中国畜牧兽医２０１８，４５（１）：２２—３１ Ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１６４３１／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７１—７２３６．２０１８．０１．００３ 鹅新城疫病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ可视化检测方法的建立 刘文俊 ，黄运茂 ，阳佑天 ，许丹宁 ，曹 楠 ，周德荣 ，田允波 （１．仲恺农业工程学院，广东省水禽健康养殖重点实验室，广州５１０２２５；２．佛山科学技术学院，佛山５２８０００） 摘要：本研究拟建立一种能在基层实时、便捷诊断鹅新城疫病毒（ｇｏｏｓｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，ＧＮＤＶ）的检测 方法。根据ＧｅｎＢａｎｋ中公布的ＧＮＤＶ Ｆ基因的高度同源保守序列设计特异性引物，并在反应体系中添加钙黄绿 素／氯化锰指示剂，建立可视化ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法。结果显示，建立的方法能特异地检测出ＧＮＤＶ及ＮＤＶ Ｌａ— ｓｏｔａ疫苗株，而小鹅瘟病毒（ＧＰＶ）、禽流感病毒（ＡＩＶ）、鸭坦布苏病毒（ＤＴＭＵＶ）等其他病毒均为阴性。所建立的 ＧＮＤＶ可视化ＲＴ ＬＡＭＰ检测方法对ＲＮＡ的最低检测限为１Ｏ ｐｇ，反应过程不需ＰＣＲ仪等复杂的仪器，５０ ｍｉｎ即 可完成反应，可经肉眼观察反应体系颜色判定结果。该方法特异性强、灵敏度高，且操作安全、简便、快捷，可满足 基层筛查ＧＮＤＶ的需求。 关键词：鹅新城疫病毒（ＧＮＤＶ）；环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）；钙黄绿素 中图分类号：￥８５８．３３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１－７２３６（２Ｏ１８）０１—００２２ １０ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＲＴ ＬＡＭＰ Ｖｉｓｕａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｏｏｓｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ ＩＡＵ Ｗｅｎｊ ｕｎ ，ＨＵＡＮＧ Ｙｕｎｍａｏ ，ＹＡＮＧ Ｙｏｕｔｉａｎ ，ＸＵ Ｄａｎｎｉｎｇ ，ＣＡＯ Ｎａｎ ， ＺＨＯＵ Ｄｅｒｏｎｇ ，ＴＩＡＮ Ｙｕｎｂｏ （１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｗａｔｅｒｆｏｗｌ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｚｈｏｎｇｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０２２５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｆｏｓｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｏｓｈａｎ ５２８０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ａｎｄ ｅａｓｙ—ｔｏ—ｄｉａｇｎｏｓｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅ— ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏｏｓｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ（ＧＮＤＶ）ａｔ ｔｈｅ ｇｒａｓｓｒｏｏｔｓ ｌｅｖｅ１．Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ｈｏ— ｍｏｌｏｇｏｕｓ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＧＮＤＶ Ｆ ｇｅｎｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅ— ｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｌｃｅｉｎ／ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｖｉｓｕａｌ ＲＴ—ＬＡＭＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆ— ｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｃｔ ＧＮＤＶ ａｎｄ ＮＤＶ Ｌａｓｏｔａ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎｓ．ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｖｉｒｕｓｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＧＰＶ．ＡＩＶ ａｎｄ ＤＴＭＵＶ ｗｅｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ．Ｔｈｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ＲＮＡ ｗａｓ １０ Ｐｇ．Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｄｉｄ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ５０ ｍｉｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎａｋｅｄ ｅｙｅ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｓａｆｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｆａｓｔ，ｃｏｕｌｄ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＧＮＤＶ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｇｏｏｓｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ（ＧＮＤＶ）；ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＬＡＭＰ）；ｃａｌｃｅｉｎ 新城疫病毒（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，ＮＤＶ）又 称亚洲鸡瘟病毒，属于副黏病毒科、腮腺炎病毒 属口 。