《植物生物学实验》
逆境胁迫水稻幼苗及其生理指标分析
实验一：水稻幼苗对盐胁迫的反应
实验二：用氮蓝四唑法(NBT)测定植物SOD活力
实验一：水稻幼苗对盐胁迫的反应
一、实验目的
➢了解植物如何对逆境胁迫产生反应。➢观察分析水稻幼苗盐胁迫后发生的形态生
理指标变化，用于指导农业生产。
二、实验原理
逆境或胁迫（Stress）：对植物产生伤害的环境。
生物因素
病害虫害杂草
逆境胁迫
非生物因素
温度：低温(冷害、冻害)，高温热害水分：干旱，湿害、涝害盐害酸雨
紫外线（UV）营养亏缺、重金属
逆境胁迫对植物伤害的表现
形态变化：生长停滞，叶片萎蔫、卷曲、变黄、枯死等。
生理生化：叶绿素含量减少，光合速率下降，呼吸速率下降或升高，细胞膜系统破坏，酶活性紊乱等。
植物对逆境胁迫的适应
适应方式：
避逆性（stress avoidance）：植物会在时空上躲避开不良环境，如沙漠植物只在雨季生长、阴生植物在树荫下生长等。耐逆性（stress tolerance）：植物能够忍受逆境的作用。形态生理变化：
形态变化：如干旱条件下叶小、根系发达；
淹水时扩大根部通气组织；
冬季低温来临前生长停止、进入休眠等。
生理变化：
1. 生物膜结构改变，形成胁迫蛋白，如热激蛋白、抗冻蛋白等。
2. 保护酶系统受破坏
由超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等组成的保护酶系统会降低或消除活性氧的危害。
正常情况下，细胞内自由基的产生和清除处于动态平衡状态，自由基水平很低，不会伤害细胞。
遭受逆境胁迫时，细胞内自由基积累过多，保护酶系统被破坏，产生许多有害的过氧化产物如丙二醛，会伤害细胞。自由基会破坏膜
结构，损伤大分子生命物质，引起一系列生理生化紊乱，导致植物死亡。
活性氧：阴离子自由基、羟基自由基(-OH)、过氧化氢
(H2O2)、单线态氧(1O2)，具有很强的氧化能力、对许多生物功能分子有破坏作用、引起膜的过氧化作用。自由基：具有未配对价电子的原子或原子团。
天然的非酶自由基清除剂有维生素E、谷胱甘肽、抗坏血酸、类胡萝卜素等。
3. 增加渗透调节物质，有利吸水：糖、有机酸、一些无机离子如K+，其中最有效的是脯氨酸。4. 增加脱落酸(ABA)含量。
植物盐胁迫
盐胁迫（盐害）：土壤盐分过多对植物造成危害。通常土壤含盐量达0.2-0.5%时就不利于植物生长，主要盐分：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠等。盐土：氯化钠和硫酸钠较多的土壤。碱土：碳酸钠和碳酸氢钠较多的土壤。
盐碱土：含盐量0.6-10%。
若盐胁迫强度较小，除盐后，植物生长可以恢复；若盐胁迫强度较大，除盐后，植物生长不可恢复
盐害
植物对盐胁迫的适应
根据植物抗盐能力大小分为：
盐生植物：耐盐范围1.5-2.0%，如碱蓬、芦苇、红树植物等。
甜土植物（非盐生植物）：耐盐范围0.2-0.8%，如甜菜、高粱等大多数农作物。
盐生植物的避盐机制
避盐：植物通过某种方式将细胞内盐分控制在伤害阈值之下，以避免盐分过多对细胞伤害。
泌盐：植物通过茎、叶上专门分泌盐分的盐腺(或盐囊泡)将盐分分泌到体外，减少或避免盐分对植物的伤害，如红树植物。
泌盐的红树植物（盐腺）
盐生植物的避盐机制
泌盐：植物通过茎、叶上专门分泌盐分的盐腺(或盐囊泡)将盐分分泌到体外，减少或避免盐分对植物的伤害，如红树植物。
稀盐：植物通过吸收大量水分和加速生长，稀释细胞内盐分浓度，并将盐分积累在茎叶的肉质化组织，维持体内盐分浓度的恒定，如碱蓬。
稀盐的碱蓬（肉质化）
盐生植物的避盐机制
泌盐：植物通过茎、叶上专门分泌盐分的盐腺(或盐囊泡)将盐分分泌到体外，减少或避免盐分对植物的伤害，如红树植物。
