２００８．４（总第１５１期） 盈山东食品发酵 高产油脂酵母菌株的筛选 相光明 赵祥颖 刘建军 李元森 （１山东农业大学食品科学与工程学院泰安２７００１ ８） （２山东省食品发酵工业研究设计院济南２５００１３） （３山东轻工业学院食品与生物工程学院济南２５０３５３） 摘要将２０份土样经平板初筛，摇瓶初筛、复筛，筛选得到了６株产油脂量高的酵母菌株，其中—株的产油脂量已达到４．４４ｇ／Ｌ。 关键词酵母菌油脂筛选 Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｙｅａｓｔｓ Ｈｉｇｈ—ｙｉｅｌｄｉｎｇ Ｌｉｐｉｄ Ｘｉａｎｇ Ｇｕａｎｇｍｉｎｇ，Ｚｈａｏ Ｘｉａｎｇｙｉｎｇ，Ｌｉｕ Ｊｉａｎｊｕｎ，ｌｉ Ｙｕａｎｓｅｎ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉ’ａｎ ２７ １ ０ １ ８） （Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｊｉｎａｎ ２５００ １ ３） （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｉｎｓｔｉｕｔｔｅ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｊｉｎａｎ ２５０３５３） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｆｔｅｒ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｆｌａｔ ａｎｄ ｓｈａｋｅ—ｌｆａｓｋ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｓｉｘ ｓｔｒａｉｎｓ ｈｉｇｈ—ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ２０ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｓｏｉｌ．Ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｙｔ ｏｆ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｈａｖｅ ｒｅａｃｈｅｄ ４．４４ｇｉｎ． Ｋｅｙ ＷＯｒｄｓ：ｙｅａｓｔ：ｌｉｐｉｄ；ｓｅｌｅｃｔ 微生物油Ｈ￣（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｉｌｓ）又称单细胞油脂 短缺的矛盾日益加剧，另外环境污染日趋严重， （ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｏｉｌ，ｓｃｏ），是由酵母、霉菌、细菌和藻 被迫寻求开发新型清洁能源。微生物油脂不仅可 类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢 以缓解植物油脂紧缺的局面而且可以生产功能性 化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐生 油脂，另外可以代替植物油用来制取生物柴油， 产的油脂和另一些有商业价值脂质。微生物生产 缓解全球能源危机。因此，开辟微生物油脂这一新 油脂不仅具有油脂含量高、生产成本低、生产周 的油脂资源，具有深远的意义。 期短等优点；而且可用细胞融合、细胞诱变等方 本文对从不同环境下采集的２０份土样分离筛 法，使微生物产生高营养油脂或某些特定脂肪酸 选，获得了产油脂量较高的６支酵母菌株，为微生 组成油脂，如ＥＰＡ、ＤＨＡ、类可可脂等。 物油脂的开发利用提供基础。 随着现代生物技术的发展，已获得很多具有高 产油能力或富含稀有脂肪酸的产油微生物资源，提 １材料与方法 高了微生物产油的效率。