉花的组织培养周期较长，转化效率低，费时费力，技术还远不如在拟对于目前主要靠遗南芥和水稻等其他植物上成熟。

传转化的RNAi，转化技术是RNAi在棉花中深入应用的瓶颈。提高棉花的组织培养水平或者找到其它更快的转化方法，是应用RNAi的关键。第二，棉花的遗传背景不清晰，生长发育等诸多生化途径还没有得到有效的研究，相关功能基因也还有待RNAi的应用显然就不会太多。棉花时空特异发掘，

表达或诱导型启动子在RNAi研究中已有所应用(Sunilkumaretal.,2006)，但还太少，还应该发掘更多的棉花特异启动子，以方便对棉花有选择的遗传改第三，RNAi技术本身也存在一些缺陷。有些表达良。

水平低的基因的RNAi现象不明显；而对同源性较高的基因，干涉会同时作用这些基因，沉默表型难以不稳定性、RNAi结果的鉴鉴定。还有RNAi的脱靶、

都还有待定以及RNAi的抑制等问题(Small,2007)，进一步深入研究。相信随着棉花研究的深入和RNAi技术的不断完善，RNAi必将得到在更广泛的应用，也将在不断的应用中得到充分的发展。

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