水禽作为ＮＤＶ的自然储存库，一度被认为 对该病毒有很强的抵抗力，即使强毒感染也不表现 任何症状。然而，自１９９７年辛朝安等 、王永坤 等 。 在江苏和广东等地区分离到对鹅具有高度致病 收稿日期：２０１７—０６—１３ 基金项目：广东省科技计划（２０１７Ａ０２０２０８０６９）；广东省普通高校青年人才创新项目（２０１６１０７６）；广东大学生科技创新攀登计划专项 （ｐｄｊｈ２ｏ１６ｂｏ２４３） 作者简介：刘文俊（１９８８一），男，湖南衡阳人，博士，讲师，研究方向：动物微生物学与免疫学，Ｅ—ｍａｉｌ：１ｗｊｈｅｒｏ１２３＠１２６．ｃｏｒｎ ＊通信作者：田允波（１９６５一），男，江西上犹人，博士，教授，研究方向：动物营养生理与畜禽健康养殖，Ｅ—ｍａｉｌ：ｔｙｕｎｂｏ＠１２６．ｃｏｒｎ １期 刘文俊等：鹅新城疫病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ可视化检测方法的建立 ２３ 性的毒株以来，该病毒不断在全国各地的鹅群中暴 发流行，造成巨大的经济损失，严重危害养鹅业的健 康发展。鹅新城疫（ｇｏｏｓｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＮＤ） １材料与方法 １．１ 材料 又被称为鹅副黏病毒病，是由基因Ⅶ型ＮＤＶ引起 的一种以消化道病变为主要特征的急性、烈性传染 病，具有极高的发病率和死亡率 ］。常用的诊断方 法主要包括细胞培养分离病毒、ＲＴ—ＰＣＲ等病原学 方法，以及ＨＩ／ＨＡ、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、 １．１．１ 病毒及临床样品 ＧＮＤＶ、小鹅瘟病毒 （ＧＰＶ）、Ｈ９亚型禽流感病毒（ＡＩＶ）、鸭坦布苏病毒 （ＤＴＭＵＶ）均由仲恺农业工程学院广东省水禽健康 养殖重点实验室分离保存；ＮＤＶ Ｌａｓｏｔａ弱毒活疫 苗购自广州永顺生物制药有限公司；２５份鹅肝脏病 免疫荧光（ＩＦＡ）等血清学、免疫学方法ｌ＿５］。由于鹅 新城疫病毒（ｇｏｏｓｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ， ＧＮＤＶ）与其他基因型ＮＤＶ毒株同源性差异较大， 以ＮＤＶ基因为模板设计的分子生物学检测方法难 料样品于２０１５年１０月至２０１６年８月采集于广东 省广州、阳江、汕头、清远等发生疫情的鹅场。 １．１．２ 主要试剂及仪器ｄＮＴＰ、ＡＭＶ反转录 酶、ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ 以完全兼顾。此外，传统方法由于依赖实验室精密 仪器或部分方法在简便性、稳定性、经济性上有所不 足，了在实际生产中的应用＿６］。 环介导等温核酸扩增技术（ＬＡＭＰ）是２０００年 由Ｎｏｔｏｍｉ等ｌ７ 开发的一种恒温核酸扩增方法。该 Ｖｅｒ ５．０、ＲＲＩ、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶和琼脂糖均购 自ＴａＫａＲａ公司；Ｂｓｔ ＤＮＡ ３．０聚合酶购自ＮＥＢ公 司；硫酸镁、甜菜碱（ｂｅｔａｉｎｅ）、氯化锰、钙黄绿素 （ｃａｌｃｅｉｎ）均购自Ｓｉｇｍａ公司。纯水仪购自ＥＬＡＧ 公司；手掌型离心机购自Ｓｃｉｌｏｇｅｘ公司；小型高速离 技术无需借助精密的仪器，具有简便、准确、廉价、高 灵敏度、高特异性的优点，非常适合临床应用＿８ ］。 设计４条不同的特异性引物识别靶基因的６个特定 区域，通过一种链置换ＤＮＡ聚合酶（Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌ— 心机购自Ｓｉｇｍａ公司；台式冷冻高速离心机购自 Ｔｈｅｒｍｏ公司；高压灭菌锅购自江阴滨江医疗设备 公司；ＰＣＲ扩增仪购自ＡＢＩ公司；电泳仪购自Ｂｉｏ— Ｒａｄ公司；凝胶图像分析系统购白天能公司；ＤＫ一８Ｄ ｙｍｅｒａｓｅ）在等温条件下保温３Ｏ～６０ ｍｉｎ，即可完成 链置换扩增反应＿７］。将该方法进一步与钙黄绿素体 系联用，实现可视化检测，可大大简化临床的鉴别诊 型电热恒温水槽购自上海森信实验仪器有限公司。 １．２方法 １．２．１ 病毒ＲＮＡ提取 抽提。 根据ＭｉｎｉＢＥＳＴ ｖｉｒａｌ 断流程，使结果的观察和判定具有很强的直 观性［１０１３］。 ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ ５．０说明书进行ＲＮＡ 本试验针对当前适用于ＧＮＤＶ的临床检测 方法缺失的现状，以ＧＮＤＶ Ｆ基因保守区为模 板，建立ＧＮＤＶ环介导等温核酸扩增（ＲＴ— ＬＡＭＰ）方法，并以基于钙黄绿素显色的结果为 判定标准，实现不开盖检测，减少开盖检测导致 １．２．２ 引物设计与合成 运用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件，针对ＧＮＤＶ融合蛋白Ｆ基因（ＧｅｎＢａｎｋ登 录号：ＫＪ６０７１６７．１）的保守序列设计１对ＰＣＲ引物 （Ｐ１和Ｐ２）。根据ＬＡＭＰ引物设计原理，应用在线引 物设计软件Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｏｒｅｒ ４．０针对ＧＮＤＶ Ｆ基因 假阳性的几率，以期建立一种适用于基层的检测 方法，能快速、简便、准确的检测出ＧＮＤＶ，以促 进该病的防控。 的保守区域序列进行ＬＡＭＰ引物设计。引物包括１ 对外引物（Ｆ３和Ｂ３）、１对内引物（ＦＩＰ和ＢＩＰ），引物 信息见表１。引物均由生工生物工程（上海）股份有 限公司合成。 表１ ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ引物序列 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ 引物名称Ｐｒｉｍｅｒｓ ｎａｍｅ Ｐ１ 引物序列Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５ 一３ ） ＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＡＣＣＴＴＣ Ｐ２ Ｆ３ ＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＧＧＣＴＣ ＧＡＴＧＡＣＡＡＣＡＴＧＴＡＧＡＴＧＴＧＴＡ ＣＣＣＡＡＧＣＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＴ Ｂ３ ＦＩＰ ＢＩＰ ＣＣＧＣＣＴＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＧＧＴＡＴＣＡＴＡＴＣＧＣＡＡＡＡＣＴＡＴＧＧ ＡＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＧＣＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＴＴＡＴＴＡＣＴＴＧＡＧＡＡ ２４ 中 国畜牧兽医 ４５卷 １．