维普资讯 http://www.cqvip.com ・２３０・ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎ．２００８，Ｖｏｌ １ ３，Ｎｏ．３ Ｚｈｕ等 最近也发现有短的缺失突变（１９ ｎｔ）存在于Ｘ基因下 游，长度大于１００ ｎｔ的缺失突变目前未见报道。 参 考 文 献 １侯金林．正确认识乙型肝炎ｅ抗原慢性乙型肝炎．中华肝脏病杂 志，２００７，１５：１３２—１３ ２ Ｎａｉｔｏ Ｈ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｓ，Ａｂｅ Ｋ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｔｉｔｉｓ Ｂ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ，１ ９８９，２：５８８—５９１． ５ Ｃｈｅｎ ＣＨ，Ｌｅｅ ＣＭ，Ｌｕ ＳＮ，ｅｔ ａ１．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ（ＨＢＶ）ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｃｏｒｅ ａｎｄ ｃｏｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ＨＢＶ ｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔａｉｗａｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００５，４３：６０００—６００６． ６ 皇甫竞坤，董菁，邓红，等．乙型肝炎病毒核心基因启动子序列突变 及准种．世界华人消化杂志，２００１，９：１３２３—１３２５． Ｚｈｕ ＰＡ，Ｔａｎ Ｄ，Ｐｅｎｇ ＺＴ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｌｙｐｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ Ｘ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｈｉｎａ． Ａｃｔａ Ｂｉｏｅｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｅａ Ｓｉｎｉｃａ，２００７，３９：２６５—２７２． ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｉｘ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｂｙ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００１，３９：３６２—３６４． ３董菁，李进，施双双，等．乙型肝炎病毒基因组准种与变异特点的研 究．医学杂志，２００２，２７：１１６—１１８． ４ Ｃａｒｍａｎ ＷＦ，Ｊａｃｙｎａ ＭＲ，Ｈａｄｚｉｙａｎｎｉｓ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎ— ｔｉｎｇ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａ— （收稿日期：２００７—１ １－２９） （本文编辑：钱燕） 丙型肝炎病毒感染离体培养树嗣肝细胞模型初探 闵峰本研究以树嗣为研究对象，采用体外两步灌流法分离肝细 胞，然后用丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ阳性血清直接感染原代 培养的肝细胞，观察树嗣肝细胞对ＨＣＶ的易感性，旨在建立 较为实用的细胞感染模型，为深入研究ＨＣＶ感染细胞的复制 王素美 ２．免疫组织化学试剂：免疫组织化学试剂盒购自福州迈新 生物技术开发公司；抗ＨＣＶ Ｎ 及ＨＣＶ ＮＳ５单克隆抗体，由 北京医科大学肝病研究所提供。 ３．原位杂交试剂：Ｄｉｇ标记的ＨＣＶ正链寡核苷酸探针，参 照Ｂｕｋｈ等 的ＨＣＶ５ 非编码区探针序列（一９５～一５６ｎｔ）：５ 一 ＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＣＴＡＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＣＧＣＧＡＡＡＣＣＧＣＴＴ— 机制提供一定的实验依据。 材料与方法 一ＧＴＧＧ－３ ，由军事医学科学院二所制备和纯化；碱性磷酸酶标 、主要材料 记的地高辛抗体、杂交液、封闭剂和ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液，均为德 成年树嗣购自中国科学院昆明动物研究 国宝灵曼（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）公司产品。 （一）实验动物所，５～８月龄，体重１１０～１４０ ｇ，雌雄不限，双只关养。Ｗｉｓｔａｒ 大鼠购自第三军医大学动物研究所，３０￣３５ ｄ，体重４５～５０ ｇ， 雌雄不限。 ４．ＨＣＶ ＲＮＡ逆转录套式ＰＣＲ试剂：引物由上海生物工 程有限公司合成并纯化，外引物：Ｆ外（４９３～５１８）５＇－ＧＣＡＡ— ＣＡＧＧＧＡＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＣ一３ ，Ｒ外（９８７￣９６４）５＇－ＣＧ— （二）实验血清实验所用的感染血清（ＨＣＶ ＲＮＡ阳性） ＴＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ一３ ；内引物：Ｆ内 （５０２～５２７）５ 一ＡＡＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＡＴ一３ ；Ｒ 均来自慢性丙型肝炎患者，经逆转录一聚合酶链反应（ＲＴ－ ＰＣＲ）检测证实ＨＣＶ ＲＮＡ为阳性，用酶联免疫吸附试验 （ＥＬＩＳＡ）检测抗ＨＣＶ—ＩｇＧ阳性，其他肝炎病毒标志物均阴性。 