稀盐：植物通过吸收大量水分和加速生长，稀释细胞内盐分浓度，并将盐分积累在茎叶的肉质化组织，维持体内盐分浓度的恒定，如碱蓬。
拒盐：植物对盐有一定的选择性吸收，并能将盐分重新分配在植物的安全部位，从而降低盐分对地上部的伤害，如芦苇、灯芯草。
拒盐的盐生植物
芦苇——地上部分拒盐灯芯草——地上部分拒盐
植物盐胁迫伤害的表现
生理干旱：土壤中盐分过多使土壤溶液水势下降，导致植物吸水困难，甚至体内水分有外渗的危险，造成生理干旱。离子失调：植物由于过多吸收某种盐类而排斥对另一些矿质盐的吸收，导致营养缺乏或产生毒害作用。
代谢破坏：叶绿体解体、光合速率下降；蛋白质合成受抑制、分解加强，产生有毒物质，对细胞产生毒害。
膜透性改变：高浓度NaCl可置换细胞膜结合Ca2+、K+，膜结构破坏、功能改变，细胞内K+、有机质等外渗。
三、实验试剂与材料
➢试剂：氯化钠
➢主要仪器与器皿：电子天平，低温冰箱，烧杯，容量瓶，量筒，PE手套等。➢材料：水稻幼苗
➢胁迫方式：盐胁迫，配制浓度0~0.3mol/L。
四、实验步骤
1. 自己设计配制2个不同盐浓度的NaCl溶液并设置对照(CK)。2. 挑选生长整齐一致的水稻秧苗60-90株，然后随机取10-15株
于1个烧杯中，观测记载描述盐胁迫处理前各杯水稻秧苗的农艺形态性状(如苗高、叶片颜色、叶片数等)。
3. 各杯分别加入不同浓度NaCl溶液50ml左右（原则：根系要浸入溶液中），然后放置在实验架上进行盐胁迫处理12-24 h。4. 当高盐度处理的秧苗叶片开始出现卷曲时，观测记载各杯秧
苗农艺形态性状的变化，然后将各杯的秧苗叶片分别剪下，各杯随机称取少量叶片0.2-0.5g，放入PE手套中并做好标记，置于冰箱冷冻保存备用。
五、实验分组
四个人组成一个小组进行水稻幼苗盐胁迫反应实验。
每小组设置3个处理：1个对照和2个不同盐浓度，每处理2个重复，共6份样品。
注意每杯要做好自己的标记、写上组别或姓名。
预习下周实验：应用氮蓝四唑（NBT）法测定植物超氧化物歧化酶（SOD）的活力。
《植物生物学实验》
逆境胁迫水稻幼苗及其生理指标分析实验二：用氮蓝四唑（NBT）法测定植物超氧化物歧化酶（SOD）活力
一、实验目的
学习掌握用氮蓝四唑（NBT）法来测定植物超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）的活力。了解不同盐浓度胁迫对水稻幼苗叶片SOD酶的影响。
二、实验原理
SOD发现：
1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到SOD。SOD分布：
广泛分布在各种生物体内，其活性高低可作为抗衰老的指标。
SOD类型：
SOD是含Cu、Zn、Mn、Fe金属元素、能清除超氧阴离子自由基的酶，其类型有Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。
SOD测定方法
直接法：脉冲辐射分解法、电子顺磁共振波法、核磁共振法。
间接法（化学法）：邻苯三酚自氧化法、细胞色素C还原法、羟胺法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素法等。
免疫法：放射免疫法、化学发光免疫分析法、ELISA法等。
超氧阴离子自由基寿命短，不稳定，不易直接测定SOD活性，因而采用间接法测定。
常用有3种：氮蓝四唑光化还原法、邻苯三酚自氧化法、化学发光法。
NBT法测定SOD酶活性的原理
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，还原的核黄
素极易再氧化而产生氧自由基，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm处有最大吸收。而SOD可清除氧自由基，从而抑制了甲腙的形成。
