RACE中文说明书

内容

页 码

L概要简介 II•成分 m •另备物品

IV. BD SMART RA€E AmpliRcaLn 基本康理 \"引物设

计

VL Poly A* † RNA和总RNA的制备 vn. cDNA的弟一密的舍成

vm pat阳性对豐 _____________________________

QC3N碌端的快速扩ifl(RACE)l

X. RACE产物鉴定 XL疑难解答

501 •参考文献 xm •相关产吕

附录加5 -RACE流程图示 附录皿3-RACE 图示

PH 录C; SupprffiHoa PCR and StetMJiH PCR 39

I•简要概述 II.成分列表

Comral Hunun PLicenialTolal RNA 和 BD SMART IIA 01ig3nuLlcoddott-70fiCT保存。 NudeoTrap Gel Extraction Kit 2ST保存.

其条试笊-20临下保存.

fig BD SMART RACE 反应.

Fint->btr«ind cDNA 含成

•7jil BD SMART IT™ A OUgonueleotide (12 pM)

5-AAGCAGTGGTATCAACG CAGAGTACGCGG (T † 7pl 3f-HACE CDS Primer A (3^05; 12 pM)

5-AAGCAGTGGI7VTG.^AGG GAGAGTACfTJJOV N-3* arT V = A, G, or C)

• 7pl 5f-RACE CDS Primer (5'«CDS; 12 pM)

茴小

5TD25VN-3*(N = A,C,G 曲戸 V = A, C,orC)

• 7pl BD PoiverScrlpl™ Reverse I^-anscriptaM • 200 pl 5X FirabSLrdnd Buffer

250mMTHs-HCI (pH 83) 375 mM KC1 30 niM Mgpl2

•200 pl DJthiothreitol (DTT; 20 mM),二硫苏權醉 • 1ml Deianitzecl H2O 5••& 3 -RACE PCR

• 400 pl 10X Universal Primer A Mix (UPM)

Long (0.4 pM):

5,-CIAAIACGA€TGACTXrAGGGCAAG-CAGTCGIATGAACGCAGAGT-3, Short (2 pM):

5,-^.4ATACGACTCACTATAGGCC^

• 50 pl Nested Unh ersal Primer A (NUP; 10 pM>

5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT7

Control Reagents

• 5pl Coatrol Human Phcental (胎盘)Total RNA (1 pg/pl) ■ 25 pl Control 5 -RACE T¥R Primer (10 pM) • 25 pl Control 3'RACE IVR Primer (10 PM) General Reagents

•70 pl dNTP Mix (dAl£ dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM) •2Xlml l¥kine-EDTA Buffer

10 mM Tricine-KOH (pH 8.5) 1.0 mM EDTA

NudeoIYap® Gei Extraction Kit (CaL No 636053 or K3070-y) • 100 pl NudeoTrap Suspension •3 ml NT1 Buffer • 10 ml NT2 Buffer •2ml N13 Buffer • User Manual (PT3l6d-l)

Free Lrial-size BD Advantage™ 2 PCR Kh (Cat No. 639207or K19l0-y)

Tho BD Advanuge 2 kit provider suf fie ieni roagenls for 30 PC R reactions. The following a)m|X>nenls are included: • 30 pl SOX BD Advantage 2 Polymerase Mix •200 pl 1 OX BD Advance 2 PCR Buffer • 30 pl SOX dNTP Mix (10 mM S)

• 30 pl Control DNA Template (100 n^/pl) • 30 pl Control Primer Mix (10 pM each) • 1 ml PCR-Grade Wator • User Manual (PT3281-1)

III.另备物品

下列试刑襦另外准笛；

• 0.5-1 nl PCR 反应管.推荐使用 PerkinElnier GeiwAmp O.S-ml fXMClion tubes (dl. No.

N8ai-O737ufN0Ol-O18O).

