雨生红球藻中总虾青素提取工艺优化 柴建新 一，万茵 一，付桂明 。，罗阳帆 ， ，陈建芳 ，李昌 ， ， （１．南昌大学食品科学与技术国家重点实验室；２．南昌大学生命科学与食品工程学院； ３．南昌大学中德食品工程中心，南昌３３００４７） 摘要：虾青素是一种功能强大的抗氧化刹，已被广泛应用于饲料、食品、保健品及医药等行业。本文 以雨生红球藻粉为原料，首先通过单因素试验，确定了各个工艺参数对总虾青素提取率的影响，并选取提取 温度、提取时间、料液比三个因素进行正交试验设计，对总虾青素的提取工艺进行了优化。试验结果表明， 所选取的三个因素中，影响总虾青素提取率大小的主次顺序为：提取温度＞提取时间＞料液比，最佳工艺条 件为：以乙酸乙酯为提取剂，提取温度为４０ ，提取时间为６０ｍｉｎ，料液比为１：１００。 关键词：雨生红球藻；总虾青素；提取工艺；优化 中图分类号：Ｔｓ２０２．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—２５１３（２０１１）０３—０１０７—０５ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｆｒＯｍ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ＣＨＡＩ Ｊｉａｎ．ｘｉｎ ｒ，ＷＡＮ Ｙｉｎ ＇”，ＦＵ Ｇｕｉ．ｍｉｎｇ ，。，一， ＬＵＯ Ｙａｎｇ－ｆａｎ 一．ＣＨＥＮ Ｊｉａｎ－ｆａｎｇ 一．ＬＩ Ｃｈａｎｇ ’ ， （１．Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；３．Ｓｉｎｏ—Ｇｅｒｍａｎ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００４７） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ，ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ，ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｆｅｅｄ，ｆｏｏｄ，ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｍｅｄｉ— ｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ—ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｆ－ ｆｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ．Ｈａｅｍａｏｅｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａ１． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａ— ｔｕｒｅ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｅｘｔｒａｃ— ｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｄ— ａｌ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｗａｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗ：ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｉｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃ— ｔｉｏｎ ｓｏｌｖｅｎｔ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ４０％，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ６０ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ｗａｓ １：１００． