一种适宜棉花microRNA实时定量分析的总RNA提取方法

一种适宜棉花microRNA实时定量分析的

总RNA提取方法

余道乾袁WANGGaskin袁杜雄明*(中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室袁河南安阳455000)

摘要院为满足棉花组织microRNA结构与功能研究的需要袁建立了棉花高质量的总RNA提取方法遥以陆地棉纤维和胚珠为供试材料袁采用改良的异硫氰酸胍-硫氰酸铵-酸酚法提取总RNA袁利用stem-loopRT-qPCR法鉴定成熟的miRNA遥结果表明此方法能得到高质量的总RNA袁并且miRNA的回收率较高袁足以满足mi-croRNA水平的实时定量分析遥

关键词院棉花曰总RNA曰提取曰microRNA曰实时定量中图分类号院S562.035.3:Q812

文献标志码院A

文章编号院1002-7807(2013)05-0467-04

YUDao-qian,WANGGaskin,DUXiong-ming*

渊

455000,

冤

AmethodforisolationoftotalRNAspeciesispresented.Themodifiedguanidiniumisothiocyanate-ammoniumthio-cyanate-acidphenolmethodwasusedtoextracttotalRNAfromfiberandovuleofcotton(

L.).The

stem-loopReal-timePCRmethodwasselectedtoidentifymaturemiRNA.ExperimentsvalidatedthatthemethodweusedwassuitableforquantitativeanalysisofmiRNAbecauseofthehighqualityoftotalRNAandhighrecyclingefficiencyofmiRNA.

cotton;totalRNA;extraction;microRNA;real-timePCR

棉花基础研究主要集中于DNA尧mRNA水平袁较少涉及microRNA(miRNA)等小RNA水平遥近年在其他植物中的研究发现袁miRNA几乎参与了全部组织器官的发育过程[1-2]遥MiRNA研究所面临的首要问题是如何高效地提取和纯化遥目前有多种RNA提取方法和商品化的试剂盒可供选择袁但真正适用于棉花胚珠尧纤维这类多糖组织的却少见遥LiCl法因沉淀DNA尧蛋白和多糖的能力强而被广泛选用

[3]

miRNA的实时定量研究遥

材料和方法

实验材料陆地棉(

L.)遗传标准系

TM-1由本实验室保存曰实验相关玻璃器皿于180益干热处理至少3h曰塑料容器尧耗材及配制药品的ddH2O均用终浓度为0.1%的DEPC处理过夜曰引物由英潍捷基公司合成曰化学纯试剂均购自BBI公司遥

溶液的配制

RNA抽提液是由终浓度为4%(W/V)的PVP-40袁2mol窑L-1异硫氰酸胍袁0.4mol窑L-1硫氰酸铵袁38%渊V/V冤酸酚袁0.1mol窑L-1醋酸钠(pH=5.0)袁

RNA的效率不高曰试剂盒成本较高且提取的棉花总RNA袁特别是miRNA产量极低遥本文在异酸性酚-硫氰酸胍-氯仿方法的基础上加以改良袁提出一套完整可行的棉花多糖组织总RNA高效提取的经济简便的方法袁提取的RNA足以开展

收稿日期院2013-05-17

袁但其沉淀小分子量

作者简介院余道乾渊1984-冤袁男袁硕士研究生曰*通讯作者袁duxm@cricaas.com.cn基金项目院国家973项目渊2004CB117306冤

468棉花学报25卷

5%(V/V)甘油组成袁4益密闭保存袁2个月内使用曰RNA沉淀液由终浓度为1.2mol窑L-1NaCl袁0.8mol窑L-1柠檬酸钠组成袁用柠檬酸调节pH值为7.0袁配置时确保无RNAase污染袁常温密闭保存遥

提取步骤

胚珠组织于液氮预冷的研钵中袁迅速研磨直至彻底粉碎袁按照每克组织8mL的比例加入RNA抽提液袁上下颠倒混匀曰渊2冤将混合物导入到50mL离心管中袁加入1/5体积的氯仿袁轻轻摇动袁彻底混合5min曰渊3冤2000袁4益袁离心10min曰渊4冤转移上清液到新的50mL离心管袁加入等体积的酸酚-氯仿袁1/3体积的醋酸钾渊4益袁3mol窑L-1袁pH=5.5冤袁

渊1冤取适量新鲜的+10DPA纤维尧+10DPA

7500Real-TimePCRSystem进行袁反应体系20滋L院10倍稀释的茎环cDNA1滋L曰1伊PremixExTaq(TaKaRa)曰上游引物5忆-GTGAAGT-GTTTGGGGGAACTCG-3忆和下游引物5忆-GT-GCAGGGTCCGAGGT-3忆均为0.2滋mol窑L-1曰UPLprobe#21渊Roche冤0.2滋L曰ROXReferenceDyeⅡ58益退火1min袁58益延伸1min袁共45个循环遥0.4滋L遥反应程序院95益预变性30s曰95益变性5s袁

结果与分析

RNA质量分析

此法可成功得到高质量的棉花胚珠尧纤维总RNA(图1)遥经1%琼脂糖凝胶电泳检测袁可清晰观察到棉花总RNA的28S袁18S袁5SrRNA特征带遥同样的材料袁用改良的热硼酸法[5-6]和酚-SDS[7]法提取的RNA也无降解发生袁但观察不到5SrRNA特征带遥聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示袁只有这种新方法提取的RNA能在15～35bp出现可见的小RNA特征条带渊包括miRNA冤(图2)遥