• Mineral oil («.g., Sigma CdL Na M-3516)

俺小

IV BD SMART RACE的要点

使全面闻读

•所有妙锻均经过优彳匕 但可能因所使用的辭、根版、引物和然循环仪而不同•因此应使 用 Control Human Pldceeiul TOLII RNA5R]Cantrol T- anil 31- RACE TF*R Prinwns进行烦实

•RACE PCR的效率取决于试腌样品RNA中mRNA的丰盛•另外ig火温愷和延伸遍廈也 依引韧

不同而变化.诗参照第X节的侵议优彳匕PCR的条弁•

丑进行5f-RACE and 3--RACE PCRK必别便用热启动。本手册巳经过优仏 所便用 的BD

Advantage 2 Polymerase Mix中包含BDTaqSurt抗体用于目动逬行PCR的热启动 （Kellogg etal., 1W4）a 也可以手^（D*Aquilaet al., 1991>««用第珠（Chou e< 儿 1 的2）来 进行

那启动。

•推荐使用试刑盒中提供的TYicine-EDTA缓冲液稀猝和S&DNA样品。Tricineig冲液在 禺温下较TriMbgli#冲液有更好的罐冲能力.TYuibuscd tg冲液会导SpIlW低.弓I起 DN八的障解°

•整个过程要妙手宣以防核酸胡污染。

-SB悬过程（包括吸入和歐岀涪茨）資轻缔.短暂海心便所有成分眾集

•无待别标示.所有操作均应在冰上进行. •聚舍胡在最后加人。

•使用推荐的KD0AS,该竝已径过特别的就也 ・EU是致痊物质，小心处理和使用.

M引物设计

凡引物序列

特异引 1fl（Cene-Specl fic Primer r GSPs） J2 当：

•23-2H个核音馥

50-70%

-Tm ^5°C F如果Tm >70。（2可获得堪好的结果（可便用felJltouchdownPCR^ 根版、引物

及RACE产物如图?所示.至少福要两个特冥引物才能进行完整的BD SMART RACE： B0用于

S'-RACE PCRBtJ反义引物和用T3-RACE PCR的IE义引物。如 果只进行5••取丁・RAUE则只

需一个特异引梅。引物长康在23-2E个核音酸，长于30个核 言酸没有优势.

如囹3所示，两种引物的⑺』idARACE扩増产物存在部分里気 如果在星燮区有一 个合适的性前切位点，可以逸过酶切和连搔反应可以得到OJNA的全长。将两个引 物设计应其RACE产物有106-20W）p的匿整的形式，就能够民舍使用作为叱R反应的 B日性炖風引捌并非一定要设计成较得星聖片断的形式対于大或稀有dJNJU.引物启 好雯设计的尽盘邪近cDNA的末附 不产生垦爱■此外.引挖目身可以工聲（$0互卄） 特异引物GC含■为

50-70% ,拭至少65。口使用1心窗neighbor分析（Freier etal.z 1%G;我们便用Primer Punier®?件来计鼻Tm© Tm.应尽可能大于粮据我们旳经

验.氏引物旳退火温厦高于70。匸待别从困难的样品中可以得到强旳RACE旷Tm-s 超过7『C可臥使用WJSPCRo此外GSPL和GSP2设计成興有相似的Tm•将更有利于使用。 通过计算或试验能够得封GSP1和GSP2的TmS曼邂免使用内部互补的引物或引物之 何互补的引物.尤具在引物旳;T末端互

注意土不更将刮切位点都舍井到5•和3羽异引柯的5侏ML根据找们的经验.这些

191外的圧列将会增加反应呼象，

w-wr^rf

E篩\" k* ZE

v -4VWA^VJUV>V7U^ SSSWg5AAMwt?A/UyV\\MAAAAA J

*TT*T.f

「I

Figure 3. The relationship (rf gene-spedJic primers to the cDNA template. B・引籾在基因上Affifi

尽首我们使用BD SMART RACE Kii成功地得到了穴于65 kb扩增产挤 但为了使你旳 5•■和『RACE产物达劃2 kb,建议対引物加以第选•

C. P9 ^EtouchdownPCR

我们发現WSPCRCDunotal., 1991; Roux, 1995）明显填加BD SMART RACE扩增的待 异性*阵落PCR的退火温度符合苜次PCWS坏的Tm高于通用引物的TnuJfl果你的特异 引初Hm在这空循环中将只有与墓因特异性箔合旳引柄炭生液合.从而积累一定盘 的特定产物。退火温度在隨后降低到与通用引物相配合的視度.引起特异性基因模版 旳!8数和高效率的扩《L

当你的引物旳T m»（rc时我们雄荐使用隠落很环程序.

