酶活力定义：
酶促反应在单位时间内释放出1μmol产物所需要的酶量，定义为1U (Unit)。 延伸理解：
对给定酶促反应，在单位时间内释放出n μmol底物，那么该反应体系中的酶活力即为n U。
注释：U为酶活力单位，并非酶活力指代符号，1U=1μmol/s
酶活力的测定：
根据定义，测定某种酶对某种底物的酶活，只需要测定反应时间t，以及经过t时间后，体系内产物的物质的量变化量△n，该体系内的酶活力即为△n/t。 反应时间t：可以直接根据计时器得出 产物生成量△n：主要需要解决的测定指标 推论：
测定酶活力的核心目标为测定单位时间内产物的生成量
以下主要讨论用比色法进行产物生成量△n的测定： 1、 直接比色法：
适用范围：产物/底物具有发色基团，可在特定波长的光照下产生吸收，
且其摩尔吸光系数可查得
发色基团举例：芳环类基团如苯基、硝基苯基、苯酚基、萘基等 常用发色基底物：邻(o)/间(m)/对(p)硝基苯基(NP)修饰的酯/苷类物质 核心计算公式：Lambert-Beer定律——
△A：溶液吸光度变化量，无单位
ε ：发色物质的摩尔吸光系数，单位L/(mol·cm)
b ：光程，即光线穿过溶液的距离，通常为比色杯透光面
宽度，单位cm
△c ：发色物质在溶液中的浓度变化量，单位mol/L 该公式可将发色物质的浓度与溶液吸光度建立联系，即：
因此产物/底物变化量 ，
故：
2、 间接比色法：
适用范围：产物/底物不具有发色基团，需要与另一显色剂发生反应才可
被检测，显色后的摩尔吸光系数可查得
反应举例：葡萄糖氧化酶-苯酚与葡萄糖反应生成红色的苯醌，用于定糖 DNS试剂与还原糖加热反应生成褐色复合物，用于定还原糖
核心计算公式：Lambert-Beer定律——
计算时需明确显色反应中，显色产物与酶促产物的摩尔比r
3、
外标比色法：
适用范围：有已知浓度( 标)的产物/底物标准品，自身或显色产物可在特定波长下产生吸收，且摩尔吸光系数未知
核心计算公式：Lambert-Beer 定律——
先测定标准品的吸光度A标，再测定反应体系吸光度变化量△A，于是，
故：
4、
标准曲线比色法：
适用范围：有产物/底物纯品，自身或显色产物可在特定波长下产生吸收
摩尔吸光系数未知
核心计算公式：Lambert-Beer 定律——
将纯品配置成梯度浓度的一系列溶液，直接测定吸光度或经显色反应后测定吸光度，绘制溶液浓度—吸光度标准曲线(线性相关系数R2>0.99)，之后测定酶促体系吸光度或显色后测吸光度，通关标准曲线方程即可得出产物浓度变化量△c。 内标色谱法：
适用范围：产物/底物无明显特征吸收，但可用液相/气相色谱分离，且有
色谱级标准品
测定时将确定量的标准品加入样品中进行液相检测分离，物质的浓度与其色谱峰面积成正比，通过计算产物峰面积与内标峰面积比，即可求得产物量
5、
酶活力测定注意事项：
使用恒温体系作为酶促反应的发生体系，例如使用恒温光度计测定酶促反应吸光度变化；
体系组成：缓冲体系+酶+底物（顺序固定，先加入酶令其充分适应环境温度，再加入底物反应）
比活力计算公式：
其中，△c为产物浓度变化量，单位μmol/mL； t为反应时间，单位min
V反 为酶促反应测活体系的体积，单位mL VE为加入反应体系的酶溶液的体积，单位mL cE为反应体系中实际的酶浓度，单位mg/mL
D 为稀释倍数，酶促反应体系未经稀释直接测定时，D=1 光度法比活力计算公式：
各项解释： 活度：，为直接从动力学表征软件上读出的数据，表示吸光度的平均变化率 反应速率：，酶活力：，
亦可变形
为，即产物浓度的平均变化率
单位为U，即反应体系中所加入酶的实际活力
体积比活力：，单位为U/mL，表示所加入的酶溶液单位体积含有的活力
质量比活力：即上式，表示每毫克酶蛋白所含有的活力。
光度法酶促反应动力学测定： 核心方法——双倒数作图法
涉及参数：反应速率v，底物浓度[S] 反应速率v即上述形式，单位μmol/(mL·min)；底物浓度[S]单位为mmol/L 取对作散点图，当趋势线方程y=ax+b中，b>0，a<0时有意义 其中，即常规米氏方程：
Vmax为最大反应速率，表示酶被底物饱和时的催化反应速率； Km为米氏常数，表示酶与底物的亲和程度 其中，Vmax=kcat·[E]，kcat为催化系数，又称转化数，表示单位时间内1分子酶可以催化反应的底物分子数；[E]为反应体系中的实际酶浓度，单位mol/L。 有，Mr(E)为酶分子的相对分子质量，单位g/mol。
酶的常规性质表征：
主要表征参数：最适反应温度、最适反应pH、底物偏好（底物谱）、金属离子依赖性、热稳定性、pH稳定性、有机溶剂耐受性 常用方法：正交试验法
金属离子依赖性判别方法：加入EDTA后若酶完全失活，则为离子依赖；活性受到影响，但未完全失活，则为非离子依赖性。 稳定性表征参数：半衰期t1/2。
不考虑热激活效应，酶的热失活基本符合一级反应动力学
测定初始时酶促反应体系的吸光度A0，以及经过不同孵育时间处理后的酶在相同反应体系与条件下的产物吸光度At，以ln(At/A0)对孵育时间t做图，趋势线斜率为-k，当线性相关系数R2≥0.99时，则t1/2=ln2/k。
热激活发生时，热失活应从热激活效应达到峰值时开始计算，加上激活至峰值所需的时间即为实际半衰期 复杂反应的酶促动力学： 1、双底物反应机制的判断：
对酶促反应涉及双底物A、B时，可以通过固定其中一个的浓度为几个不同的值，分别在每个值下测定并绘制酶对另一个底物的动力学双倒数图像。 当A的浓度分别取[A]、2[A]、3[A]时，酶对底物B的动力学双倒数图像为一组平行直线时，则该酶促反应为乒乓机制；
当A的浓度分别取[A]、2[A]、3[A]时，酶对底物B的动力学双倒数图像为一组相交于一点的直线时，则该酶促反应为序列机制。 2、抑制剂与可逆抑制动力学： 1) 竞争性抑制的双倒数方程：
特点：抑制剂浓度[I]增大时，图像均相交于纵轴，即Vmax不变，Km增大 2）非竞争性抑制的双倒数方程：
特点：[I]增大时，图像均相交于横轴，即Vmax变小，Km不变 3）反竞争性抑制的双倒数方程：
特点：[I]增大时，图像为一组平行直线，即Vmax与Km均变小
抑制常数Ki：在不同的[S]下用 对[I]作图，图像交点的横坐标绝对值即Ki