日本、德国、美国等国 １．１实验材料 目前已有商品菌油面市。在欧洲、中东、南亚和 哈那斯湖边牧场、天山附近牧场、多年耕种 澳洲等地已允许将某些微生物油脂添加到婴儿食 菜棚、果园等的土样２０份作为分离材料。 品中ｆ１］。人口的增长使油脂需求量与自然资源严重 １．２培养基 Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｆｏｏｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ——９—— 山东食品发酵 ２００８．４（总第１５１期） １．２．１富集培养基（ｇ・ ） 二钠２，磷酸二氢钾７，七水合硫酸镁１．５，ｐＨ 葡萄糖５０，尿素ｌ，硫化铵１，磷酸二氢钾２．５， ５．８～６．０。 磷酸氢二钠０．５，七水合硫酸镁１，七水合硫酸铁 以上培养基均在１２１℃饱和蒸汽下灭菌１５ｍｉｎ。 ０．１，酵母膏０．５，孟加拉红０．０３，ｐＨ ４．５。 １－３分析方法 １．２．２分离培养基（ｇ／Ｌ） １＿３．１菌体中脂肪粒观察：苏丹黑染色 葡萄糖５０，尿素１，硫酸铵１，磷酸二氢钾 １．３．２残糖测定：生物传感仪ｐ ２．５，磷酸氢二钠０．５，七水合硫酸镁１，七水合硫 １．３－３菌体生物量的测定：菌体干重 酸铁０．１，酵母膏０．５，琼Ｊ］￣２０，青霉素０．０３，链霉 １．３．４脂肪含量测定：索氏抽提法Ｌ５Ｊ 素０．０３，四环素０．０３，ｐＨ ４．５。 １．２－３斜面保藏培养基（ｇ／Ｌ） ２实验方法 葡萄糖２０，酵母膏１２．５，蛋白胨１０，琼脂 ２．１苏丹黑染色筛选指标 ２０，ｐＨ ５．８．６．０。 根据苏丹黑染色后的着色情况及菌体形态建 １．２．４摇瓶发酵培养基（ｇ／Ｌ） 立了苏丹黑染色筛选标准（见下表１），使下一步 葡萄糖４０，硫酸铵２，酵母膏１．９，磷酸氢 的分离更加简捷。菌株显微形态见图１、２． 表１苏丹黑染色筛选指标 菌体脂肪粒着色 菌体形态 ０：视野中只有红色或仅在细胞膜上有着色且不规则 Ａ：菌体呈不规则椭圆形 １：有半数着色，但不确定是否在细胞内 Ｂ：菌体球形、体积较大，内有异质粒 ２：基本全部着色，但不确定是否在细胞内 ｃ：菌体似藕节状，呈长线 ３：能较清晰的观察到脂肪粒 Ｄ：菌体串珠，呈短棒状 图１菌株２－１１ 图２菌株６－１８ ２．２产脂菌株的筛选 混匀，制成１０—１～１０—６不同稀释度的溶液。用 ２．２．１富集培养 移液管取上述稀释液０．２ｍＬ于分离平板中，用涂布 取１ｇ分离材料于１０ｍｌ无菌水中混匀，吸取上 器涂布均匀，每个稀释度三个平行，并标记。此 清液于５０ｍｌ富集培养基中，２８℃，１ ８０ｒ／ｍｉｎ振荡培 时的平板中亦加入了抑制细菌、放线菌生长的青 养，３天后取培养液进行平板分离。在培养基中加 霉素、链霉素及四环素，使平板上长出的绝大部 入了孟加拉红，它可抑制细菌和放线菌的生长，而 分为酵母以便于分离。将涂布好的平板置于２８℃ 对真菌无抑制作用，因而酵母菌在这种培养基上可 培养箱倒置培养２～３天，将平板上的单菌落分别 以得到优势生长。 进行苏丹黑染色、镜检，胞内脂肪粒明显的单菌 ２．２．２平板初筛 落挑斜面，置于２８℃恒温培养，至长出菌苔后冷 取１ｍＬ富集培养液于９ｍＬ无菌水试管中振荡 藏保存。然后将挑过的平板倒置于冰箱中低温 ——１０——Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｆｏｏｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ２００８．４（总第１５１期） 盈山东食品发酵 培养，至有新菌落长出时重新染色筛选，保留脂 表２产脂菌株的筛选 肪粒明显的菌株。这与产脂微生物更耐受低温有 关，也是一种低温筛选手段。 ２．２．３摇瓶初筛 在２８℃下活化产脂菌株２天、而后一株接一瓶 进行摇瓶发酵。摇瓶发酵条件：装液量３５／２５０ｍＬ三 角瓶，２８￣（２×１８０ｒ／ｍｉｎ×４Ｄ，第一轮初筛发酵结 束后发酵液中菌体经苏丹黑染色、镜检，以脂肪 粒的大小为筛选指标。