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈａｅｍａｔｏｅｏｃｅｕｓ；ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ；ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ 收稿日期：２０１１一叭一０１ 项目来源：２００８年江西省教育厅项目（ＧＪＪ０８０４７）。 作者简介：柴建新（１９８４一），男，硕士研究生；主要研究方向：天然产物开发利用。 天然虾青索（ａｓｔａＸａｎｃｈｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｓｏｕｒｃｅ）化学 名为３，３’一二羟基一ｐ，ｐ’＿胡萝卜素一４，４’一 二酮，分子式为ｃ 。Ｈ Ｏ ，是一种红色的类胡萝 卜素。虾青素具有强大捕获自由基，可有效地防 止组织、细胞和ＤＮＡ被氧化损伤…。虾青素具 有极强的清除自由基和猝灭活性氧的活性 ｑ ， 二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）等有机试剂，均为国产分 析纯试剂。 １．２主要仪器与设备 ７２２ｓ可见分光光度计，上海精密科学仪器有 限责任公司；ＳＨＺ—Ｄ循环水式真空泵，巩义市 予华仪器有限责任公司；ＦＡ１６０４分析电子天平， 上海精密科学仪器有限责任公司；ＷＡＥ—Ｂ水浴 锅，宁波自动化仪表厂；ＲＥ一５２旋转蒸发器， 具有超强抗氧作用，其抗氧化能力是普通维生素 Ｅ的５５０倍，是天然６一胡萝卜素的１０倍，被誉 为“超级维生素Ｅ”和“健康软黄金”。此外， 虾青素还具有独特的着色功能，它可以不经修饰 或生化转化而直接贮存、沉积在组织中 ］，使动 物的肌肉显现出鲜艳的红色，广泛应用于饲料添 加剂、食品添加剂、保健品、制药业、化妆品等 领域。 虾青素的生产方法有天然提取和化学合成两 种，目前只有瑞士的罗氏公司用化学合成法生产 虾青素，商品名为ｃａｒｏｐｈｆｌｌｐｉｎｋ，虾青素含量为 ５％～１０％。动物对化学合成的虾青素吸收能力 较弱，在体内不能转化成天然构型。美国ＦＤＡ已 禁止化学合成的虾青素进人保健食品市场。天然 虾青素的着色能力和生物效价比化学合成虾青素 高得多。甲壳动物、酵母菌和微藻类均含有虾青 素，红球藻中虾青素含量可达３％，是虾青素含 量最高的生物，被认为是最有开发前景的天然虾 青素来源。从红球藻中提取高纯度虾青素的技 术，被日本富士化学和美国Ｃｙａｎｏｔｅｃｈ公期 垄断，它们从我国大量进口廉价红球藻粉，通过 分离纯化，加工成高附加值的天然虾青素产品。 虾青素属于萜类化合物，具有疏水亲脂性， 室温下易溶于二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜和丙 酮等有机溶剂。但藻类细胞壁厚，溶剂极性太弱 则不利于渗入细胞，反而影响最终的提取效果， 因此复合溶剂提取效果更佳 Ｊ。从完整的藻类 细胞中提取虾青素时，不仅要考虑虾青素在提取 溶剂中的溶解度，还要考虑到提取溶剂的极性。 ｌ试验材料和方法 １．１试验材料 雨生红球藻粉，购自湖北省荆州天然虾青素 有限公司。 甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、 上海亚荣生化仪器厂；ＣＬ一３型恒温加热磁力搅 拌器，巩义市予华仪器有限责任公司。 １．３ 虾青素含量测定方法 本文使用的虾青素含量采用文献【 中二甲基 亚砜法测定： 有机溶剂提取总虾青素一过滤，定容一准确 吸取１ｍＬ提取液，真空浓缩一用定量二甲基亚砜 （ＤＭＳＯ）溶解一在４９２ｎｍ下测量吸光度 虾青素含量计算公式如下： （１）雨生红球藻粉中提取得到的总虾青素的 浓度（ｍ ｍＬ ）： ，其 ｍ１％ 。。 （２）雨生红球藻中总虾青素的提取得率 （％）： Ｃ，×Ｖ ∞ 州００％ 式中：Ｖ一稀释后提取液的总体积（ｍＥ）； Ｍ 一称取的雨生红球藻粉的质量（ｎ１ｇ）。 １．４单因素试验 １．４．