总RNA提取方法的比较与分析

来源：九壹网

　第25卷2009年12月武　夷　科　学WUYISCIENCEJOURNALVol.25　Dec.2009

文章编号:1001242762(2009)0120097204

总RNA提取方法的比较与分析

林玲,杨燕凌,何海福,汪世华

(福建农林大学生命科学学院,福建福州350002)

摘要:　用TRIZOL法、CTAB法和改良的热硼酸盐法从水稻叶片中提取总RNA,结果表明用这三种方法提取总RNA的OD260nm/OD280nm值分别为1.6、1.992和1.657。琼脂糖电泳表明,用改良的热硼酸盐法提取的RNA降解严重,用TRIZOL法提取的总RNA有部分降解,而CTAB法提取的总RNA完整、未降解,可用于后续实验。因此CTAB法更适于从水稻叶片中提取总RNA。关键词:　总RNA;提取;CTAB法中图分类号:　Q522　　文献标识码:　A

总RNA提取是分子生物学研究的基础实验之一,在进行Northern杂交分析、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增、等研究时均需要高质量的RNA将以不同方式干扰RNA的提取LiCl-尿素法

[9]

[2]

[1-12]

。植物组织总RNA的提取较动

物和微生物困难,原因是植物具有坚硬的细胞壁,富含多种次生代谢物,细胞破碎后,这些物质

。另外,细胞内的RNase以及操作体系中的RNase均会对分

[7]

离组分中的mRNA进行降解。常见的的总RNA提取方法有苯酚法

、改良的Gomez法

[13]

[10]

、阴离子去污剂法

[8]

、

、异硫氢酸胍法

[3]

、CTAB法、热硼酸法及改良热硼酸

[4]

法

[5]

、TRIZOL试剂快速提取法。本研究比较了TRIZOL试剂快速提取法、CTAB法和改良

热硼酸法,以其找到快速并能得到高质量的总RNA提取方法,为后继实验奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料

水稻叶片采自福建农林大学田间实验室,立即用液氮冻存于-70℃。焦碳酸二乙醋(DEPC)、TRIZOL试剂购自宝生物工程有限公司。其它为国产分析纯试剂。所有玻璃器皿于0.1%DEPC水中浸泡过夜,于200℃干烤6h;所有塑料离心管灭菌后,于0.1%DEPC水中浸

泡过夜,然后1.034×10Pa灭菌30min,以去除残存的DEPC,取出后尽快烘干,一次性头用前经1.034×10Pa灭菌30min,电泳槽用前用3%双氧水浸泡2h,然后用0.1%DEPC水冲洗晾干;比色皿用甲醇/浓盐酸(1:1)混合液浸泡1h。1.2　实验方法

TRIZOL试剂快速提取法

[13]

:50mg水稻幼叶研磨后加入1mLRNAiso和Reagent后匀浆,

收稿日期:2009-03-10

基金项目:3福建省自然科学基金项目(2007J0243,X0750005)、福建省教育厅科技计划项目(JA07059)。作者简介:林玲,女,1982(-),助教,研究方向:微生物学与分子生物学方面的教学与科研工作。3通讯作者:E-mail:wshyyl@sina.com。

98　武夷科学第24卷

室温静置5min;加入200μL氯仿振荡混匀,室温静置5min;12000g、4℃离心10min后将上清液转移至新的离心管,加入与上清液,等体积的异丙醇,室温静置10min;12000g、4℃离心10min后向沉淀中加入75%乙醇1mL清洗沉淀;12000g、4℃离心5min,弃上清保留沉淀并

[4][5]

干燥;沉淀溶解于30μLDEPC处理过的水中。CTAB法和改良热硼酸法参照文献进行。

cDNA的合成:RNA样品4μL,Oligo-d(T)181μL,ddH2O5μL;95℃变性10min,-20℃放置5min防止复性。继续加入RNA酶(Rnase)抑制剂1μL,5×TaqPCRBuffer5μL,ddH2O7μL,dNTP1μL,反转录酶(AMV)1μL,加水至总体积25μL,48℃放置1h。

RT-PCR引物:根据水稻中Actin序列,用软件Primer5.0设计引物。设计的引物由华大基因公司合成。引物序列如下:P1:5’-CGTCTGCGATAATGGAACTGGTA-3’,P2:5’-AACTTT2GTCCACGCTAATCAAGAA-3’

PCR反应体系:5×PCRBuffer4μL,dNTP0.5μL,上下游引物各1μL,反转录产物cD2NA2μL,Taq酶0.5μL,加水至总体积25μL。PCR循环条件为:94℃5min,1个循环;94℃45s,55℃45s,72℃1min,30个循环;最后72℃延伸7min。-20℃保存备用。

