茅苍术挥发油对幽门螺杆菌及其尿素酶B表达的影响

JournalofXinxiangMedicalUniversityVol．33No．12Dec．2016

·1047·

欁欁氉欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉

本文引用：翟志刚，余敏，张开军，等．茅苍术挥发油对幽门螺杆菌及其尿素酶B表达的影响［J］．新乡医学院学

2016，33（12）：1047-1049．DOI：10．7683/xxyxyxb．2016．12．008．报，

欁欁氉【基础研究】

1

翟志刚，余

（1．江苏大学附属医院放疗科，江苏3．江苏大学附属医院信息科，江苏

摘要：

目的

毒力因子尿素酶B（UreB）表达的影响。方法

100μLHP菌悬液和0．25μL二甲基亚砜），30．000、15．000、7．500、3．750、1．875、0．938、0．469g·L－1茅苍术组（分别15．000、7．500、3．750、1．875、0．938、0．469g·L－1茅苍术挥发油和100μLHP菌悬液）和空白对照组（加加入30．000、

10－1

运用常规肉汤稀释法测定茅苍术挥发油对HP的抑制作用。将2×10CFU·LHP接种于布氏肉汤液入培养基），

体培养基，然后分为实验组和空白对照组，实验组加入茅苍术挥发油使其终浓度为0．5×最小抑菌浓度，对照组不加微需氧培养72h后，采用实时定量荧光聚合酶链式反应检测2组尿素酶B（UreB）mＲNA的表达。结茅苍术探发油，果

－1

15．000、溶剂对照组和0．469g·L茅苍术组抑制率与阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。30.000、

7．500、3.750、1．875g·L－1茅苍术组抑制率高于阳性对照组，0．938g·L－1茅苍术组抑制率低于阳性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。实验组UreBmＲNA表达量为0．036±0．001，低于对照组的0．100±0．001，差异有统计学意义（P＜0．01）。结论

关键词：

一定浓度的茅苍术挥发油可抑制HP生长，亚抑菌浓度挥发油可下调UreBmＲNA表达。

文献标志码：A

7239（2016）12-1047-03文章编号：1004-茅苍术；挥发油；幽门螺杆菌；尿素酶B

EffectofAtractylodeslanceaDCvolatileoilsonHelicobacterpyloriandtheexpressionofUreBmＲNAZHAIZhi-gang1，YUMin2，ZHANGKai-jun1，SHIHai-bo3，SHAOChen4，DAIDong-fang1

（1．DepartmentofＲadiationOncology，theAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity，Zhenjiang212001，JiangsuProvince，China；2．DepartmentofPathogenicBiology，SchoolofMedicine，JiangsuUniversity，Zhenjiang212013，JiangsuProvince，China；3．De-partmentofInformation，theAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity，Zhenjiang212001，JiangsuProvince，China；4．DepartmenttheAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity，Zhenjiang212001，JiangsuProvince，China）ofCardiology，

Abstract：

Objective

ToinvestigatetheinhibitoryactionoftheAtractylodeslanceaDCvolatileoilsonHelicobacterpy-Theexperimentwasdividedintopositivecontrolgroup（adding100μLHP

lori（HP）andtheinfluenceofvolatileoilsatsub-minimuminhibitoryconcentration（sub-MIC）ontheexpressionofvirulencefactorureaseB（UreB）mＲNAofHP．Methods

suspension），solventcontrolgroup（adding100μLHPsuspensionand0．25μLdimethylsulfoxide），30．000，15．000，7.500，3．750，1．875，0．938，0．469g·L－1AtractylodeslanceaDCgroup（adding30．000，15．000，7．500，3．750，1．875，0．938，0.469g·L－1AtractylodeslanceaDCvolatileoiland100μLHPsuspension）andblankcontrolgroup（addingmedium）；thebrothdilutionmethodwasemployedtomeasuretheinhibitoryactionofAtractylodeslanceaDCvolatileoilsonHP．The2×andthentheexperimentwasdividedintoexperimen-1010CFU·L－1HPwasinoculatedintotheBrucellabrothliquidmedium，

talgroupandcontrolgroup．TheexperimentalgroupwasaddedAtractylodeslanceaDCvolatileoiltomakethefinalconcentra-tionofHPwas0．5×minimuminhibitoryconcentration；thecontrolgroupwasnotaddedAtractylodeslanceaDCvolatileoil；twogroupswasculturedundermicro-aerobicconditionfor72h．Thereal-timepolymerasechainreaction（Ｒeal-timePCＲ）wasusedtodetecttheexpressionoftheUreBmＲNAinthetwogroups．Ｒesults