光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。酶单位/样品量=
核黄素：在有氧物质存在下，还原的核黄素与氧反应产生氧自由基。
氮蓝四唑(NBT)：氧自由基将无色(或微黄)的NBT还原为
蓝色甲腙。
甲硫氨酸：提供核黄素的还原反应所需的电子供体，使得核黄素的光激发还原反应得以进行。
SOD酶：SOD通过催化氧自由基歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色甲腙形成。SOD催化反应如下：
OO2HH2O2O2•2•2SOD盐胁迫对植物叶片SOD酶的影响
（1）在一定盐度的胁迫下，植物叶片中SOD活性随盐浓度的升高而增强。
（2）SOD酶能有效抑制膜脂过氧化作用，具有一定的保护作
用。因此，盐胁迫的损伤在一定范围内是可以修复。然而，膜系统的修复与SOD、CAT、POD等抗氧化酶的活性和抗坏血酸(ASA)、谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物含量的变化密切相关。
二、实验材料、仪器与试剂
材料：水稻幼苗盐胁迫处理后的叶片。
仪器设备：电子天平，高速台式离心机，分光光度计，移液器，荧光灯（反应试管处照度为4000Lx），试管数支，研钵，烧杯，离心管，量筒等。试剂：
SOD抽提液：50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）14.5mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：现配现用。
2.25mmol/L 氮蓝四唑溶液（NBT）：避光保存，现配现用。60μmol/L 核黄素溶液：避光保存，现配现用。3μmol/L EDTA－Na2溶液
主要试剂配制（供参考）：
（1）50mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.8）：A液：NaH2PO4· 2H2O（分子量156.01）：3.12g溶于蒸馏水，定溶至100ml。B液：Na2HPO4· 12H2O（分子量358.14）：7.17g溶于蒸馏水，定溶至100ml。
取A液8.5ml与B 液91.5ml混合，定容至400ml，pH7.8。（2）SOD提取液：50mmol/L磷酸缓冲液[含0.1mmol/L EDTA；0.3%(w/v) Triton X-100；2-4%（w/v）聚乙烯聚吡咯烷酮（PVP）, pH7.8]。
即每升磷酸缓冲液中加20g PVP，200μl 0.5mol/L的EDTA母液，3ml Triton X-100。
（3）14.5mmol/L 甲硫氨酸（分子量149.21）：
称2.163g溶于蒸馏水，定溶至1000ml(较难溶，需稍微加热）。
（4）2.25mmol/L NBT（分子量817.7）：
称92mg溶于50ml 50mM磷酸磷酸缓冲液（pH7.8），现配现用，避光保存。
（5）60μmol/L 核黄素（分子量376.36）：
称2.25mg溶于50ml 50mM磷酸磷酸缓冲液（pH7.8），现配现用，避光保存。
（6）3μmol/L EDTA-Na2（分子量372.24）：A、0.5mol/L ：称9.306g溶于蒸馏水，定容至50ml。（注意：搅拌时用NaOH调pH至8.0才能完全溶解）。B、0.5mmol/L ：取A液1ml用蒸馏水稀释定容至1000ml。C、3μmol/L ：取B液3ml用磷酸缓冲液稀释定容至500ml。
三、实验步骤
1.酶液提取：
将经盐胁迫处理、称好保存的水稻叶片0.2-0.5g置于预冷的研钵中，加1-2ml预冷的SOD提取液在冰浴上研磨成浆，并转移到离心管中，再用提取液
