实验1 食品中细菌菌落总数的测定
1 目的要求
（1）掌握食品中菌落总数测定方法。
（2）了解食品清洁程度（被污染程度）及观察细菌在食品中繁殖的动态，从而为被检样品进行卫生学评价时提供依据。
2 基本原理
菌落（colony）是指细菌在某一种固体培养基上克隆增殖发育成肉眼可见的细菌集团。
菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（g，cm2)检样中所含菌落总数。通常以cfu/g（mL，cm2)表示，cfu代表的colony forning unit。
菌落总数是作为判定食品的清洁程度（被污染程度）的标记，通常越干净的食品，单位样品菌落总数越低。反之，菌落总数就越高。菌落总数的测定是以每个活细菌能克隆增殖形成一个可见的单独菌落为基础的，但是在实践中除了单个细胞形成菌落外，二个或两个以上相连的同种细胞也同样可形成菌落，所以现在均以菌落总数（而不是活细菌数）或菌落形成单位数表达。由于菌落总数的测定是在37℃有氧条件下培养的结果，对于厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的细菌也受到。因此，这种方法所得到的结果，实际上只包括一群在普通营养琼脂中发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。但由于在自然界这类细菌占大多数，其数量的多少能反映出样品中细菌的总数，正因为如此，用该方法来测定食品中含有的细菌总数已得到了广泛的认可。
结果 每皿内加入适量营养琼脂 36+148+2h 选择2～3个适宜稀释度， 各以1ml量加入灭菌平皿内 做成几个适当倍数的稀释液 检样 图28-1 菌落总数实验程序 菌落计数 3 实验材料
96
3．1 仪器 恒温箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、微波炉、均质器。
3．2 材料 吸管（容量为0.1mL、1m和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、灭菌平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、灭菌镊子。
3．3 试剂 营养琼脂培养基、75%乙醇、0.85%生理盐水。
4 实验方法与步骤
4．1 菌落总数实验程序（如图28-1） 4．2 检样稀释及培养
（1）以无菌操作将检样25g(25mL)剪碎放于装有225mL灭菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶内，经过充分振荡或均质处理制作成1：10的均匀稀释液（固体食品有的需先用灭菌研钵研磨后再稀释）。 （2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管混合均匀，作成1：100稀释液，按上述操作顺序，作10倍系列稀释液，每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
（3）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释液，分别在作10倍递增稀释同时，吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
（4）稀释液移入平皿后，应及时将融化并冷却到46℃营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿使其混合均匀，同时将营养琼脂培养基注入加有无菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。
（5）待琼脂凝固后，翻转平板，置36+1℃温箱内培养24+2hr（肉、乳和蛋品为48+2h，水产为30℃48+2h）。 4．3 菌落计数
将培养48h后的平板取出，选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板，取两个平板的平均数，乘以稀释倍数，即得每克（或毫升）样品所含菌落总数。 4．4 平板菌落计数方法 (1) 平板菌落数的选择
选取菌落数在30～300个之间的平板作为菌落总数测定的标准，且一个稀释度应使用两个平板的平均数。其中当一个平板有较大片状菌落生长时，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。 (2) 稀释度的选择
A．应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。
B．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300个之间，则4个数相加之和除以(2+2×0.1) 乘以稀释倍数报告之。3个数在30-300之间,则3个数相加除以(1+2×0.1)或(2+1×0.1) 乘以稀释倍数报告之。
C．若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 D．若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最底的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 E．若所有稀释度均无菌落生长，则以小于<1乘以最低稀释倍数报告之。