Therewasnostatisticdifferenceintheinhibition

ratiobetweensolventcontrolgroup，0．469g·L－1AtractylodeslanceaDCgroupandpositivecontrolgroup（P＞0．05）．Theinhi-15．000，7．500，3．750，1．875g·L－1AtractylodeslanceaDCgroupwassignificantlyhigherthanthatinbitionratioin30．000，

positivecontrolgroup（P＜0．05）；theinhibitionratioin0．938g·L－1AtractylodeslanceaDCgroupwassignificantlylowerthanthatinpositivecontrolgroup（P＜0．05）．TheexpressionofUreBmＲNAinexperimentalgroupandcontrolgroupwas0．036±

DOI：10．7683/xxyxyxb．2016．12．008

收稿日期：2016－08－08

基金项目：镇江市卫生科技重点专项资助项目（编号：SHW2015001）；江苏大学临床医学专项基金（编号：JDLCZX024）。作者简介：翟志刚（1977－），男，江苏镇江人，学士，主治医师，研究方向：消化道肿瘤的基础与临床。

：（1984－），，，mail：85603163@qq．com。通信作者戴东方女江苏淮安人博士研究生在读，主治医师，研究方向：消化道肿瘤的基础与临床；E-

欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉茅苍术挥发油对幽门螺杆菌及其尿素酶B表达的影响

213

敏，张开军，石海波，邵

41晨，戴东方

镇江212001；2．江苏大学医学院病原生物学研究室，江苏镇江212013；

镇江212001；4．江苏大学附属医院心内科，江苏镇江212001）

MIC）挥发油对HP研究茅苍术挥发油对幽门螺杆菌（HP）的抑制作用以及亚最小抑菌浓度（sub-将实验分为阳性对照组（加入100μLHP菌悬液），溶剂对照组（加入

中图分类号：Ｒ378．99

·1048·

新乡医学院学报http：//www．xxyxyxb．com2016年第33卷

0.001and0．100±0．001respectively；theexpressionofUreBmＲNAinexperimentalgroupwassignificanltylowerthanthatincontrolgroup（P＜0．01）．Conclusion

Keywords：

AcertainconcentrationofAtractylodeslanceaDCvolatileoilscaninhibitthegrowthof

MICofvolatileoilscandecreasetheexpressionofUreBmＲNA．HP；thesub-AtractylodeslanceaDC；volatileoils；Helicobacterpylori；ureaseB

幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，

HP）是一种寄生于人胃黏膜的革兰阴性微需氧菌，世界范围内人

群感染率达50%。目前，

国内外对HP感染的治疗主要基于联合1种质子泵抑制剂和2种抗生素的三联疗法，临床最常用的抗生素包括甲硝唑、克拉霉素和阿莫西林等。随着HP耐药率逐年上升且越来

越普遍［1］

，寻求天然有效的抗HP药物已越来越迫切。苍术为菊科植物茅苍术或北苍术的干燥根茎［2］

。苍术对结核菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯叶杆菌和绿脓杆菌等均有明显的抑制作用，但对HP的作用国内外报道较少。本研究探讨茅苍术对HP的抑制作用及对HP毒力因子尿素酶B表达的影响，旨在寻找抗HP的中草药。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1菌株和药物HPNCTC11637、大肠埃希菌DH5α菌株由江苏大学病原生物学研究室保存。茅

苍术为南京师范大学戴传超教授馈赠，

4℃保存。1．1．2主要试剂哥伦比亚培养基购自英国Oxoid公司，布氏肉汤培养基购自青岛高科园海博生物技

术有限公司，

克隆载体pMD18-T、反转录试剂盒购自日本Takara公司，

微需氧袋购自日本三菱公司，胎牛血清购自北京全式金生物技术有限公司，高纯总ＲNA快速提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限