第二轮除菌体苏丹黑染色 外，发酵液离心后测残糖，以脂肪粒大小及残糖 为筛选指标，残糖低、脂肪粒较大的菌株保留。 ２．２．４摇瓶复筛 摇瓶发酵初筛获得的产脂相对较高的菌株， ２８℃活化２天一株接三瓶摇瓶培养。摇瓶发酵条 件：装液量８５／５００ｍＬ三角瓶，２８℃×ｌ８０ｒ／ｍｉｎ× ４Ｄ。苏丹黑染色镜检，发酵液稀释测残糖，离心 后收集菌体，测生物量，干燥后测干菌体油脂含 量，生物量高且油脂含量高的菌株保留。 ３结果与分析 ３．１平板初筛 从采集的２０份土样，经平板分离筛选后，获 得产脂酵母菌菌株共１７０支（见表２），但主要集中 于低温区牧场及多年耕作的果园、菜棚，可能是 由于低温有力于微生物产脂及酵母的习性有关。 ３．２摇瓶初筛 存，进行下一轮的摇瓶发酵复筛。第二轮筛选 对平板初筛获得酵母菌经第一轮摇瓶发酵 到残糖１０ｇ／Ｌ以下，镜检２以上的１０支高产株，结 初筛，选出了产脂量较高的５７支酵母菌冷藏保 果见表３。 表３摇瓶初筛高产株 Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｆｏｏｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ——１ １ 山东食品发酵 ２００８．４（总第１ ５１期） ３＿３摇瓶复筛 物，其中６—１８油脂含量达３６．６８％。并且有４支菌 将１Ｏ支高产菌株摇瓶发酵，收集菌体，索 株的葡萄糖利用率达到１００％，若再优化培养条 氏抽提测脂肪含量，得到油脂得率高的６株菌， 件油脂的率会相应的提高。６．７和６—１ ８抽提后油 见表４。从表中发现，这６株菌油脂含量已超过 脂有明显的香气，是非常有研究价值的两株产 自身细胞干重的２０％，可以界定为产油脂微生 香酵母。 表４摇瓶复筛高产株 参考文献 ４结论 ［１］余华．微生物油脂开发利用的研究［Ｊ】．粮油食品，２００１， 从不同地理环境采集的２０份土样，以苏丹黑 （５）：４４～４５． 染色和测发酵液残糖为指标进行初筛，直接根据 【２］白毓谦，方善康，高东等．微生物实验技术【Ｍ］．济南： 山东大学出版社，１ ９８７．５６． 脂肪粒颜色的深浅及大小半定量反映菌体内油脂 ［５］孔祥莉，刘波，赵宗保，冯斌．生物ｍ＿Ｔ－－过程［Ｊ］．２００７， 含量，减轻了工作量，提高了筛选效率。在复筛 （５）：；５６～４１． 中测定生物量及干菌体油脂含量，筛选到６支油 ［４］刘淑君，杨文博，施安辉．高产油脂酵母选育及摇瓶发酵 脂得率在２．７ ｇ／Ｌ以上的高产脂菌株，其中６－１５和 条件的研 Ｊ】．微生物学通报，２０００，２７（２）：９３－９７． ６—１ ８已达到４．４４ｇ／Ｌ与４．２５ｇ／Ｌ。这些微生物菌种新 【５】何东平，陈涛等．微生物油脂学［Ｍ】．北京：化学工业出 资源为以后的研究提供了基础。 版社，２００６．１ ５９． 啤酒新国标有望２ ０ ０ ８年出台 ＧＢ４９２７－２００８ 啤酒 国家标准已经修订完毕，有望于２００８年出台。 ＧＢ４９２７—２００８版本在ＧＢ４９２７－２００ １《啤酒））国家标准的基础上进行修订，内容包括强制性条款与推 荐性条款两部分。强制性条款主要包括啤酒产品定义、卫生要求、净含量、产品标志。 此次新标准主要修改内容还包括：干啤酒、冰啤酒、低醇啤酒、小麦啤酒和浑浊啤酒的定义，增 加了无醇啤酒和果蔬类啤酒的定义；增加了产品分类；将净含量负偏差改为净含量；质量等级取消了二 级；酒精度的计量单位改为体积百分含量（％ｖｏ１）表示；对淡色啤酒的泡持性、酒精度、原麦汁浓度、总 酸、二氧化碳指标进行了调整；对浓色啤酒、黑色啤酒的泡持性、酒精度、原麦汁浓度、二氧化碳指标 进行了调整，另增加了蔗糖转化酶活性要求；对出厂检验项目进行了适当修改。 ——１２——Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｆｏｏｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