F．若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 (3) 菌落数的报告
菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。(见表28-1)
表28-1 稀释度选择及菌落数报告方式
例次
稀释液及菌落数
10-1
10-2
10-3
97
菌落总数（cfu/g，
mL）
报告方式 （cfu/g，mL）
1 2 3 4 5 6 7 多不可计 多不可计 多不可计 多不可计 27 0 多不可计 1 295 271 多不可计
11 0 305 20 46 60 313 5 0 12 1000 31000 30909 313000 270 <1×10 30500 16000或1.6×104 31000或3.1×104 300000或3.0×104 310000或3.1×105 270或2.7×102
<10 31000或3.1×104
5 实验结果
（1）将实验得到的菌落总数结果记入下表
1 2 平均
10-2
（2）报告所选两个稀释度之比及检测结果。
10-3
10-4
10-5
备注
6 注意事项
（1）若实验样品为食品，为防止食品碎屑混入琼脂影响计数，通常需在琼脂中添加一定量TTC(氯化三苯四氮唑)，每100mL加1mL0.5%TTC，培养后，如系食品颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落。
（2）理论上讲，为了得到实验食品中所有细菌菌落总数，应将样品接种到几种不同的培养基中并培养在不同的条件下，所得到的细菌菌落数总和。但根据国家颁发的不同食品的规定，都是根据用普通营养琼脂，37℃（水产品30℃）进行需氧培养的结果来确定的，而且这种测定确具代表性，因而菌落总数在一般卫生学评价中并不要求用不同培养基进行选择性培养。
（3）目前还有几种快速检测菌落总数的方法如由军事医学科学院研制而成食品细菌检验箱，菌落总数测定采用试管斜面计数法操作简便，不易受污染，结果与国标法平板计数一致。另一种是3M有限公司提供的Petrifilm Plates测试片（菌落总数测试片）。由于测试片中含有一种红色指示剂，使所有菌落易于识别计数，该片也可用于乳酸菌测定，48hr可确定菌落总数。
7 思考题
（1）什么是菌落总数，何谓cfu？
（2）若平板上菌落数生长一半较均匀，另一半呈片生长，如何计数菌落数？ （3）影响杂菌总数准确性的因素有哪些？
实验2 食品中大肠菌群的测定
1 目的要求
（1）学习与掌握食品中大肠菌群的测定方法。 （2）了解大肠菌群在食品卫生学检验中的意义。
2 基本原理
98
大肠菌群系指一群在37℃24hr能发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的埃希氏无芽孢杆菌。它包括大肠埃希氏杆菌和柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌等类大肠杆菌。大肠菌群的检测就是根据大肠菌群的定义，即利用它们能发酵乳糖产酸产气的特性而设计的初发酵实验；初发酵阳性管通过BGLB进行复发酵证实。根据证实为大肠菌群阳性管数，查MPN检索表，报告每mL（g）大肠菌群的最可能数（食品中大肠菌群系以每mL（g）检样内大肠菌群最可能数MPN表示），MPN最可能数是表示样品中活菌密度的估计。
3 实验材料
3．1 仪器 温箱、冰箱、恒温水浴、天平、微波炉、均质器、普通光学显微镜。
3．2 材料 吸管（0.1mL、1mL和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、玻璃珠、平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、镊子、小倒管等。
3．3 培养基 LST肉汤，BGLB肉汤 革兰氏染色液，0.85%生理盐水。
4 实验方法与步骤
4．1 大肠菌群检验程序（如图29-1） GB/T47.3-2003
图29-1大肠菌群检验程序
4．2
例如10-1，10-2，10-3，10-4等，估计样品污染程度，选择3个合适稀释液备用。 4．3 乳糖发酵试验
将待稀释检样品接种LST肉汤内，接种量在1mL以上者，用双料LST肉汤管，1mL及1mL以下
99
报 告 报 告 大肠杆菌阳性 不产气 报 告 产气 大肠菌群阴BGLB(36+1℃,48+2h) 不产气 产 气 3个稀释度,接种LST肉汤(36+1℃,48+2h) 稀释液225 mL1:10稀释均质 检样25g或25mL 大大肠菌群阴性肠菌群阴 检样稀释
取检样25g(mL)剪碎，以225mL灭菌生理盐水稀释做成1:10稀释液，并依次做10倍递增稀释液，
者，用单料LST肉汤管，每一稀释度接种3管，共种3个稀释度,置36+1℃温箱内培养48+2h，如所有LST
肉汤管都不产气，可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，则按下列程序进行。
4．4 复发酵证实试验
用吸管吸取1mLLST肉汤内管接种到BGLB肉汤内，36+1℃温箱内48h培养，观察有无产气，不产气,报告阴性,产气可报告阳性作大肠菌群计数 4．4大肠菌群最可能数的(MPN)报告
按证实的LST阳性管数查检索(MPN)表报告每g或每mL中大肠菌群MPN值.