2　结果与分析2.1　水稻总RNA电泳图象结果

三种不同方法提取水稻总RNA,将提取的RNA溶解于20μLDEPC-SDW,取5μL进行凝胶电泳,电泳结果如图1。从图1分析可以得出,用三种不同方法提取RNA,在凝胶上都可得到28S和18S两条带。相对来说,改良热硼酸法所得的RNA降解比较明显(图1c),而TRIZOL试剂法能清晰的看到28S和18S两条带,效果较好(图1a);而CTAB法所获得的RNA带型更为清晰,条带完整,降解较少(图1b),特别CTAB法提取的RNA亮度高,条带清晰,且28S条带的亮度约为18S条带亮度的两倍,说明CTAB法提取水稻叶片组织RNA可以获得满意的结果。

图1　不同方法提取RNA带型比较。a:TRIZOL试剂法;b:CTAB法;c:改良热硼酸法

2.2　RNA紫外分光分析

用1μLRNA样品,加DEPC处理水100μL,置于石英比色杯中,用紫外分光光度计测定

260nm与280nm处吸收峰的OD值。上述三种方法提取得到的总RNA的紫外吸收值、含量

第24卷林玲:总RNA提取方法的比较与分析99

的比较见表1。通过对三种RNA提取方法的比较(参见表1),改良热硼酸法时间长,得率低,,OD260/OD280不理想,不适合提取水稻叶子RNA;TRIZOL试剂法相对快速,纯度和含量一般;而CTAB法虽用时长,但所获得的RNA含量最高、OD260/OD280接近2.0,纯度高,RNA提取结果比较理想。

表1　水稻叶片提取的纯度及产量比较

RNA提取方法RIZOL试剂法CTAB法

材料(g)

0.10.30.1

时间(h)

42436

OD260/OD280

1.61.9921.657

RNA含量(μg)

60.4244.844.6产率(μg/g)

6048146改良热硼酸法

2.3　RNA提取方法比较

RNA提取时,就变性剂的选择来说,CTAB(CTAB法)比异硫氰酸胍(RIZOL试剂法)和

SDS(改良热硼酸法)更有效;就CTAB法来说,由于以CTAB为变性剂,同时加入PVP和β-

巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制RNase的活性,使用无水乙醇或异丙醇沉淀杂蛋白和总核酸等,然后再选择性地分离出RNA。所以CTAB法是一种很好得总RNA得提取方法。2.4　RT-PCR琼脂糖凝胶电泳结果分析

为进一步验证以上方法提取的为水稻总RNA并且检测其完整性,以效果较好的两种总RNA(CTAB法和TRIZOL法)为模板进行反转录PCR扩增。电泳结果(图2)所示,用CTAB法(泳道2)和TRIZOL试剂法(泳道3)获得RNA的PCR结果都好,且泳道2的条带较亮。这表明上述的两种方法所提的总RNA中,CTAB法所提的总RNA含量较高。

图2　RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图谱

3　讨论

3.1　RNA酶变性剂的选择

本实验中Trizol法使用的RNA酶抑制剂是异硫氰酸胍盐,是一种非常强的蛋白质变性剂,和β-巯基乙醇一起使用能有效地抑制RNA酶的活性。改良热硼酸法所使用的变性剂是SDS,它能破细胞,使核蛋白体解聚,对RNA酶和DNA酶有一定的抑制作用。CTAB法所使用

100　武夷科学第24卷

的变性剂是CTAB,较高浓度的CTAB不仅能对植物细胞有较好的裂解作用,而且还能有效地分离核蛋白与核酸的复合物,同时和巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制RNase的活性。3.2　RNA提取过程中多酚和多糖的影响

水稻叶中含有酚类物质,酚类能与大分子形成氢键,当其氧化成醌时能与大分子形成共价键,更容易与RNA结合,从而使RNA的提取更加困难。因此抑制酚类物质氧化就成为RNA

[12]

提取中的一个重要问题。本实验CTAB法使用CTAB等物质,有效去除了多糖、酚类等物质的干扰,获得高质量的RNA。

参　考　文　献

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COMPARISONANDANALYSISOFEXTRACTION

METHODSOFTOTALRNA

YANGYan2ling,HEHai2fu,SHAli,WANGShi2hua

(CollegeofLifeScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,FuzhouFujian350002,China)

Abstract:　TotalRNAfromriceleaveswasextractedbyTRIZOL,CTABandimprovedhot-boratemethods.TheresultsshowedthattheD260nm/D280nmvaluesoftotalRNAbythesemethodswere1.886,1.992and1.657respectively.Aftergeloseelectrophoresis,theRNAextractedbyimprovedhot-boratemethodwasdestroyedheavily,andtheRNAextractedbyTRIZOLmethodwasbetter.TheRNAextractedbyCTABwasverygood,whichmeanttheextractedRNAwasintegratedenoughtobeusedinthefollowingexperiments.ThemethodofCTABismoresuitabletoextracttotalRNAfromthericeleaves.

Keywords:　totalRNA;CTABmethod;extraction

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