公司，

二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）购自国药集团化学试剂有限公司。1．2方法

1．2．1HP的培养与鉴定HP接种于哥伦比亚培

养基，

37℃微需氧环境培养3d。HP的鉴定采用形态学与生物化学反应结合。肉眼观察菌落形态呈透明针尖样。革兰染色后油镜下观察，典型的HP为革兰染色阴性，海鸥状、弧形或S形。生物化学反应尿素酶反应、氧化酶及触酶试验均阳性。HP以布氏

肉汤培养基配制成菌悬液，

用分光光度计调整菌液使其在600nm波长的吸光度值（A）为1，菌落数为

2×1011CFU·L－1

，备用。

1．2．2药物制备与稀释茅苍术提取参考《中华人民共和国药典2010》附录中的挥发油提取方法，用水蒸气蒸馏法提取。称取茅苍术60g，加入600mL双蒸水浸泡过夜，用挥发油提取器提取挥发

油，

按照4∶1（茅苍术挥发油∶DMSO）比例溶解，避光4℃保存。

1．2．3常规肉汤稀释法测定茅苍术挥发油对HP生长的影响取无菌试管（13mm×100mm）10支，

第1管为不含药物的阳性对照组，第2管为加入0.25μLDMSO的溶剂对照组，第3～9管分别以

30g·L－1

为初始浓度做2倍稀释共7个梯度（30.000、15．000、7．500、3．750、1．875、0．938、

0．469g·L－1

茅苍术组）的茅苍术挥发油，第10管仅加入培养基作为调零用空白对照。然后在每管内（除第10管外）加入上述制备好的菌悬液各

100μL，使其终浓度约为2×1010CFU·L－1

，每管总液体量为2mL。将接种好的稀释管塞好塞子，放入

厌氧罐中加微需氧袋，

置37℃普通空气孵箱中孵育72h后观察结果。肉眼观察无细菌生长的最低浓度即为最小抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentra-tion，MIC），并测定其A600值。根据公式计算抑制率，抑制率=（阳性对照组平均A值－加药组A值）/阳性对照组平均A值×100%。每次实验每组重复3次，并重复实验5次。

1．2．4尿素酶B及16srＲNA标准质粒的制备与验

证提取HP基因组，

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCＲ）法扩增目的片段，胶回收连接至

克隆载体pMD18-T，转化至感受态大肠埃希菌

DH5α中扩增，提取质粒，测定其浓度、纯度及拷贝

数，

用灭菌双蒸水将目的基因和内参基因质粒稀释成不同浓度的标准品备用。尿素酶B基因引物序

列：上游5'-CTGTAGAAGTGGGCAAAGTGG-3'，下游

5'-GGTTGTGGGGTAGGGATAGAA-3'，扩增片段长度

142bp。16srＲNA基因引物序列：上游5'-GGACA-CACTGGAACTGAGACAC-3'，下游5'-TCCTAAAAC-CTTCATCCTCCAC-3'，扩增片段长度117bp。

1．2．5实时定量荧光聚合酶链式反应（real-time

PCＲ，Ｒeal-timePCＲ）检测尿素酶BmＲNA的表达反应体系：SYBＲ预混ExTaq酶（2×）7．5μL，PCＲ正向引物0．3μL，PCＲ反向引物0．3μL，模板1μL；加入双蒸水至总体积为15μL。反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环，72℃收集荧光信号。最后做融解曲线分析，确定反应产物的单一性。

1．2．6亚MIC对HP毒力因子尿素酶B表达的影

响HP按照初始量2×1010CFU·L－1

接种布氏肉汤液体培养基，实验组加入茅苍术挥发油药物原液使其终浓度为0．5×MIC，对照组加入HP不加茅苍术挥发油药物，微需氧培养72h离心收集细菌，加

入1mLTrizol，

高纯总ＲNA快速提取试剂盒提取总ＲNA，反转录至cDNA，

Ｒeal-timePCＲ检测目的基因及内参基因表达。每次实验每组重复3次，并重复实验5次。

第12期翟志刚，等：茅苍术挥发油对幽门螺杆菌及其尿素酶B表达的影响

·1049·

1．3统计学处理应用SPSS17．0软件进行统计

学分析，数据以均数±标准差（x珋

±s）表示，2组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，

进一步两两比较用post-hoc检验；P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1茅苍术挥发油对幽门螺杆菌的生长抑制作用