5 实验结果
（1）将大肠菌群检验结果填入下表 接种量 1mL 0.1mL 0.01mL
管号 1 2 3 1 2 3 1 2 3
（2）根据证实为大肠菌群的阳性管数，查（MPN检索表后报告每100mL (g)大肠菌群的最可能数。
发酵反 应结果
有无典 型菌落
革兰氏染 色结果
复发酵反 应结果
最后结论 +或-
6 注意事项
双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。
（1）初发酵实验与证实实验有时不一定符合。凡初发酵的产气管一定要做伊红美兰平板分离。如果平板出现典型的大肠菌菌落，G-染色阴性无芽孢菌，即可做出判定。如果平板上典型菌落少，应多挑取菌落包括挑菌落中心黑红、灰红，以及红、粉红等菌落，在革兰氏染色的同时，做证实试验，以免出现假阴性。
（2）关于产气 发酵管内的小倒管如储留气体则是阳性结果，如果不存留气体，但液面及管壁可以看到缓慢上浮的小气泡，或者对没有气体产生的发酵管用手轻轻弹动试管，有气泡出现而且沿管壁上升，都应考虑可能是由菌发酵产生气体的缘故。应做进一步观察，因为这种情况阳性检出率可达50%以上。 （3）所谓典型大肠埃希氏菌是指具有该菌所有生物学特性的大肠菌。新近随粪便排出的大肠菌多属于这一类型。所以如查出多量典型大肠埃希氏菌表明样品是粪便的近期污染结果。研究表明，典型大肠菌随粪便排到外界环境中约一周后，典型菌可变为非典型菌。这种变化以生化变异为主。如果样品检测以非典型大肠菌为主，则指示样品受粪便的远期污染。
大肠埃希氏菌大量存在于人畜肠道，并随粪便排出。本菌在粪便中数量多，易于培养，对外界的抵抗力与肠道致病菌比较相近，所以选择大肠埃希氏菌作为被粪便污染的指示菌，合理、科学。凡被粪便污染的样品，就有可能受到致病菌污染。所以大肠菌群的测定是必做的食品卫生学检项目。
（4）大肠菌群检验方法（国标）采用的管发酵通常需三天，目前已开发出几种快速检验方法（TTC
100
显色法，DC试管法，纸片法）。如由军事医学科学研究院研制而成的一小时快速检测法，检验结果与国标法一致。3M中国有限公司提供的petrifilm plates测试片，可在２４小时确定大肠菌群数。
7 思考题
（1）什么是大肠菌群？大肠菌群表示的单位及其意义。
（2）固体检样三个稀释度检测结果都是阴性时，MPN怎样表示？ （3）液体检样三个稀释度检测结果都是阴性时，MPN怎样表示？ （4）大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管发酵？
实验3 食品中金黄色葡萄球菌的检测
1 目的要求
（1）了解食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检测方法。
（2）观察金黄色葡萄球菌的革兰氏染色镜检形态以及在血平板和Baird-Parker氏琼脂平板上生长的菌落特征。
（3）观察金黄色葡萄球菌产生血浆凝固酶现象。
图30-1 金黄色葡萄球菌检测程序 2 基本原理
金黄色葡萄球菌可产生多种毒素和酶。在血平板上生长时，因产生金黄色色素使菌落呈金黄色；由于产生溶血素使菌落周围形成大而透明的溶血圈。在Baird-Parker氏平板上生长时，因将亚碲酸钾还原成碲酸钾使菌落呈灰黑色；因产生脂酶使菌落周围有一浑浊带，而在其外层因产生蛋白水解酶有一透明带。在肉汤中生长时，菌体可生成血浆凝固酶并释放于培养基中（叫做游离凝固酶）。此酶类似凝血酶原物质，不直接作用到血浆纤维蛋白原上，而是被血浆中的致活剂（即凝固酶致活因子）激活后，变成耐热的凝血酶样物质，此物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变成固态纤维蛋白，血浆因而成凝固状态。
3 实验材料
3．1仪器和材料 显微镜、温箱、离心机、灭菌吸管（1mL，10mL）、灭菌试管、灭菌平皿、均质器、载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环。
3．2 培养基及试剂 胰酪胨大豆肉汤、7.5%氯化钠肉汤、豆粉琼脂、血琼脂平板、Baird-Parker琼脂平板、肉浸液肉汤、兔血浆、革兰氏染色液等。
4实验方法与步骤
4．1 金黄色葡萄球菌检测程序（如图30-1）
图30-1金黄色葡萄球菌检测程序
101
检样25g(ml)+225ml灭菌生理盐水
直接记数方法 增菌培养方法 Baird-Parker平板0.3ml、0.3ml、0.4ml 36+124h 血 平 板 36+124h 7.5%氯化钠肉汤或 胰酪胨大豆肉汤 36+124h 血平板，Baird-Parker平板 36+124h 涂片染色 观察溶血 血浆凝固酶实验 报 告25g样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌 4．2 增菌培养法 （1）检样处理