２．３ ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ扩增条件的优化 效果得出ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ反应的最佳Ｍｇ抖浓度。 分别按０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６ ｍｍｏｌ／Ｌ ７个 ｄＮＴＰ浓度梯度进行ＲＴ—ＬＡＭＰ反应，以优化的条 件和成分，根据扩增效果得出ＧＮＤＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ反 １．２．３．１ 钙黄绿素可视化ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ检测 方法的建立 以ＧＮＤｖ基因组ＲＮＡ为模板进行 ＲＴ—ＬＡＭＰ反应。反应体系２５ Ｌ：１０×Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ ２．５ ｕＬ，ｄＮＴＰ（２．５ ｒｎｍｏｌ／Ｌ） 应的最佳ｄＮＴＰ浓度。按照表２进行８组不同内引 物与外引物浓度比例的ＲＴ－ＬＡＭＰ反应，以优化引 物的浓度和比例，根据扩增效果得出ＧＮＤＶ ＲＴ— ＬＡＭＰ反应的最佳引物浓度。分别按０、０．２、０．４、 ０．６、０．８、１．０、１．２、１．４ ｍｍｏｌ／Ｌ ８个甜菜碱浓度梯 ３．５ Ｌ，甜菜碱（１０ ｍｏｌ／Ｌ）２．０ Ｌ，ＦＩＰ＋ＢＩＰ （１０ ｕｍｏｌ／Ｌ）２．０ ｕＬ，Ｆ３十Ｂ３（１０ ｕｍｏｌ／Ｌ）０．２５ ｕＬ， 硫酸镁（１００ ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ）１．５肚Ｌ，钙黄绿素（２５Ｏ￣ｍｏｌ／Ｌ） ５ Ｌ，氯化锰（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ Ｌ，Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶 （８ ｕ／ Ｌ）１．０ Ｌ，ＡＭＶ反转录酶（５ Ｕ／ｕＬ） 度进行ＲＴ—ＬＡＭＰ反应，以优化的条件和成分，根 ０．５ Ｌ，模板ＲＮＡ １．０ Ｌ，加灭菌ＤＥＰＣ水至 ２５ Ｌ。在６５℃反应１ ｈ后观察变色情况，每个反 应至少重复３次。 １．２．３．２ ＧＮＤＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ反应体系优化 分 别在１、２、３、４、５、６、７、８ ｍｍｏｌ／Ｌ ８个Ｍｇ抖浓度梯 据扩增效果得出ＧＮＤＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ反应的最佳甜 菜碱浓度。分别按０、０．０８、０．１６、０．２４、０．３２、０．４０、 ０．４８ Ｕ／ｕＬ ７个Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶浓度梯度进行 ＲＴ—ＬＡＭＰ反应，以优化的条件和成分，根据扩增效 果得出ＧＮＤＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ反应的最佳Ｂｓｔ ＤＮＡ聚 合酶浓度。 度进行ＲＴ—ＬＡＭＰ反应，其他成分不变，根据扩增 表２ 内外引物浓度比例 Ｔａｂｌｅ ２ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｉｎｓｉｄｅ ａｎｄ ｏｕｔｓｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ４ ８ ３ Ｏ．５ ６：１ ４ Ｏ．５ ５ Ｏ．５ ６ Ｏ．５ ＦＩＰ＋ＢＩＰ Ｆ３＋Ｂ３ ２ １ ３ １ ３：１ ２ Ｏ．５ ４：１ 比例Ｒａｔｉｏ ２：１ ８：１ １０：１ １２：１ １．２．３．３ ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ反应条件优化 设置 （１００ ｎｇ／ｕＬ）反转录为ｃＤＮＡ作为初始模板，将初 始模板进行１Ｏ倍梯度稀释（１０ 至１０ ），Ｐ１、Ｐ２ 作为上、下游引物进行ＰＣＲ。ＰＣＲ反应体系２５ Ｌ： １Ｏ×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５／，Ｌ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏ１）２ ｕＬ， ５５、５７、６０、６２、６５、６７℃６个温度梯度，在已优化的最 佳反应体系下进行ＲＴ－ＬＡＭＰ反应，根据扩增效果确 定最佳反应温度。分别设计１Ｏ、２Ｏ、３Ｏ、４Ｏ、５Ｏ、６０、７０、 ８Ｏ ｍｉｎ ８个时间梯度，在已优化的最佳反应体系下进 Ｐ１、Ｐ２（１０ ｕｍｏｌ／Ｌ）各０．５ Ｌ，Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／ｕＬ） 行ＲＴ－ＬＡＭＰ，根据扩增效果确定最佳反应条件。 ０．２５ Ｌ，模板２ Ｌ，ｄｄＨ２Ｏ补至２５ Ｌ。ＰＣＲ反应条 件：９５℃预变性３ ｍｉｎ；９５℃变性３０ Ｓ，５９℃退火 ３０ Ｓ，７２℃延伸９Ｏ Ｓ，共３Ｏ个循环；７２℃延伸１０ ｍｉｎ 产物进行２．０ ９／５琼脂糖凝胶检测。 ｌ－２．４钙黄绿素可视化ＧＮＤＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ方法的 特异性分析 以ＤＴＭＵＶ、Ｈ９亚型ＡＩＶ基因组 ＲＮＡ及ＧＰＶ基因组ＤＮＡ为模板作为特异性对 照，按优化的条件，检测该方法的特异性，同时以 ＮＤＶ Ｌａｓｏｔａ株基因组ＲＮＡ、ＧＮＤＶ为阳性对照， １．２．７临床样品检测 将疑似感染ＧＮＤＶ的阳 性样品，提取ＲＮＡ并反转录的模板作为模板，以Ｐ１、 Ｐ２为引物进行ＰＣＲ反应。ＰＣＲ反应体系２５ Ｌ： １ＯＸＰＣＲＢｕｆｆｅｒ ２．５ Ｌ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏ１）２ Ｌ，Ｐ１、 每个反应至少重复３次，反应结束后取５ Ｌ反应产 物进行２．０ 琼脂糖凝胶电泳检测。 １．２．５ 钙黄绿素可视化ＧＮＤＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ方法的 Ｐ２（１０ ｕｍｏｌ／Ｌ）各０．５肚Ｌ，Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／ｕＬ） ０．