１提取溶剂对提取效果的影响 准确称取７份雨生红球藻粉各２００ｍｇ，每份 分别加入２０ｍＬ乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、 二氯甲烷、乙酸乙酯一乙醇混合液（ｖ／ｖ １：２）、 氯仿一乙醇混合液（ｖ／ｖ １：１），在３０￣Ｃ下振荡 提取１ｈ，抽滤，将滤液定容至２５ｍＬ，取１ｍＬ滤 液真空浓缩后，再用二甲基亚砜溶解并定容至 ２５ｍＬ，以二甲基亚砜为参比，在４９２ｎｍ下测其吸 光度。比较各溶剂对虾青素的提取效果。 １．４．２提取温度对提取效果的影响 准确称取５份雨生红球藻粉各２００ｍｇ，各加 人２０ｒｏＬ１．４．１所得最适溶剂，分别在３０℃、 ４０￣Ｃ、５０￣Ｃ、６０ｑＣ、７０℃下提取１ｈ，抽滤，将滤 液定容至２５ｍＬ，取１ｍＬ滤液同１．４．１操作，在 ４９２ｎｍ下测其吸光度。 １．４．３提取时间对提取效果的影响 准确称取５份雨生红球藻粉各２００ｍｇ，各加 入２ＯｒａＬ １．４．１所得最适溶剂，在１．４．２所得最适 温度下分别提取３０ｍｉｎ、４５ｒａｉｎ、６０ｒａｉｎ、９０ｒａｉｎ、 １２０ｍｉｎ、１８０ｒａｉｎ，抽滤，将滤液定容至２５ｍＬ，取 １ ｍＬ滤液同１．４．１操作，在４９２ｎｍ下测其吸光 度。 １．４．４料液比对提取效果的影响 准确称取５份雨生红球藻粉各２００ｍｇ，分别 加入溶剂１ＯｍＬ、２ＯｒａＬ、３０ｍＬ、４ＯｒａＬ、５ＯｒａＬ，在 １．４．２所得最适温度、１．４．３所得最适时间下振荡 提取，抽滤，浓缩，滤液定容至２５ｍＬ，取１ｍＬ 滤液同１．４．１操作，在４９２ｎｍ下测其吸光度。 １．５正交试验 在总虾青素提取过程中受到多方面因素如温 度、溶剂用量（料液比）、提取时间、提取剂等 方面的影响。为了考察各因素对总提取率影响的 强弱，选用Ｌ９；三因素三水平进行正交试验，以 获得最佳的提取工艺条件。 ２结果与讨论 ２．１单因素试验结果 ２．１．１提取溶剂的选择 表１提取溶剂种类对提取效果的影响 Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ 提取溶剂 吸光度Ａ 甲醇 Ｏ．７ＯＨｏ 乙醇 ０．７３８ 二氯甲烷 ０．７５２ 乙酸乙酯 ０．７８２ 氯仿 Ｏ．８０Ｈ０ 乙酸乙酯：乙醇（１：２） ０．７３２ 氯仿：乙醇（１：１） ０．７５３ 由表１的结果可知，总虾青素在氯仿和乙酸 乙酯中的溶解度较高，而复合提取剂的提取效果 并不显著，原因是对于未破壁的藻种，复合提取 剂更有利于渗入藻种细胞，从而提高了提取率。 而本文用的雨生红球藻粉是经过破壁处理的，且 总虾青素在弱极性溶剂中的溶解度更大，弱极性 的提取剂更利于提取。对氯仿和乙酸乙酯进行比 较，两者提取效果相差不大，氯仿有毒且价格较 高，乙酸乙酯对人体毒副作用小且溶剂可回收利 用，因此，本文选定乙酸乙酯作为提取溶剂，来 进行后续的研究。 ２．１．２提取温度对提取效果的影响 图１结果显示：随着浸提温度的升高，总虾 青素提取率也随之增加，这是由于总虾青素在乙 酸乙酯中的溶解度随温度的升高而增加，在４０￣Ｃ 时总虾青素的提取率达到最高。随着提取温度的 进一步提高，由于总虾青素的氧化分解而使其提 取率有所下降。 ８ ８ ７ ７ ７ ６ ６ ６ ４ １ ８ ５ ２ ９ ６ ３ ６ 盯 ％ 叫 一 《 一 ２０ ３０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０ 提取温度（ ） 图ｌ温度对提取效果的影响 Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ２．１．３提取时间对提取效果的影响 Ｏ．８３ Ｏ．８ 《０．７７ ０．７４ ０．７１ ０．６８ Ｏ．６５ ０ ３０ ６Ｏ ９Ｏ １２Ｏ ｌ５Ｏ １８０ 提取时间（ｍｉｎ） 图２提取时间对提取效果的影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ 由图２可知，在６０ｒｎｉｎ之前总虾青素提取量 随提取时间的延长而增大，但提取时间超过 ６０ｍｉｎ之后，绝大部分虾青素已被提取出来，提 一 ／～ 一～ 皂雪 丽 孤 苎墨 试验研究 取时间的延长并不能提高提取率，相反，提取时 间越长，提取率反而下降。