ＨＣＶ ＲＮＡ阳性血清无菌采集后分装并冻存于一８０ Ｃ冰箱，用 内（９７５～９５２）５＇－ＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴ一３ 。 由内引物扩增ＨＣＶ ｃＤＮＡ长度为４７４ ｂｐ。裂解液Ｔｒｉｐｕｒｅ为 德国宝灵曼（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）公司产品；逆转录酶 （ＡＭＶ）、ＲＮＡ酶抑制剂（ＲＮａｓｉｎ）、无ＲＮＡ酶、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ、 前经５６￣Ｃ ３０ ｍｉｎ灭活补体。正常人血清来自我院输血科健康 供血员，甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒标志物检测均阴性，标 ＭｇＣ１２等为美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品。 二、实验方法 本采集后分装并冻存于一８０℃冰箱，用前经５６ Ｃ ３０ ｍｉｎ灭活补 体。细胞培养所用的小牛血清由本室自制，用前经５６ Ｃ ３０ ｒａｉｎ灭活补体。 （三）主要试剂 （－－）细胞分离和培养 采用体外两步灌流法分离树嗣肝 细胞ｌ２］。 （二）ＨＣＶ．体外感染原代培养的肝细胞 将感染血清与 Ｌ１５完全培养基按照１：２比例稀释，接种于细胞培养的第３ 天，２５ ｍｌ培养瓶每瓶３ ｍｌ，１２孔培养板每孔１ ｍｌ，轻轻摇匀， 置人３７℃５ ＣＯ 培养箱中培养，１６～１８ ｈ后，弃取培养上清， １．细胞分离和培养试剂：Ⅳ型胶原酶、Ｌ１５培养基、ＲＰ— ＭＩ１６４０培养基均为美国Ｓｉｇｍａ公司产品。 作者单位：３６１００３厦门第一七四医院传染科 并用培养基反复冲洗３次，留取最后一次洗涤液待检，然后再 维普资讯 http://www.cqvip.com 肝脏2008年6月第13卷第3期231加入等体积新鲜完全培养液每，1～2日更换培养基在培养过，(一)RTPCR3检测，细胞内HCV正15～负链天，RNA首次检出程中始终保持总体积不变，。正常对照以正常人血清替代感染。。为感染后第RNA天间断检出至第5。17培养上清正链血清空白对照以生理盐水替代感染血清方法同感染组(三)首次检出为感染后第。天第13天亦呈阳性；对照组细检测指标及方法负链RNRT。PCR法检测细胞内或培养上、胞内和培养上清均未检出(二)NS，、清中HCV正Al…免疫组织化学原位杂交分别检测NA，免疫组织化学感染后第，3～5天可见细胞内HCV，细胞内或培养上清中HCV正负链RHCV；NS、NS；特异NS，特异性抗原表达感染细胞呈点状和散在分布阳性，性抗原表达以及原位检测，HCV负链RNA具体操作过程参物质在细胞内表达均呈胞浆型未见胞核型(见图照组细胞内未见阳性物质表达(三)原位杂交，。1、图2)；对17’照《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术》及《非放射性杂¨】交技术》和试剂说明书并作部分改动。感染后第5天细胞内可见蓝紫色杂交信，结一果号阳性细胞也呈散在或点状分布阳性物质在细胞内表达呈胞浆型(见图3)；对照组细胞内未见阳性杂交信号。、HCV体外感染原代培养的树嗣肝细胞图1免疫组织化学检测树鼢肝细胞内HCVNS3抗原表达图2免疫组织化学检测树黝肝细胞内HCV图3原位杂交检测树嗣肝细胞内HCVRNANS5抗原表达二、HCV体外感染原代培养大鼠肝细胞HCV正类动物不具有感染作用RNA，。细胞内和培养上清均未检出发现HCV，负链细胞内未。我们利用树鼢肝细胞进行HCV体外培养首次获得成功、，特异性抗原表达细胞内无蓝紫色杂交信号不仅可以在体外探讨HCV入侵靶细胞的方式途径及复制机讨，论制还能对，HCV保护性抗原的鉴定疫苗的研制和筛选抗、。HCV新药等进行初步研究既解决了动物来源问题一，同时又近年来虽然丙型肝炎的基础和l临床研究已取得重大进展但由于缺乏理想的HCV细胞感染模型和动物模型，、、能进行体内与体外对比研究具有，定的实用价值献r。，了对HCV生物学特性发病机制抗病毒治疗和疫苗制备等参1考r文Impo方面的研究。为深入研究HCV感染细胞的复制机制和筛选。BtukhJ，PurcelRH，MilleRHv．tanceofprimoerselectiocnforer抗病毒新药必须建立较为理想的细胞感染模型，hedeiontectionofhepatitisCrocirusRNAwiththep，lymerasehain我们用，RTPCR法对3～感染树嗣肝细胞及培养上清进行检细胞内可检出HCV正负链，actassay，．PN．atlAcadSciUSA，1992：1871．测发现在感染后5d，RNA，，并2闵峰郝飞刘冰等树嗣肝细胞的分离和培养世界华人消化杂，，．间断检出至感染后第间断检出正链RHCVRNA，，15d而上清中未能检出负链RNA1～但可3志，2001，，9，：627630．NA。因在感染后3d上。清液中未能检出闵峰郝飞刘冰等多抗原肽免疫血清体外阻断丙型肝炎病毒感，．可排除残留血清污染的可能、免疫组织化学结果4，染树嗣肝细胞的初步研究第三军医大学学报．，2002，，24．：6972．显示细胞内有HCVNS，NS。特异性抗原表达原位杂交结果蔡文琴原位杂交组织化学见蔡文琴．．：，王伯云主编实用免疫细，I科学技术出版社胞化学与核酸分子杂交技术成都：四川．1994：示感染细胞内蓝紫色杂交信号提示感染细胞内存在HCV负，4021．链RNA。上述结果证实了HCV在体外确实能感染原代培养，。5路建平非放射性杂交技术见路建平主编非放射性杂交技术．．：，．．的树嗣肝细胞并在其细胞内进行复制海口：南海出版社，1996：7075．同时我们对两种不同种属的肝细胞即大鼠肝细胞和树嗣肝细胞进行对比研究发现大鼠肝细胞对HCV不敏感不能，，(收稿13期(：20071114)本文编辑：钱燕)被HCV感染证实，HCV仅能感染某些灵长类动物对非灵长，