结果见表1。溶剂对照组和0．469g·L－1

茅苍术组抑制率与阳性对照组比较差异均无统计学意义（P＜0.05）。30．000、15．000、7．500、3．750、1．875g·L－1茅

苍术组抑制率高于阳性对照组，

0．938g·L－1茅苍术组抑制率低于阳性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1茅苍术挥发油对幽门螺杆菌的抑制作用

Tab．1InhibitoryactionofAtractylodeslanceaDCvolatileoilsonHP（x珔

±s）组别

A600

抑制率/%

阳性对照组1．547±0．132－

溶剂对照组

1．542±0．1350．36±8．7330．000g·L－1茅苍术组0．011±0．00699．29±0．42a

15．000g·L－1茅苍术组0．048±0．00396．86±0．24a7．500g·L－1茅苍术组0．057±0．01196．33±0．73a3．750g·L－1茅苍术组0．269±0．09882．63±6．34a1．875g·L－1茅苍术组1．038±0．132．95±10．57a0．938g·L－1茅苍术组1．749±0．073－13．54±4．74a0．469g·L－1茅苍术组1．5

±0．081

－6．28

±5．21

注：－：无抑制率；与阳性对照组比较a

P＜0．05。

2．2亚MIC茅苍术挥发油对幽门螺杆菌毒力因子

尿素酶BmＲNA抑制作用实验组尿素酶BmＲ-NA表达量为0．036±0．001，低于对照组的0．100±0．001，差异有统计学意义（t=－8．075，

P＜0．01）。3讨论

HP是人类最常见的一种致病菌，与胃炎、消化道溃疡、胃癌及胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤等的

发生密切相关

［3-4］

。1994年世界卫生组织国际癌症研究机构已将其纳入一类致癌原。HP的致病有多种致病因子参与，其中尿素酶被证实与HP感染密切

相关［5］

，正常情况下人胃黏膜可分泌大量胃酸，使pH处于2左右，而HP之所以能耐受高酸环境，其主要原因与含有尿素酶有关。此酶可以分解尿素产生氨，中和胃酸，使HP在强酸性环境中生存并且穿过胃黏

液定植于胃黏膜上皮细胞表面［6］

。此外，尿素酶还可通过多种机制参与中性粒细胞的聚集，并进一步刺激

与活化免疫系统，引起黏膜炎症反应［7］

。

苍术主要产于江苏、湖北等省，且以江苏茅山一带质量最好，故又称茅苍术，是苍术的道地药材。苍

术味辛、苦，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目之功

［8-9］

。茅苍术挥发油的主要成分包括苍术醇、β-桉叶醇、茅

术醇、苍术酮、苍术素等［10］

。苍术萃取物多梯度的体外抑菌实验发现苍术对15种真菌有不同程度的抑制，尤其对红色毛癣菌、石膏样毛癣菌等10种浅部真

菌抑制作用明显［11］

。此外，关苍术对艾滋病病毒重

组蛋白酶也有轻微的抑制作用。林平［12］

研究发现，北苍术提取物对耐四环素、链霉素和氨苄西林的福氏痢疾杆菌F13株有很强的抑制作用。苍术消毒剂还

可有效杀灭空气中的细菌，预防医院感染［13］

。

本实验结果表明：随着药物浓度的增加，吸光度降低，对HP的抑制作用增加，且生长抑制作用呈浓

度依赖性。当药物浓度≥1．875g·L－1

时，

不同浓度茅苍术挥发油对HP生长均有一定抑制作用，

当浓度≥7．500g·L－1

时，可有效杀死HP，当药物浓

度降低到0．938g·L－1

时，其抑制作用消失，表现出

促进生长的作用，但当浓度降低到0．469g·L－1

时，这种促进生长作用消失，且亚MIC挥发油可下调尿素酶BmＲNA的表达，这对进一步研究茅苍术挥发油的抑菌作用奠定基础。综上所述，茅苍术挥发油对HP有很好的杀菌及抑菌效果，对于临床HP的感染有广阔的应用前景。

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