２５ Ｌ，模板２ Ｌ，ｄｄＨ２ Ｏ补至２５ Ｌ。ＰＣＲ反应 灵敏度分析 抽提ＧＮＤＶ的ＲＮＡ模板并制备 出ＧＮＤＶ标准品（１００ ｎｇ／／ｚＬ）作为初始模板，将初 始模板进行１ｏ倍梯度稀释（１０ 至１０ ），按优化 的条件进行反应。反应结果用２．０ 琼脂糖凝胶电 条件：９５℃预变性３ ｒａｉｎ；９５℃变性３０ Ｓ，５９℃退 火３Ｏ Ｓ，７２℃延伸９０ Ｓ，共３Ｏ个循环；７２℃延伸 １０ ｍｉｎ。同时以最佳的反应体系和反应时间在６５℃ 进行ＬＡＭＰ反应５０ ｍｉｎ，通过反应变色情况，判定反 泳进行检测。 １．２．６ ＧＮＤＶ ＲＴ—ＰＣＲ检测方法灵敏度分析 应结果。将ＰＣＲ反应结果与ＲＴ－ＬＡＭＰ钙黄绿素可 提取ＧＮＤＶ的ＲＮＡ模板并制备出ＧＮＤＶ标准品 视化检测方法的结果进行比较，计算符合率。 １期 刘文俊等：鹅新城疫病毒ＲＴ—Ｉ ＡＭＰ可视化检测方法的建立 ２５ 图２～７可知，最佳反应体系为：ＡＭＶ ５ ｕ／ Ｉ ， ２ 结 果 ２．１ ＲＴ－ＬＡＭＰ ＧＮＤＶ检测方法的建立 １×Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ，ｄＮＴＰ １．４ ｍｍｏｌ／Ｉ ，甜菜碱１．２ ｍｏｌ／Ｉ ，ＢＩＰ和ＦＩＰ均为 １．２ ｍｏｌ／Ｉ ，Ｂ３和Ｆ３均为０．２ ｍｏｌ／Ｉ ，钙黄绿素 ５０ ｕｍｏｌ／Ｉ ，ＭｎＣ１２ ０．８ ｒｅｔｏｏｌ／Ｉ ，ＭｇＳＯ４ ４ ｍｍｏｌ／Ｌ 以ＧＮＤＶ ＲＮＡ为模板进行ＲＴ－ＬＡＭＰ反应， 反应体系中添加钙黄绿素显色体系，通过变色进行检 测，验证检测方法的可行性。钙黄绿素法结果显示加 （共６ ｍｍｏｌ／Ｌ），Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶０．２４ ｕ／ Ｌ，模板 入ＧＮＤＶ阳性模板的反应体系出现荧光绿色结果， 而空白对照为橘黄色（图１）。结果表明，建立的钙黄 ＲＮＡ １００ ｎｇ／／￣Ｌ。在反应条件优化试验中，在５５、 ５７、６０、６２、６５和６７℃６个不同温度间进行ＲＴ— 绿素可视化ＲＴ．ＬＡＭＰ ＧＮＤＶ检测方法可行。 ＬＡＭＰ反应，结果显示，６５℃扩增条带最亮，梯形条 带分离清晰，目测阳性和阴性变色区别明显（图８）。 因此，选择６５℃为ＬＡＭＰ反应的最佳反应温度；反 应时间优化结果显示，从３Ｏ ｍｉｎ时开始即可通过琼 脂糖凝胶电泳检测到ＲＴ—Ｉ ＡＭＰ扩增产物，反应 ５０ ｍｉｎ后产物量趋于饱和（图９），因此，选定５０ ｍｉｎ 为ＧＮＤＶ ＲＴ—Ｉ ＡＭＰ的最佳反应时间。 ２．３ ＧＮＤＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法特异性分析 为确认ＧＮＤＶ ＲＴ～ＬＡＭＰ检测方法的特异 ＋，阳性样品（呈绿色）；一，阴性样品（呈黄色） ＋，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ（ｇｒｅｅｎ）；一，Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ （ｙｅｌｌｏｗ） 性，用优化的条件，以ＤＴＭＵＶ、Ｈ９亚型ＡＩＶ、 ＧＮＤＶ和ＮＤＡ Ｌａｓｏｔａ株基因组ＲＮＡ及ＧＰＶ基 ７ ５ ２ ● ∞ ∞的∞ 的 ∞ 图１ ＧＮＤＶ Ｒ￣ＬＡＭＰ检测方法的建立 Ｆｉｇ．１ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ 因组ＤＮＡ为模板进行ＬＡＭＰ方法检测。结果表 明，ＧＮＤＶ和ＮＤＶ Ｌａｓｏｔａ株为阳性，其余病原均 为阴性（图９），表明所建立的ＧＮＤＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ 检测方法具有良好的特异性。 ２．２ ＲＴ－ＬＡＭＰ扩增条件的优化 对镁离子、甜菜碱、ｄＮＴＰ、Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶及 内外引物的比例进行优化，优化结果见图２～７。由 Ｍ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ Ａ Ｂ ①Ａ。钙黄绿素法显色结果；Ｂ，凝胶电泳检测结果 图３～８同。②Ｍ，ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１～８。ＭｇＳＯ｛浓度依次 为１、２、３、４、５、６、７、８ ｍｍｏｌ／Ｉ ①Ａ．Ｃａｌｅｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅｓｕｌｔｓ；Ｂ，Ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｔａｂｌｅｓ ３ ｔＯ ８．②Ｍ．ＤＩ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１－８，Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＭｇＳＯ４ ｗｅｒｅ ｌ，２，３，４，５．６，７ ａｎｄ ８ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ 图２ Ｍｇｓ（）４浓度的优化 Ｆｉｇ．２ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ［ｇＳ０４ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ２６ 中 围畜牧 兽医 Ｍ ｂｐ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ １５卷 ２０００ １０００ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ７５０ ５００ ２５０ ｉ００ Ａ Ｂ Ｍ，ＤＩ ２０００ Ｉ）ＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；ｌ～７．ｄＮＴＰ浓度依次为０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６ ｍｍｏＩ／Ｉ Ｍ．ＤＩ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１ ７．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄＮ ＦＰ ｗｅｒｅ（）．４．０．６．（）．８．１．（】．１．２．１． Ｉ ａｎｄ １．６ ｒｅｔｏｏｌ／Ｉ －ｒｅｓｐｅｃｔｉｖ￣、ｌｙ 图３ ｄＮＴＰ浓度的优化 Ｆｉｇ．３ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄＮＴＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｍ ｂｐ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ２０００ １０００ ７５０ ５００ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ２５０ １００ Ａ Ｂ Ｍ，Ｉ）Ｉ ２０００ １）ＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１～８，内外引物浓度比依次为１：１、２：１、３：１、４：１、６：１、８：１、ｌ０：１、ｌ２：１ Ｍ．Ｉ）Ｉ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；ｌ一８。Ｔｈｅ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｏｕｔｅｒ ａｎｄ ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｌ：１，２：１．３：ｌ＿４：１－６：１·８：１，ｌ０：１ ａｎｄ １ ２：１．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ 图４ 内外引物浓度比例的优化 Ｆｉｇ．４ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｏｕｔｅｒ ａｎｄ ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｍ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ｂｐ ２０００ １０００ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ７５０ ５００ ２５０ ｉ００ Ａ Ｂ Ｉ６、０．２４、０．３２、０．４０、０．４８ Ｕ／ｔｄ Ｍ。Ｉ）Ｉ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１～７，酶的浓度依次为０、０．０８、０． ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｗｅｒｅ ０．０．０８．０．１６，０．２４．０．３２，０．４０ ａｎｄ Ｍ．ＤＩ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１ ７．【、０ｎｃｅｎｔｒ ｒｌｔｉｏｎ Ｏｆ Ｂｓｔ ＤＮＡ ０．４８ Ｕ Ｉｉｉ ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ 图５ Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶浓度的优化 Ｆｉｇ．５ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｌ期 刘文俊等：鹅新城疫病毒Ｒ２ Ｉ ＡＭｔ’叮视化检测方法的建立 ２７ ｌ — ５ ＋ ～ ＋ 一 ＋ ＋ ～ ＋ ６ ！ —· 曼 上—— ＋ Ａ 圈 ４ ５ —＝ ６ —＝ ７ —＝ ８ Ｊ一 —： ｂｐ ２０００ １０００ ７５０ ５００ ２５Ｏ １Ｏ０ Ｂ ①＋，阳性样品；一。阴性样品。图７、８同。②Ｍ。ＤＩ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１～８，甜菜碱的浓度依次为０、０．２、０．４、０．８、 ｌ＿０、１．２、１．４ ｍｏｌ／Ｉ ①＋．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ．一，Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ．②Ｍ．ＤＩ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；ｌ＿８。Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｅｔａｉｎｅ ｗｅｒｅ ０，０．２， ０．４，０．８，ｌ＿０，１．２ ａｎｄ １．４ ｍｏｌ／１ ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ 图６甜菜碱浓度的优化 Ｆｉｇ．６ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ １ ２ ３ ４ ５ ＋ 一 ＋ ６ Ａ Ｍ士ｂｐ ２０００ 士士 ａ ６ １０００ ７５０ ５００ ２５０ １０Ｏ Ｂ Ｍ．ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；ｌ～６，５５、５７、６Ｏ、６２、６５、６７℃ 图７ ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ反应温度的优化 Ｆｉｇ．７ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ ２８ 中 国 畜牧兽医 ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ Ｆ——一二 —＿ —＿ —＿ —＿＿干—＿ —— 加 加７ ５ ２ ∞∞趵∞ ∞ ∞ ｍ ７ ５ ２ １ ∞ ∞∞∞ ∞ ∞ 士 士 士 Ａ 圈 Ｍ．Ｉ）【 ２Ｏ００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１～８．１０、２０、３０、４０、５０、６Ｏ、７０、８Ｏ ｒａｉｎ 图８ ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ反应时间的优化 Ｆｉｇ．８ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ 士 士 ＲＴ—ＰＣＲ检测方法检测的阳性样品为７份，阳性率 为２８％。应用ＲＴ—Ｉ ＡＭＰ方法检测的阳性样品为 ８份，阳性率为３２ ９／６。两种方法的符合牢为９６ （表３）。 ３ 讨 论 ＮＤ是一种禽烈性传染病。最早发现于１９２６ 年。该病在世界范围内肆虐传播，在禽流感出现以 前，曾是养禽业的头号疾病 。其宿主范围极大． Ｍ，ＤＩ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１～５，（；ＮＩ）Ｖ、ＮＤＶ Ｉ ａｓｏｔａ、Ｈ９ 亚型ＡＩＶ、（ ＰＶ、ＤＴＭＵＶ Ｍ．ＤＩ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１—５．ＧＮＤＶ，ＮＤＶ Ｉ ａｓＯｔａ． Ｈ９ ｓｕｂｔｙｐｅ ＡｌＶ，ＧＩ Ｖ ａｎｄ Ｉ）ＴＭＵＶ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ 除鸡、鸽、孔雀、鹅等２５０多种鸟类外，还有感染猪 的报道，由此可预见，未来ＮＤ的防控局而仍然严 峻＿】 。