D•奧式引物

在苜次试验时'不費便用黑式兀2洌合旳週用引物（\"M）和基因特异引物

CGSP ）通何能得到较好的低的非特异性背JR的RAX产物•但是.里式特异引物可以 作为

糅针在鉴定RACE产物的Southern blowing中使用。此外祟式PCR在使用特异引物 进行5

・・or 了.RACE存在高背K*口E特异性扩增时有必■使風 在臬式PCR中.使用 外側引物

进行一个初步的扩增.如果扩増产Wffilffi不淸.可以使用内部引恂至新扩増 初步产物的一部分.BD SMART RACE 包括了可选的步瑕，描明了卑式引物能林 被便用的地方。本试齐！I盒提供的通用巢式引物A可用于S・and*・RACE.

按照上述指南可以tft计翼式特异引物°翼貳引物与外侧特异引物尽可能不璽乞.如果 因序列有限而必须更叠.其内部引物的3•末箱旳序列也更尽可能唯一•

VI•总RNA和Poly A+ RNA的制备

九总的預防

^OficDNAft成质H的首毀因索就是总RNA和poly A* RNA旳完楚度和疑显 下述預防 措施

可使你昭免RNA的隠解和污嶷.

•直授使用r»X«子水.没有用DEPC处理。.

•用0.5NNaOH^所有旳玻璃蛊皿，160_180。(2烘烤49 hr. •使用一次性吸还吸头.

R.RNA分离

BD BicjHdences Clonledi提供几种ii剂盒用于RNA分禺和纯彳匕JQNudeoBuild® RNA/DNA Mini Kit (Cal. No. 635945). C. RNA分斯

推荐使用变性甲IS琼脂J»电泳检测RNA样品。哺轧动極的总RNA展示为两祭4.5利1.9 kb的带，分别对应2BS和18S核糯体RNA,它们之间的总度比率釣为1-2:1.硒乳动物 的Pdy A* RNA金产生0.5-12 kb的弥散带•亮度较核81体RNA带弱.Sixx? distril>utlai)

nwy be smdller with noninainrndllaii tissue bourccs.

VII. cDNA的第一链台成

如下所迷,两个10⑷的反应可以将50 ng-1 pg总RNA ffipaly从RN八转換成用于RACE的

cDNA的第一链。

我们传荐尽址使用polyMRN仏 但是如果总RNA的fll少于50 pg,则不直进行poly 人4RNA的斃化，否则E终产\"很小将金彫响分折RNAJSM和质为菽得長好的试验结 果.可以便用1隔的

poly A4 RNAJK1曲的总RNA.

我们强烈推荐便用包括Human Placatal Total RNA在内的试箜样品逬行阳性对照cDNA 的合成.该cDN八将衾被用于阳性对照的R入CE反血

1在0. Jnl微型离心皆中加入T列试刑: For pieparation of 5 RA.CE Ready cDNA RNA sample^ 1 ill 5*-CDS pnrw

1 ill BD SMART IIA oligo

For preparetjon o( y-RACE-Ready cDKA RKA sample^ 1 pl 7-GOS

prmer A

•取 1 pl 的 Control Human PlaceiUdl Total RNA (1 pg/ji.)fF为对照合成《 2.加入消毒水至终体积为匕pl •

3-混合并在小型离心机上短暂風心. 4. 70°C 下追育 2mino 5. 迅連在冰上冷却2 min0 6短gft/b便成份衆集爸堆•

7.在無个反应管中再D0AT列试剂(巳有体积): 2 p】5X Firsl-Straiid Buflfer

面小

1 pl DTT (20 mM) l^ldNTPMix(10 mM)

1 pl BD Pg&Scripl Reverse TrartSCripLiJie

总体积为10 pl

B.小心混合皆内组分… 9垣暂离心使成份聚集省应 10.42°C下潟育l・5hr.

注越：使用水浴或热個环仪会由于蕖发作用而眸低反应液的体积，由此眸低第一毡 的合成枚率。

11. tt用THCGEDTA Sg冲液来烯釋反应产物：

•如果以W200ng的总RNA开始反应，可加入2011僚稀阪 •如果以=200 ng的总RNA幵始反应.可tJOAlOO plJR«释心

•如果以poly从RNA幵站反应r可加入250 pl来稀释• 12.72°CTU0^S7mln< 13 •所得产品可以在-店下保存3个月。

到此你已经得到了用于了•和5、・RACE的CDNA样品.这些产物的6足以用于后期的RACE 反应，SflSffi用LDPCR枸饉全长cDNA.诒在此留出足磅的产初用作膜仮，

VIII. PCR的阳性对照试验

在用样品iDNA进行5、和31RACE之前•我们磊烈推荐使用来目于Contwl Huitwn

Pldcenial总RNA的cDNAsjg行阳性对鹽RACE PCR反应这些反应将会扩增铁转运蚩白 頁体(TFR) CDNA.该程序令为你确认DD SMART RACE的疋确工作节省可观旳时间•将来 一旦有问題

出现.本対照试釀将肓助于你矗认问題星发生衽RACEPCR (如不同旳话环 仪)还ScDNA.