清洗研钵，每次1ml，转移到同一离心管中，终体积不超过4ml；于6000-8000rpm下离心5-10 min，
上清液即为SOD酶粗提液，置于冰箱保存备用。
2. 反应体系
试剂
50 mMSOD提取液14.5 mM甲硫氨酸2.25mM NBT3 μM EDTA-Na260 μM 核黄素蒸馏水酶液总体积
用量（ml/管）
1.50.30.30.30.30.25
0.05 （2支对照管以提取液代替酶液）3.0
3. 做预实验：在正式测定SOD活性之前，要进行酶液加入量的预实验，
以确定最佳酶液浓度。
酶液稀释：取其中一管酶液按1倍、10倍、100倍稀释。
混合液配制：计算4-5支试管的用量，按反应体系表中各溶液(除酶液外)配制1份混合液(现用现配)。
加酶液：在每支试管中加混合液2.95ml，再分别加入相对应的酶液量，
其中2支空白对照用提取液代替酶液，混匀，马上用黑色塑料袋罩住。照光反应：取1支对照管于暗处，其余的置于试管架上，于4000Lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，光照时间视具体情况而定，
如光照强、温度高则时间缩短，反之则延长，时间要严格控制）。今天实验的照光时间约2-5min左右。
终止反应：照光完毕马上用黑色塑料袋罩住试管架，以终止反应。
SOD活性测定：以不照光的对照管做空白，分别测定各管OD值。确定酶液加入量：以抑制率在35%-65%为佳。
4. 正式实验
准备6支相同型号的试管：4支样品、2支对照。
混合液配制：按6-8支试管的用量配制（同预实验）。加酶液：各管加入混合液2.95ml，4支分别加入相对应的酶
液量，2支对照管用提取液代替，混匀，遮光。
照光反应：取1支对照管置暗处，其余各管进行照光反应，
时间根据预实验进行调整。
终止反应：照光完成后，迅速用黑色垃圾袋罩住试管架，终止反应。
SOD活性测定：以不照光的对照管做空白调零，逐一迅速
测定各管在560 nm处的OD值。
四、结果计算
一个SOD酶活性单位的确定：
按最初测定SOD活性时的设计，以能抑制反应50%的酶量为一个SOD酶活性单位。如NBT在光照下被还原
为蓝色甲腙，检测OD560=0.5；但在反应系统中加入酶，SOD催化歧化为H2O2和O2，与NBT竞争，部分抑制了
NBT还原成蓝甲腙的反应，检测OD560=0.25，NBT的光化还原刚被SOD抑制50%，则此时加入的酶量为一个
SOD酶单位。
计算SOD活性：
SOD总活性：以每克鲜重酶单位表示。
SOD比活力：以酶单位／mg蛋白表示。
ACK：照光对照管的吸光度；AE：样品管的吸光度；V：样品液总体积（ml）；Vt：测定时样品用量（ml）；W：样品鲜重（g）。
蛋白质浓度单位：mg蛋白／g鲜重。
五、注意事项
研磨样品时提取液要分次加入，用提取液洗研钵，并全部转移到离心管中，控制总量不要超过4ml。
除正在研磨的样品外，其它余样品或提取好的粗酶液均
保存在冰箱备用。
混合液的配制、分装及加酶液的过程中均应注意避光。做好预实验确定酶液加入量，以抑制率在35%-65%为佳。光照强度和时间要严格控制一致，根据预实验确定。注意设置的2个对照管分别为空白对照和最大照光管。
为避免酶失去活性，一般在提取液中加2～4％的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。
六、思考题
1、SOD测定中为什么要设置照光和黑暗两个对照管？2、如何提高本实验测定结果的准确性？
3、为什么SOD酶活力不能直接测得？4、SOD酶如何减少超氧自由基的毒害？
实验分组
四人一组：共同完成粗酶液的提取。
两人一组：酶活性测定，结果要进行统计分析。
综合两次实验，每人写一份实验报告，下周课前提交给助教。