水禽养殖业是农业产业的重要组成部分， 图９ ＧＮＤＶ ＲＴ－Ｉ ＡＭＰ检测方法特异性分析 Ｆｉｇ．９ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＧＤＮＶ ＲＴ·Ｉ ＡＭＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ 以广东地区为例：鸭年均饲养量２．５亿只，鹅年均 饲养量７ ０００万只¨引。目前，ＧＮＤ严重危害养水 禽业的健康发展，造成的损失仅次于人ＩＶ。此外． ２．４ ＧＮＤＶ ＲＴ—Ｉ ＡＭＰ检测方法灵敏度分析 对ＧＮＤＶ基因组ＲＮＡ进行１０倍梯度稀释试 验表明，钙黄绿素可视化ＲＴ Ｉ ＡＭＰ检测方法与 ＲＴ－Ｉ ＡＭＰ琼脂糖凝胶电泳检测方法灵敏度一致，最 低检测限度为１Ｏ ｐｇ比ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的１００ Ｐｇ 灵敏度高１０倍（图１０）。 ２．５ ＧＮＤＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法的临床应用研究 由于水禽是ＮＤＶ的天然储存宿主，一些中低毒力 毒株在传播过程中，可能会基凶突变．毒力不断加 强。只有清除了水禽ＮＤＶ，才能彻底的消灭该疾 病的威胁。由于ＧＮＤＶ与ＮＤＶ其他基因型毒株 同源性较差，传统ＮＤＶ疫苗和诊断方法的使用效 果较差，而针对性的疫苗和检测方法研发进展 缓慢 ”ｊ。 将临床研究采集的２５份疑似病料进行ＲＴ— ＰＣＲ和ＲＴ—Ｉ．ＡＭＰ方法检测。由表３可知，应用 １期 刘文俊等：鹅新城疫病毒ＲＴ Ｉ ＡＭＩ ｒ，Ｊ．挑化检测 法的建曲 ２９ Ｍ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ Ｍ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ｍ ７ ５ ２ ∞∞∞∞的∞ ０～ Ａ 一≈ ２ ３ ４ ≮ ５ ６ ７ ８ Ｂ ９ 警 霉 蘸 ０ 一 墨 ７ ５ ２ ● 。 Ｃ ①Ａ．ＲＴ ＰＣＲ检测方法；Ｂ，ＲＴ Ｉ ＡＭＰ检测方法；ｃ．钙黄绿素町视化ＲＴ—ＬＡＭＩ 检测方法。②Ｍ，ＤＩ ２０００ ＤＮＡ ∞ ∞舳∞ ∞ ∞ Ｍａｒｋｅｒ；１～８，稀释度分别为１０ 至１０ ；９，阴性对照 ①Ａ．ＲＴ—ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｂ，ＲＴ Ｉ ＡＭＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｌ’，Ｒ Ｆ—Ｉ ＡＭＰ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｌｃｅｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ 罄 ■ ｍｅｔｌｍｄ．（２）Ｍ，ＤＩ ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１ ８．Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｗａｓ １０ １０ １０ ；９，Ｎｅｇａｔ１ｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ 图１０ ＧＮＤＶ ＲＴ—ＬＡＭＰ检测方法灵敏度分析 Ｆｉｇ．１０ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ 表３ ＧＮＤＶ ＲＴ－Ｉ ＡＭＰ检测方法的临床应用 Ｔａｂｌｅ ３ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＮＤＶ ＲＴ－ＬＡＭＰ 一 好、灵敏度高的特点，灵敏度是普通ＰＣＲ的１０～ １（）（）倍。最重要的是反应十分迅速，在６０ ｍｉｎ之内 即可完成试验。目前，已有多种疾病Ｉ ＡＭＰ诊断方 法建 的报道ｌ】 。 虽然之前已经有ＮＤＶ Ｉ ＡＭＰ检测方法建立的 报道ｌｎ Ｉ，但Ｉ ＡＭＰ引物设计复杂，难以在一个短的 区间内对ＮＤＶ和ＧＮＤＶ进行准确的鉴别诊断，以 禽养殖场一般地处偏远，实验室大型检测仪器 不方便携带，常用ＰＣＲ、实时荧光定量ＰＣＲ等分子 生物学诊断方法基本不能在现场使用。疾病发生 后，往往只能依靠剖检病禽，观察病理损伤来诊断疾 ＮＤＶ为模板建立的检测方法，在ＧＮＤＶ的检测中 难免出现以偏概全和漏检的情况。此外，水禽是 ＮＤＶ的储存库，开发一种以ＧＮＤＶ为模板的能兼 顾其他基因型ＮＤＶ的检测方法有更大的应用前 病。即使在实验室中，传统分子生物学诊断方法虽 然准确，但也有耗时较长的缺点。而Ｅｌ ＩＳＡ检测试 剂盒价格较贵，且部分产品的稳定性较差，假阳性、 景。本试验比对了ＧｅｎＢａｎｋ上已发布的毒株，选择 厂６个相对保守的区间，以ＧＮＤＶ毒株为模板设计 通用引物，使之理论上能检测各种基因型的ＮＤＶ。 假阴性的情况十分突出。病原的分离鉴定，实际操 作起来费时费力，难以应付突发的疾病。因此，建立 一为＿ｒ降低漏检率，没有增加设计环引物来提高反应 速率。研究通过测试多对引物，使总体反应时间控 种简单、快速、准确、高效、且特异性好、灵敏度高、 的迫切需求。Ｉ ＡＭＰ是一种理想的诊断方法。该 制在５０ ｍｉｎ结束，以满足快速检测的需求。研究表 明，ＲＴ—Ｉ ＡＭＰ的反应条件和体系直接影响了检测 的特异性和敏感度，如内外引物的浓度、Ｍｇ。一浓度 可在临床使用的检测方法是当前兽医临床疾病诊断 方法简便易行，无需复杂的仪器，仅需一个水浴锅或 一及酶浓度等。因此，本试验对建立的ＧＮＤＶ ＲＴ— Ｉ．ＡＭＰ检测方法进行体系和条件的优化。另外，在 个温度计和保温瓶即可进行。该方法具有特异性 ３０ 中 国 畜 牧 瞥 医 １ ５巷 临床样本的检测中，ＬＡＭＰ检测方法与ＰｅＲ检测 方法的检出率符合率达９６ ，说明建立的检测方法 稳定町靠、特异性强、敏感度高。 本研究建立的钙黄绿素可视化ＧＮＤＶ ＲＴ ＬＡＭＰ快速检测方法，只需在水浴锅中恒温６５℃ 反应５０ ｒａｉｎ，通过肉眼辨别反成产物的颜色即可判 定结果。相较于观察白色沉淀判定反应结果的方 法，该方法更直观、准确且尤特殊设备的要求。检测 过程无需开盖，很大程度地避免了污染的可能。目 前ＮＤＶ国标的检测方法是ＲＴ—ＰｅＲ检测法，ＰＣＲ 反应时问为６２。５ ｍｉｎ。加上琼脂糖凝胶电泳的时 间，总时间超过９０ ｍｉｎ。本方法较之节约了一半的 反应时间．疗法灵敏度也有较大提高。 ４ 结 论 本试验建立的钙黄绿素可视化ＧＮＤＶ ＲＴ— Ｉ．ＡＭＰ检测方法，可用于禽类ＮＤＶ流行情况的初 步筛查、进出口贸易中ＮＤＶ的快速检测及水禽中 ＮＤＶ的净化，该方法稳定、高效具有良好的应用 前景。 参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）： ［１］ 殷震，刘景华．