我们惟荐使用提供的BD Advantage 2 Polymerase Mk进行苣次BD SMART RACE PCR反 匾 如果你的LDNA的GC含员比较鬲‘可以使用BD Advanuge^ GC 2 Polynwrasc Mix (Cat No. 639114> 或 PCR Kit (CaL Nos. &39119 & 639120)o for subsequent analysis. For

applicatiotis in which tile higliesl fidelily pruducl is desired, 2 PCR KJt (CaL Nus. 639123 & G39124) can amplify L£>rnplaWs up to 3.5 kb. For mon? hifomwtioii, see Section XI CYoubleshooling Culde).

1. 为所有的PCR反应和1个额齐旳反应准备足审的主混會液.対于毎个50.pl PCR反应.

混合下列试刑：

34.5 pl PCR纯度的水

5 gl 10X BD Advanyge 2 PCR Buffer

1 pl dNTP Mix (10 mM; in BD SMART RACE 或BD Advantage 2 PCR Kil) 1 pl 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix

总体积为41.5 pl

2. 濮凋暹合(龙泡沬产生)，疸暂离心。

3按表2进行PCR反应的准备.按顺序SEOEIPCR青中加入各种成份.轻爲

Tube Mo^ r#M-3 i

1 r1ptk>ni： Irel^rnM TRACT V.RAC r Control (5* Control CFW Goniporwfii c0hA|

4 Control pr

cOHA)

5? aJ

CmM S -RACCReals-cDKA

J ¥ RAC* R• .• ly 5'-RAGE TFR PnmWM

、KA；.r rRPrtfw(W*M) UPW{10X> HQ

lAMWr Am Hnili^ol nw

A

23 Ml — 1 » ■ 5 J — 41 S HI 50 Ml 2 .(得

25 ud

— 1・ & J — 41 5 iJ 50 d 29 3

1 Ml 1 III ■ 4 id 415 id 50 ml OH

1 «J 1・ — 4 d 41 S 50 d Q3 3

4胡管加入2淞旷切油厦盖.加盂。

注竄：如果使用熱羞傭环仪则可以不用矿物油。

5 •技下列程序启动阵落PCR

• 5 (rycfos

M°C 30

3 mm 7AC

• 5 cycles

30 MC wc

7(rc 30 siec

3 m»n 7RC

• 27 cycte^

WC 6«aC

30 s«c 30 sec 3 mm

zrc

6.毎样取5 pl在1.2%凉膾桓漫胶上进行电泳分析。其余45 pl保存在-20°Go

理想的试验结果(泳道2和5所示” S-RACE对照应当产生一条2・~kb帯.3#.RACE対 愿反应应当产主一条2.4kb带.如杲没有观察到这些带出现.将各PCR反应査慶新股回到 循环仪中.再进行5次循环。如果仍然没有朋望的带岀现.益照第X帀的疑难解答•一定真 在阳性对照反应能密在42个或更少的遁环次数内(5 cycles diuieallng dt 72°C + 5 cycles UL 7SC

32Cyd«ut68°C).产生了很開显的单祭正确的产物带之后再使用试的引物和dDNA 进行正式的

试验.

y-KAGL

M 1

2 3

1

y-RACE 5 6

1

俺小

d

F igure 4. 5 - and 3'-RACE sample results.

本试脸使用总RNA2E行RATE的反应结杲:

Lanes. 1 & 4 ：干扰素受体 Ld(w、2 & 5:铁转运蛋白受体 Ldiwd & 6: HPRT.