这是由于虾青素不稳 ２．２正交试验结果 ２ ３ ４ ５ 根据单因素实验结果设计正交试验各因素水 平如表２所示。 表２正交试验因素水平表 Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 定，提取时间过长，使得总虾青素发生了部分分 解。 ２．１．４料液比对提取效果的影响 由图３可知，随着料液比的增大，总虾青素 提取率也相应地提高，当料液比达到１：１００时， 提取率达到最大。料液比再增大，提取率反而稍 有下降。从浸提效果、减少溶剂用量和降低浓缩 负荷等方面综合考虑，溶剂用量不宜过大。 ｏ．８４ ０．８ ｏ．７６ ｏ．７２ －ｏ －正交实验结果见表３。从表３可知：各试验 ｏ．６８ ｏ．６４ Ｏ．６ ｏ ｌＯ ２０ ３０ ４０ ５０ ６０ 因素及其水平对雨生红球藻中总虾青素的提取率 大小的影响表现出一定的差异性。三个因素的Ｒ 值大小排列为：Ａ＞Ｂ＞Ｃ，由此可知，三个因素 中影响总虾青素提取率大小的主次顺序为：提取 温度＞提取时间＞料液比。根据Ｋ值的大小可以 提取剂用量（ｍＬ） 图３料液比对提取效果的影响 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ 选出最佳的提取水平，Ｋ值越大说明提取的效果 越好，表中显示，雨生红球藻中总虾青素的最佳 提取工艺条件为Ａ２Ｂ：Ｃ 。 表３正交试验结果 Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 试验号 Ａ １ １ １ １ 吸光度 ０．６９３ 得率／％ ０．９８ １ ２ ２ ２ ３ ３ ０．７３５ ０．６８７ ０．７８３ １．０４ ０．９８ １ ３ １ ３ ２ ｔ．ＩＩ ２ ３ ｌ ０．８３３ １．１８ ３ １ ２ ０．７６０ １．０８ ｌ ３ ２ ０．７２３ １．０３ ２ 】 ３ ０．８２５ １．１７ ３ １．ｏ００ １ １２３ ２ ｌ ０．７９６ １．１３ １．０４０ １．０７７ １．０９７ １．１３０ １．０９３ １．０５０ １．１１Ｏ １．０６３ １．０６３ １．０８７ Ｏ．１２３ ０．０９０ｌ ０．０３０ｌ ０．０４７ 表４为正交实验数据的方差分析结果，可知 在各因素的实验选择水平范围内，提取温度对总 虾青素提取得率有显著性影响，提取时间有一定 影响，料液比对提取得率无显著影响。 表４方差分析表 Ｔａｂｌｅ ４ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ 显著性影响 有一定影响 中总虾青素的提取以及对提取工艺的改进具有一 ３讨论和结论 （１）总虾青素的提取一般采用有机溶剂浸提 法。溶剂的选择要根据极性相似相溶的原则，考 虑到总虾青素在其中的溶解度，提取溶剂极性过 强，总虾青素的溶解度较低，而极性太弱又不利 于溶剂向细胞内渗透，均不利于总虾青素的提 取。因此对于未破壁的细胞，一般选用具有一定 定的指导意义，对提高我国天然虾青素产品的附 加值和核心竞争力，打破美日企业在虾青素产业 的技术和价格垄断，促进红球藻深加工产业化发 展都具有重要意义。 一一１ 一一２ ３一一一一 一一４ 一一一５ 一一６极性的混合溶剂。王灵昭等 的研究表明：在不 进行破壁处理的情况下，采用乙酸乙酯一乙醇混 合液（ｖ／ｖ １：２）的提取率最高。而对于已破壁 的细胞来说，弱极性溶剂更利于提取得到总虾青 素，因此以选用弱极性溶剂为佳。 （２）在各因素的实验选择水平范围内，影响 总虾青素提取率大小的主次顺序为：提取温度＞ 提取时间＞料液比，最佳的提取工艺条件为：提 取温度４０％、提取时间６０ｍｉｎ、料液比为１：１００。 一 一一～ ～一～一一一～一（３）本文中总虾青素的得率偏低，应是所用 原料红球藻粉在提取总虾青素前细胞壁已经被破 坏，接触外界空气后总虾青素被部分氧化之故。 此外，在实验过程中，总虾青素亦不稳定，提取 液暴露在空气中一定时间色泽会减退，导致实验 结果偏小。因此需提取过程应尽量隔绝空气或减 少暴露在空气中的时间，以及添加抗氧化剂以保 护总虾青素不被氧化。 本文以乙酸乙酯为提取剂，优化了从雨生红 球藻中提取总虾青素的工艺参数，对雨生红球藻