动物病毒学［Ｍ］．第２版．北京：科 学出版社，ｌ９９７． ＹＩＮ Ｚ，ＬＩＵ Ｊ Ｈ．Ａｎｉｍａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ［Ｍ］．Ｔｈｅ ｓｅｃ ｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ，ｌ ９９７．（ｉｎ（：ｈｉ— ｎｅｓ０） ［２］ 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０．，’Ａｎｉｍａ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ“ｎｄ Ｖｅｔｅ￣ ｉｎａ，。、．Ｍ“， （ｉｍ，． ２００８，１０：３９—４１．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［７］ Ｎ（）Ｔ（）Ｍ１ Ｔ，（）ＫＡＹＡＭＡ Ｈ，ＭＡＳＵＩ｛Ｕ（、ＨＩ Ｈ． ｅｌ ａ１． １．ｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉ ｃ、ａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ［Ｊ］．ＮⅢｌｅｉ ｃ Ａ（ｉｄｓ Ｒｅｓｅａ，一（ｈ．２０００．２８（１ ２）： Ｅ６３． ［８］ 吴禹熹，李璞君，王娟，等．ＬＡＭＩ ‘法及 病 微生物检测中的应用［Ｊ］．叶１困肃牧 医，２（）１ ６， ４３（２）：３８９—３９３． ＷＵ Ｙ Ｘ，Ｉ Ｉ Ｐ Ｊ，ＷＡＮＧ Ｊ，ｅｔ ｆｌ【＿Ｉ ＡＭＩ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｎ１ｉ ｒ（１Ｉ）ｉ（）ｌ（）ｇｉｃ，ｌＩ ｄｃ ｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］ （７１１ｉｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄ￣ １，ｆｅ ｇ￣．ｔｅｔ’ｉｎａｒ ｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０ｌ ６，４３（２）：３８９—３９３．（ｉｎ【、ｈｉｎｅｓｅ） ｒ ９］ 张 黎，李 凯，田光玲，等．猪细环病毒２ 环介 导等温扩增检测方法的建立［Ｊ］．一｝ｔ Ｉ闷斋牧 ． ２０１５．４２（５）：ｌ０９８ １１０３． ＺＨＡＮＧ Ｉ，，Ｉ Ｉ Ｋ，ＴＩＡＮ（ Ｉ ．ｅｔ ａ１．Ｅｓｔａｔｌｆｉｓｈｍ￣ ｎｔ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｌｅｔｅｃｌｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｅｒｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２［Ｊ］．（、，２ｉｎａ Ａｎｉｎｔａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ＆．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ＾ （ｉｎｅ，２０１ ５，４ ２（５）： ｌ０９８ １１０３．（ｉｎ【．＇ｈｉｎｅｓｅ） ［１０］ ＣＨＥＮ Ｉ ，ＪＩＡ（）Ｚ，Ｉ，１Ｕ Ｄ，ｅｔ ａ１．（）ｌｌｅ ｓｔｅｐ ｒｅｘ，ｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｉｚｅ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｎｌｏｌ１１（、、ｒｉ ｒＩｌ ｉｎ ｍａｉｚｅ ＥＪ］．Ｊｏｌ４ｒｔｌａｌ ｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｉ￣ａｌ ＭｆＪｔｋｏｄｓ．２Ｏ１ ７． ２４０：４９—５３． ［１１］ 赵明秋，王伟芳．王 波，等．猪瘟病靠Ｉ叮视化Ｉ Ｔ ＩＡＭＰ检测方法的建立［Ｊ］．广尔南牧 【廷科技． ２０１１，２：２６－２８． ＺＨＡＯ Ｍ Ｑ，ＷＡＮＧ Ｗ Ｆ，ＷＡＮＧ Ｂ，ｃｔ ａ１．Ｅｓｔａｈ— ｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＲＴ Ｉ ＡＭＰ ｄｅｔｅｃｌｉｏｎ ｍｅｔｈｏ（１ ｆｏｒ ｌａｓｓｉｃ ｒｊ１ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｊｏｕｒ！ｌｕｌ ｏ／Ａｎｉｍａ／ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｉｅｍ ｅ．２０Ｉ１，２：２６ ２８．（ｉｎ（、ｈｉ ｎｅｓｅ） ［１２］ 孙鑫．町视化ＬＡＭＰ技术检测转 ｊ打ＮⅢ肚 方法的建立［Ｄ］．长春：吉林大学，２（）１ ． ＳＵＮ Ｘ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｉ ＡＭＰ ｔ ６１Ｃｈ ｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｉｇ Ｎｅｏ ｇｅｎｅ Ｌ Ｉ）］． Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ：Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１５．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１３］ 汤小真，陈露微，卢荣彬，等．基于钙数绿索｛Ｉｌ！色的 １期 刘文俊等：鹅新城疫病毒ＲＴ—ＬＡＭＰ可视化检测方法的建立 ３１ 可视化ＬＡＭＰ检测猪流行性腹泻病毒的研究［Ｊ］．中 国畜牧兽医，２Ｏ１５，４２（２）：３３１—３３６． ＴＡＮＧ Ｘ Ｚ，ＣＨＥＮ Ｌ Ｗ，ＬＵ Ｒ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｓｕａｌ ＬＡＭＰ ｏｆ ｃａｌｃｉｎｅ ｇｒｅｅｎ ｐｉｇｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０ １ ５， ４２（２）：３３１－３３６．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１４３ 丁壮．新城疫流行病学新特点及鹅新城疫防控策 略［Ｊ］．兽医导刊，２０１４，１７：３８—４０． ＤＩＮＧ Ｚ．Ｎｅｗ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｇｏｏｓｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｏｒｉｅｎｔａ— ｔｉｏｎ，２０１４，１７：３８—４０．