2和孑逋的RACE产切的穴小为2・6kh和2・9kb.铁转运虽白受体的T-.R/XCE (弟)令偶尔 产

生一条06kb的产物

IX.cDNA末端的快速扩增(RACE)

本部分描述了利用5*.RACE和3 -RACE PCR反应得到3 4Q M cDNA片段正式iftlftll* 按照第八节所述进行阳性对照试验。虽然阱盒提供7NesteJ Univeisal Primer A(NUP)r但 在BD

SMART RACE反应中不是一定更进行巣式POR。

所有的RACE PCR反应祁用BD AdvaiiUge 2 Polymer皿MU进行了fil优化处£f°

1. PCR反应遲會液的准备：确保混合液体枳足够所有的PCR反应和一次煎外的反应。该 混

合液用于5’•和J.RACE反应。 对7M-pl PCR5应，所混合的成

34.5 J PCR-Gtode Waler 5 J 10X BD AdvsniaQe 2 PCR Butler I ul JNrPKIix (10 1』 SOX H口 Ac Imritog^ 2 PolyinprOTC Mm __________ 41.6 ul Total volume 2旋周湿含(不委产生气泡)・・短暫离心.

3対于S- ttACE:搔袤III旌备PCR反应： 对于丁.RACE】按表IV准备

SO.S-ml PCR @中技顺序加入所有成份.轻柔泯合。

1 y RACE Simpla

Cormpnn«M gACEHdd. eDMA («xp«nmental> UPM 110X1 CSPl (IDJJ； GSP2(IC»W

TFR

Plinw (10|LM) 3

M \"ter M« Final voiune

4.

2 r-TFr (♦ 3 GWM ・ C (•

UPM only 卜

Cor^rol) Conlwl)

Crntmi)

2B ‡

5 G5P1 only CorrtT) 2・$d

2“ 5 Ml 1 MI — —

2$ *

2 5 J

5 » — — 1 H<

— 1 * « M —

5 H

— — —

1 d — —

— 41.5 Ml

50 Ml

— 41A泌 fiO |d

4 * 41.fi 0 1 4 41.ft U

so w

41.4 神 50 |d

!® ii

•如果KN A是非人裝的.可以跳过此步 t如果特异引物不产生鱼妾可以跳过此步。

有关对照反应旳细节髯跟第灯节.

2

5 GSP i • r (*

(> Con Vol) Control)

25 pl

4 □TMonly

T.ir» ・

5 G1P2 only 卜

Control)

22

Component

r RAUF Raadv cP NA

1 yjwcc Mm 25 pJ

Control, ?6*

75 d

UPM (flfiX) GSP1(10HM>

GSP2 (10kM>

Control r^AC£ THJ

(1C -M

Lb»Uf Mu Fmjl volunw

5 »

— « W —

— — • »

— 1・ 1 T —

——

— — —

— 1 ui —

415 fil

M3 “

415 pl 50 pl

4 Hl 41S d

1 W Al S »

5 Ml £1 6

M) 60 *

50・

FTOQF•” 1 (prMoffrcj ux if GSP HbC)

• Scydn

MX 30 me rrc 3 W • 5eyefc«

WC 30 see

‡ «]»RNA是非人类的，可以廉过此步

t如果待异引物不产生星Q可以規迎此步.

有关对照反应的细节够照第XI节一

4•毋百内復盖初油■ ZJUffio

No仏:如使用规盖時环仪则不必加旷物油。

5便用T列程序之一启动16环仪.(jxt)grarttt 1和2用于聋和3'-RACE TFR

和UPM PrimefsB^阳性对照L依据所使用的ftpoly I还是总RNA来诲择正确的循环次 ®U

FO-C 90 we

T29€ 3 mm* • •

0 cytMS i P tfy A* RMA)

OR

25 (Tote RNA> WC » «

ao*c 90 sec 72X 3 W

• ffra^wK >3 kB » Q<«CM add 3 mmwaadisdttnfu u Proorsfn 2 (It GSP Tw ・ ®-BC)

•

20 cyc^s (Poly A- RMA)

OR

• J5 cycles fTota^ RM>

WC JO sc

«8X 30 we

处 3 W

*如果扩增的片段长度>3 kb .则毎增加I kb延长L miiu

6.冋進］如臬本次叱R反应没有严生目的帶如生的昱弥溼带.SJ^Soudieni bbt来验证:

a A eDNA probe

b. A nested primer as a probe

我者.可以便用NUP引物和NGSP进行傑式\"PCR:

a取上述PCR产物5 pl用245 pl TMclz EDTA®冲液翱算。 b.Sfl上述步ISU5：

•用5 pl RPJI的初圾PCR产拘代昔用于RACE的(DMAs. •加入NUP引物ipl、奥式特异引物lpla

• Program 2的踊环为 15-20 X>

X. RACE产物的鉴定

RACE产物的鉴定便用3种方法:(A)对比用GSPi和NGSPsW到的RACE产辆:(B) Soiitli^rn blotting; (C)克睦和测序.八和D焦要燮式引叛 A.対比用GSP5和NGSPs得到旳RACE产辆

对于5・-RACE反应.将UPM Mix和GSP1得到旳初圾护增产切与UPM和NCSP1得到 的扩增产物进行对比3于3*-RACEf辂UPM和CSP2与UPM和

NGSP2的犷培产韧讲行对比).当肓名铢茁増带时.生£引撫的扩壇亀55当利小些.W 中一空带

应当消失.

