细菌内毒素检查操作规程
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GMP管理文件
题 目 制 定 制定日期 细菌内毒素检查操作规程 审 核 审核日期 2 批 准 批准日期 生效日期 颁发部门 GMP办 颁发数量 分发部门 质量管理部、综合办公室 一、 引用标准：中华人民共和国S药典（2005年版）一部。 二、 目 的：本标准规定了细菌内毒素检查法标准操作规程。 三、 适用范围：适用于细菌内素毒素的检查。 四、 责 任 者：质检人员。 五、 正 文：
1、简述 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以供试吕中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量含量小于ml的灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于ml。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在～的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，何使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
最大有效稀释倍数（MVD）的确定 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：
MVD＝Cl/λ
C为供品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c＝λ/L；λ为凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度
（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。 方法1 凝胶法
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂的生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，有EU/ml表示。当进行了鲎试剂灵敏度复核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、λ和λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。取分装有鲎试剂溶液的10㎜×
75㎜试管或复溶后的支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别入不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎剂灵敏度的测定值（λc）。
λc＝lg-1（∑X/4）
式中 X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在～2λ（包括λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验 按表7制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表7 凝胶法干扰试验溶液的制备
编号 内毒素浓度/配制稀释用液 稀释倍数 所含内毒平行管数 内毒素的溶液 素的浓度 A B 无/供试品溶液 2λ/供试品溶液 —— 供试品溶液 —— 1 2 4 8 1 2 4 8 —— 2λ 1λ λ λ 2λ 1λ λ λ —— 2 4 4 4 4 4 4 4 4 2 C 2λ/检查用水 检查用水 D 无/检查用水 —— —— 注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度；D为阴性对照。
只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且
并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方
为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。
Es＝lg－1（∑Xs/4） Et＝lg－1（∑Xs/4）
式中Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（lg）。
当Es在～2λ（包括λ和2λ）及Et在～2 Es（包括 Es和2 Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预选添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
当进行新S药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法
（1）凝胶限量试验 按表8制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表8 凝胶限量试验溶液的制备
编 号 A B C D 内毒素浓度/配制内毒素的溶液 平行管数 无/供试品溶液 2λ/供试品溶液 2λ/检查用水 无/检查用水 2 2 2 2 注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。
结果判断 保温60分钟±
2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阴性，判供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。
（2）凝胶半定量试验 本方法系通过反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表9制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
结果判断 若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，从试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的风何平均值在～2λ之间，试验有效。
系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按公式CE＝lg－1（∑X/2）]。如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。
如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量的初始稀释倍数）。如果供试吕溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。
表9 凝胶半定量试验溶液的制备
编 号 内毒素浓度/配制内毒素的溶液 A 无/供试品溶液 稀释用液 稀释倍数 1 所含内毒素平行管数 的浓度 — 2 2 2 2 2λ 2λ 1λ λ λ — 2 2 2 2 2 2 检查用水 2 4 8 B C 2λ/供试品溶液 2λ/检查用水 1 1 检查用水 2 4 8 D 无/检查用水 — — 注：A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1、2、4和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。
B 为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照） C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。 D 为阴性对照 方法2 光度测定法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。