1

28S18S

2

3

4

5

6

混合均匀袁冰浴1h曰渊5冤2000袁4益袁离心10min曰淀液袁彻底混匀曰渊7冤加入原上清液1/4体积的无水乙醇袁混匀后放置于-20益至少1h曰渊8冤11000袁4益袁离心10min曰渊9冤弃上清液袁加入2mL70%乙醇袁涡旋曰渊10冤11000袁4益袁离心10min曰渊17冤重复步骤9尧10曰渊11冤倒掉上清液袁晾干曰渊12冤备用遥

RNA电泳

制备0.75mm厚的15%变性聚丙烯酰胺凝胶渊1伊TBE尧7mol窑L-1尿素尧15%丙烯酰胺冤遥取适量RNA并加入等体积凝胶加样缓冲液渊95%甲酰胺尧18mmol窑L-1EDTA尧SDS尧二甲苯蓝尧溴酚蓝各为0.025%冤袁95益加热5min以使二级结构变性袁于Bio-RadMini-PROTEAN4上电泳袁恒定电压80V遥银染参照张军等的方法[4]遥

茎环cDNA的合成

适量RNAase-freeddH2O溶解沉淀袁保存于原80益渊6冤上清液导入到新管中袁加入1/4体积RNA沉

5S

1和2袁3和4袁5和6分别为改良的热硼酸法袁酚-SDS法和本实验方法提取的总RNA曰1尧3尧5所用材料为+10DPA渊Dayspostanthesis冤纤维袁2尧4尧6所用材料为+10DPA的胚珠遥

Line1and2,3and4,5and6indicatedtheRNAex-tractedbyhotboratemethod,phenol-SDSmethodandthenewmethod,respectively;TheRNAinline1,3,5camefrom+10DPAfibers,andtheotherthreefromho-mochronousovules.

图13种方法提取的RNA琼脂糖胶电泳图谱Fig.1Ethidiumbromidestained1%agarosegeloftotalRNAisolatedbythreekindsofRNAextractionmethod

反应体系15滋L院50ng总RNA曰1nmol窑L-1

反转录引物5忆-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCC-GAGGTATTCGCACCAGAGCCAACGAGTTC-3忆渊针对miR395b院GGUGAAGUGUUUGGGGGAA-CUC冤曰3.33U窑滋L-1SuperScriptIII反转录酶渊Invit-rogen冤曰4种dNTP各含0.25mmol窑L曰0.25U窑滋L

-1

-1

RNaseOUTRNA酶抑制剂遥反应程序院16益袁30min曰30益袁30s曰42益袁30s曰50益袁1s曰60个循环遥

定量PCR

Taqman定量PCR由AppliedBiosystems

5期

M

35bp

余道乾等院一种适宜棉花microRNA实时定量分析的总RNA提取方法1

2

3

469

结果显示袁标准曲线斜率达到0.991袁可见扩增效率较高袁抑制物质的影响在可接受范围内遥其他方法所提取的RNA的实时定量扩增曲线指数期出现较晚袁说明miRNA的回收率很低遥

讨论

15bp

棉花的基础研究起步较晚尧难度较大袁且主要集中于大分子水平遥小分子物质在其他植

M院maker曰1尧2尧3分别指用热硼酸法尧酚-SDS法尧本

物中的深入研究为棉花基础研究提供新的方向遥属于小RNA的miRNA参与植物生长发育尧形态建成等诸多过程袁成为研究的一大热点遥目前袁实时定量PCR(Real-timeQuantitativePCR)技术仍是研究miRNA转录情况的主要手段之一遥但受自身含量和提取过程的影响袁所提取的总RNA中miRNA含量普遍较低[8]袁且难免有抑制物质存酚组织更是如此遥本文采用改良的异硫氰酸胍-硫氰酸铵-酸酚法提取棉花组织总RNA袁较硼酸法[5-6]和酚-SDS[7]法袁所提取的总RNA回收率高尧丢失少尧基本无降解袁在保持RNA完整性上具有明显优势遥且OD260/OD280比值均在1.9左右袁纯度较高袁完全满足miRNA水平荧光定量研究的需求遥

在袁难以满足后续实验需求袁对于棉花的多糖多

方法提取的RNA电泳图曰箭头所示为小RNA遥

M:maker;line1,2,3indicatedthattheRNAextractedbyhotboratemethod,phenol-SDSmethodandthenewmethod,respectively;SmallRNAwasindicatedbyarrows.图2

3种方法提取的RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱Silverstained15%PAGEgeloftotalRNA

Fig.2

isolatedbythreekindsofRNAextractionmethod

实时定量PCR

利用上述3种方法提取的各个时期总RNA进行定量PCR鉴定遥结果表明袁只有本方法对应的miR395bcDNA才有正常的扩增袁其他2种常用的方法均不正常(图3尧图4)遥而且本方法中袁各个样品的指数扩增阶段均出现在20～30个循环遥模板再次梯度稀释后的实时定量PCR反应

1.2001.0000.8000.6000.4000.2000.000

1234567101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142434445

方框内扩增曲线所用模板为热硼酸法尧酚-SDS法提取的RNA遥

TheamplificationcurveoftheboxindicatedthatthetemplateRNAextractedbythehotboratemethodandphenol-SDSmethod.

图3实时定量扩增曲线

Fig.3Amplificationcurveofreal-timePCR

470

28.00026.00024.00022.00020.00018.518-2.796

棉花学报25卷

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LogC0

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