Note:不聂使用Nested Universal Primer A (NUP)e B・ Southern Blot Analy山

当RACE产物有多条帚时，fflCSPs或NCSPs制作採针遊行SoudieniWot可以把梶地确 认臭正的RATE产物新 通常5LRACE比\"RACE易出連多祭带.

1.琼脂柢凌胶电泳检测RACE产籾.

茴小

2•照相、转尼龙KL

3•准备探针，探针内不能有GSPl(orG5P2财J?列。可以将NGSPl(or

NGSP2)进行末端掠记•如黒GSPa的5•和卞产物有匡卸 刘可以用GSP2做探针鉴定亍・ RACE

产赫 用GSP1嵌探针鬟定BRACE产物。使用cDNA进行D口彻事或JS机引物扩 増都可以制作探针。

4•杂交、瞬光、显希.

5. 与環脂檯审胶电泳国片进行对比•

6. —旦得到了目的象帚，便用NucJzTmp 3 ExU^cikx、Kil进行胶回收.分SUNAo C.RACE产

物的克隆和测序

1使用MucleoTwp GelExuuctlon Kit进行RACE产物的0收和塊化，直接克陸到「人类 型的

PCR克璨戰休上。

2使用32P后记的NGSP进行63落杂交或从GSP处开始週序.验证克隆的插入.对于5二 RACE

产初.推存至少撓取,10卑克睦.以便在了沐端获得最穴H的序列。一旦确 认克隆内含有最大的特异基因的栩入子.处息可能获取较多的序列数据。可吠猖劃 完整ORF以及

5•和乳J1K

Options for generating full-length cDNA

在廿RACE产物进行部分或完全测序之后.用B述方法之一可以得到全长cDNA :

1•狠撤QNA的5•和3•的末金序列设计引挪 以用于5-RACE^cDNA为膜板，进厅 长距离PGR

(LD PCR).

2克隆更Q性阻和丁.RACE片毂.借助更金区内的性即切位点得到全长.

XI.疑难解答

A：常见的PCR问題

GCJUdi根板解决办法：

如果PCR产物.特别是『RACE产物.不是頂明旳久小或青;殳有.其原因可能是GC-Rld) 模板.dontech 檢供Advantage GC 2 Polymerase Mix (Cat No. 639114) and PCR Kit (Cat Ng

639119 &€39120)来有效扩壇GGridi模板。然而■混合液需要修改以及PCR^R可能 更根据棋板

星新选定.想费徊到更多内鶴iSBIXLAiJYdiiidge GC 2 PCR User Manual (PT331G-1),先用

Advantage 2 Polymerase Mix«ffRACEF 如舉你不能得到预期的PCR产物 是由于GC含尬过高.再

利用Adv^hge GC 2P&ymw恥Mix (CaL No. 639114)SE«[RACE. IW^ItocdKlowii PCR 解决办法: 曼排除降落PCR问题.苜先要改变最烫设定的矗环畚数。久果在G8的最小循环《TF肓不 出扩增的目的产韧.将你的加样董从股回PCR仪中再跑7个VS环.如杲产物还耒出现.

68 *再加3话个逼环.如果还未成功，更做一次PCR.改变第三个循环的退火湿度从 68到65 .