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１５］ 徐风宇，李淑君，高云航，等．鹅新城疫新型疫苗研 究进展［Ｊ］．中国兽药杂志，２０１３，４７（３）：６３—６６． ＸＵ Ｆ Ｙ，ＬＩ Ｓ Ｊ，ＧＡ０ Ｙ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｏｆ ｇｏｏｓｅ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇｓ，２０１３，４７（３）：６３～６６． （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） Ｅ１６］ 张辉玲，崔建勋，白雪娜，等．２０１５年广东水禽产业发 展形势与对策建议［Ｊ］．广东农业科学，２０１６，６：１—６． ＺＨＡＮＧ Ｈ Ｌ，ＣＵＩ Ｊ Ｘ，ＢＡＩ Ｘ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｗａｔｅｒｆｏｗｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ｉｎ ２０１５［Ｊ］．Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１６， ６：１—６．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） Ｅ１７］ 刘华雷，郑东霞，孙承英，等．１９９７－－－２００５年中国水 禽新城疫分子流行病学特点分析［Ｊ］．畜牧兽医学 报，２００９，４１（１）：１４５—１４８． ＬＩＵ Ｈ Ｌ，ＺＨＥＮＧ Ｄ Ｘ，ＳＵＮ Ｃ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｎｅｗ ｗａｔｅｒｆｏｗｌ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｆｒｏｍ １９９７ ｔｏ ２００５［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｖｅｔ— ｅｒｉｎａｒｉａ ｅｔ Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２００９ ４１（１）：１４５— １４８．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１８３ 李家伟，郭 利，杨 勇，等．牛病毒性腹泻病毒 ＬＡＭＰ检测方法的建立与应用［刀．中国畜牧兽医， ２Ｏ１５，４２（１２）：３１１１—３ｌｌ８． ＬＩ Ｊ Ｗ，ＧＵ０ Ｌ，ＹＡＮＧ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＡＭＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ＆Ｖｅｔ— ｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，４２（１２）：３１１１～３ｌ１８．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［１９］ ０ＬＯＮＩＮＩＹ１ ０ Ｋ，ＫＵＲＯＳＡＫＩ Ｙ，ＭＩＹＡＭＯＴＯ Ｈ， ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ ｋｎｏｗｎ ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｌｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉ— ｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＴ—ＬＡＭＰ）［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆⅥｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１７，２４６：８—１４． Ｅ２ｏ］ ＣＨＩ Ｙ。ＧＥ Ｙ，ＺＨＡＯ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅｖｅｒｓｅ－ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＣＯＵ～ ｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｓｃａｄｅ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｈｙ～ ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎ～ ｔｉｆｉＣＲｅｐｏｒｔｓ，２０１７，７：４４９２４． ［２１］ ＬＥＥ Ｓ Ｈ，ＢＡＥＫ Ｙ Ｈ，ＫＩＭ Ｙ Ｈ，ｅｔ ａ１．０ｎｅ－ｐｏｔ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉ— ｃａｔｉｏｎ（ＲＴ＿ＬＡＭＰ）ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＭＥＲＳ－ＣｏＶＥＪ］．Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１６，７：２１６６． ［２２］ 孔令辰，侯佳蕾，蒋文泓，等．应用环介导逆转录等 温扩增技术快速检测新城疫病毒口］．华南农业大学 学报，２００８，２９（４）：７５－７８． ＫＯＮＧ Ｌ Ｃ，Ｈ０Ｕ Ｊ Ｌ，ＪＩＡＮＧ Ｗ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ａ ｐｐｌｉｃａ— ｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃ ｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｓｏｔｈｅｒ— ｅｒａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｒａｐｉｄｌｙ ｄｅｔｅｃｔ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌ— ｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８，２９（４）：７５—７８．（ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） （责任编辑董晓云）