这一程序非常管用.特别是当你的GSP的TTm擾近70的时候

B.第一熬cDNA台成问题

在笫一链CDNA合成方褰中潢述旳RT （逆转录〉反应其实是可以改变旳.处而.有些情况 T,比如说氓的.數员彳艮少的稀有转釆子中.在®-»cDNA合成反应中.将

SMARTScribe Reverse Transcriptaseff5fl从 1 pl9（少至0.5 pl可lilSSSMARTer 5’ -RACE 反

瓯的灵歆展•

分析第一链tDNA的质E

如果你怀疑扩增CONAMR旳问昭是由于反转录的朱敗.你可以栓测笫一琏CDNA的质盘 利用32 P砾记理斥（如杲是来自polyA^RNA）.要做到这一点.專新做第一fifcDNAB 成实脸，用1 pl的

0.1 pCi/pl [a- 32 P] dATP或dCTP取代1 pl水，将产物在确性琼胴越胶 上斃电泳.用放射自

显彩法检测扩増模式，如果第一链CDNA合成成功的话•你会岂到扩 增模式与你冏RNA旳产拘是一样旳.哺乳动物NpolyA* RNA—ftS郁令出现0・S12kb的 smC.多条带的RACE产物

有峠況卞.你的初始试验会出来參祭L或y 产物，你必须决定哪个是真丈的，哪个 以玉的捋

号方针可以网助你擀徐膜像，证莫真的完整棗带.这耍求貝备其他信

息包括转录起始位点的定位.内含子，外显子结构和poly A位点和基因组用列.

寻至片段并不感味右你不能扩增出全KcDNA,泾而，如果词囹通过反应来排除非特昇性 片断，你就襄有一个长足的打瓠如異多星片段持竣手在而你汉想维壊，你应该利用毎次 RACE反应的是长片段.因为它量有可能是真实的.完整的RACE产物. \"貝厌的”参匣RACE产物的来源

单个基因可以产生多个不同大小的转录子，因此多BRACE片段至少有三种机制：

1. 选择性剪切可炭导致5’或3' RAGE的多更产物 2、 不同的转录起始位点会导枝多臣L RACE产物 X不同的paly A位点会引起丁 RACE的纟更产物

相应的.目岡基因可能是多基因家族的一个成员.这样会引起你时“基因特异性”引物 可能扩《1出一些鬲度同源的CDNAS

区別RNA旳真实多态性形式理科学研究的一夭滩題，但是，你可以试BG找到含H蹑丰玄 的购切形比、 厦悝旳来源

多里务带一般不是实际旳.芫整的转录子，这垄處ftRACE产物可以分成两类一一不茫 的及非待异的

夠一版DNA合成的非成熟络止引起逆转录停止从而导致多盟R RACE产物，这一问题 在夭的

RNA中很習還.拜且由于是逆转/的凶有“非常滩克屎

起始材料的RNA関解鬲导致多量扌RACE产物.

不覧是于还是3’ RACE菜歸定基因很难扩増引起多屋产物通當是GC舍俎过鬲 引输的非特昇结含于双filcDNA的多里位点或人工引物二廉体引庭非倚异性RACE产物 多至条带RACE产物的排除建改

如果还未成功的话.用所有建该的对照匣夏你的RACE反应.辖别时，确保你的GSPs在单 独存在的杀件下不会产生兼带，并且在一起的时候只产生一兼带.如果任何单个GSP中存 在条诺，我们建辿你跟据T贡的讨论改变循环參數或设计翼式.同样星复RACE PCR实 验的阳性对照• 利用冲I A10倍的cDNA稀释液里做冥矗

如果还未成功.根抿\\«部分检空起始RNA的次小分布.如果伽內RNA乜起来比加期的 小.更新

ISKNA并量新6NA合成

如果多虫条弟还是存在，當試改变PCR话环总放

通过升高退伙通度2~5度吠提iHPCR的严诵性.在很多惜讯下.非特异引物引起旳整带将 会消真同时莫实的或不左整的产物将会出現

城少循环数.同样.非特异引物引盘的京带将会消失同时口冥的或不完赛旳产韌将会出 现 减少扩增时间

对于大的RACE产物.増加和外的扩塢时问有助于渭除喩外旳条带 如果多里杀帝迅J®存在，蛙匕滾什新的引物 至计引厠使之Tm高于7Q良.井利用降活PCR

我们建议你边计的新引物将会产生的RACE产物与初始引物的产恂有微小的差别•新引 起要么来自初始引牺要么是初始引物的•祟式PCR',在翼式PC.R中.PCR反应的产物 在初始引物的内部得到二次扩堆・这篦常会极大地降低在单一引物产物旳背噪和菲特异 性扩增，黑式引初的设计在IV部分中讨论

在做卓式RACEPCR之前.我们整议你分别利用UPM5GSP1和NCSPlttJ—次初始扩增・ 这个测试可以常助你展示多垦位点是正确的引物PCR结果还是非特异性引切PCR.如果 多車位点足其实旳.它们在两个反应中郁令岀现.但足在黒式引韧中会小一点.两个产 柄的菱异应该与

GSPfflMCSP^cDNAffi构中的位盍相一做

D・其他特别的间题

问題

可能的原因

决办沫

|

在阳性克睦扩堵的里 polymerase mbc可能有问題 企区中汉有双亲到

RACE产勒

如果帰没用Advantage 2 Polymerase

Mix,专虑拱了' SMARIer RACE 方法対Advaiita^e 2 Polymerase Mix 是可進择

的.一定要确保VLBSJ分 中的阳性对照Q

CDNA合成反应可能失败

蛋做第一链合成反应，你量好刊用 R郭分皓方決检谓» 一陆人念成 的质1

用ITP14rFP2没有象 RNA可葩部分輝解取含有 帶，但阳性对熙中出 现正确的产物 利用GSP吐GSP2jg

这个问題可能是由于二圾箱 电B33分的对于茗含GC棋板的排除

从提斛A

肓聚带.但用 条带

方针•另外■你昂肝利用I5SB分旳方 TFP1+TFP2产生正确 的构和蜃GC含m而引起速转 录法栓刻第一3NA合成的质皿 中断，尤其在3’ RACE 正常而£ RACE不正帛出 现.并且阳性对限不会产生 预计的片断 目的基因可龊氢俎養达或者 車提RNA. 39及5’ RACE的扩塢 效率很本不存在起始RNA中 辰兀目标转录子的丰度 引物有何题.引物设计及准 苗可能在间J3 第一.陣低退火後延仲温虔.如果不 起作用.你应该匡设引物或国新纯 化CSP 你可隆通过利用基因组DWA作为樓板扩增内部片断（用CSP1和 CSP2）萩得更多的信息.如果得到了预计臬带.那么你的引物没 有问JH.剧下的问題不理目标RNAil少就itRNA根本就沒肓在你 要的组织 3・RACE有用.但 5’ RACE无论是在冥 驶坦还是对照组都沒 有 不管是基因特异性引 物还是正向对照引物 部没有条帶 中我迄值得注意的是.这一测试并不一定是结果.还 有可號是你的引切被基因组内含子分开了 •如果是遠样的话.扩 増基因ifiDNAg么得到更大的片丹蔓么很怎就没有片HL 这很有可能建全长CDNA6 成取檢板转拱&应失敗 星新需一琏合成反应・井利用13部 力旳方法檢测弟-ScDNA合成的 质M 逆转灵硼啤解.这有可能 是阳利用新的逆转杲関虽新舍成第一旌 没有一玄放在冰上或在 使用cDNA 宪之后浚有立BP放入冰 箱冷及 改受你的PCR循环於驗 如果圧2卜如个脩环之后还是没有 気带（尤其艰了及5’ RACE郁沒 有的対候儿再跑二个循环 璽新第一范舍成反应.并利用B部 分的方法楡测第-ScDNAMfll的 质H 在68退火湿虞下再增加5个循环， 再mpcRfinj你要的片段出现.但 是在W«PCR中不能超ilWHNJS坯 以EI5非阵 cDNA合成或樓板转换反应 失 败 用你的cDNA样品， 丫你夷的基因在RNA样品中 丰 及少RACE®没 有京但是厦不锄 用正向 対照就获得了 預期产 港PCR中不虧超过40个 循环，如果还是没有衢到序期铢带， 専找日标基因丰度更离旳SiRNA 降低退火温度直至2 根据（V部分检測引物，取看車新设 引物遇火温度过鬲 引物不适用 (a)计弓临 目的基因具有二圾绪构或 CCUSES近C1DNA末SB里新设计引 物.幷尽G邂免已知的富含GC区 含盘过肓 R/\\CEcDNA产物出 现 smear 注：有这种痔况T我们建议你最好更捉 RNA c在RA6反应前献有间題. 尤其或班保你时RNA完整井且干 净）更何是3’ RACE反应出農 smejr 整个实验.详细步骏请音 VBg?分 J^SMARTer RME反应产只有V RACE出现M帥可 能暗物非常 复条的条帶模示反转录模板很阻难或 RKNW式以至 于香起来就圣解 sn画r 两个反应都出現snwa吏加 表DR你的起ttRNAgJ反转 录有问題 茎因特异引制不特异 复祈设计基因特异引韧 如是0UMT显然是不是上述问題造成.请巻C部分的疑淮旃答