称取25g固体样品或吸取25mL液体样品，加入225mL7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。污染严重的样品用10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤进行增菌 （2）增菌及分离培养
置36±1℃温箱培养24h，转种于血平板和Baird－Parker平板上，36±1℃培养24h，挑取可疑金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 （3）形态
金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5～1μm。 （4）培养特征
在肉汤中呈混浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在Baird－Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 （5）血浆凝固酶试验
吸取新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，摇匀，放36±1℃培养箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时呈现完全凝块或者凝固超过原体积的一半，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。 4．3 直接计数法
（1）吸取上述1：10混悬液，进行10倍系列稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，
102
分别加入到三块Baird－Parker平板中，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在36±1℃温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置36±1℃温箱培养。
（2）在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36±1℃24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。
（3）将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌的黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。
5 实验结果
（1）金黄色葡萄球菌涂片染色镜检为阳性球菌，致病性葡萄球菌一般较非致病性葡萄球菌小，且各个菌体的大小排列也较整齐。细菌繁殖时呈多个平面的不规则，堆积成葡萄串状。在中毒食品、脓汁或液体培养基中常呈单个或环球短链排列，易误认为链球菌或细球菌。
（2）金黄色葡萄球菌在血平板上菌落呈金黄色，周围有溶血圈，在Baird-Parker平板上菌落呈灰黑色，周围为一浑浊带，在其外层有一透明圈。
（3）致病性葡萄球菌血浆凝固酶为阳性。
6 注意事项
（1）在做样品中金黄色葡萄球菌计数进行10倍递次稀释时，要注意每个稀释度更换吸管。 （2）实验中操作者须注意生物安全防护，实验结束后要消毒环境，把实验材料高压灭菌后方可清洗或弃之。
7 思考题
（1）金黄色葡萄球菌引起食物中毒的机理是什么？
（2）为什么采用血浆凝固酶试验来决定葡萄球菌致病和不致病?
实验4食品中溶血性链球菌的检测
1 目的要求
（1）了解食品和食物中毒样品中溶血性链球菌的检测方法。
（2）观察溶血性链球菌的革兰氏染色镜检形态以及在血平板上菌落特征及溶血情况。 （3）观察乙型溶血性链球菌产生链激酶的现象以及杆菌肽敏感实验结果。
2 基本原理
乙型（β）溶血性链球菌致病性强，能产生溶血毒素，在血平板上生长，可使菌落周围形成一个有2～4mm宽，界限分明，完全透明的无色溶血环，称乙型溶血；还能产生链激酶（又称溶纤维蛋白酶），激活血浆中的血浆蛋白酶原，使之变成活动性的血浆蛋白酶，故可溶解血块或阻止血浆凝固；还可以产生胞外cAMP因子，它可以增强葡萄球菌的溶血能力，即增强对羊、牛血红细胞的溶解能力。因此，在羊血琼脂平板上接种链球菌处，可以见到蘑菇状或箭头样的溶血区。
3 实验材料
3．1设备和材料 温箱、水浴、显微镜、离心机、试管架、灭菌平皿、灭菌小试管、载玻片、灭菌吸管（1mL、10mL）灭菌镊子、均质器、酒精灯、接种环。
3．2培养基和试剂 葡萄糖肉浸液肉汤、牛心浸液、匹克氏肉汤、血琼脂平板、人血浆、0.25%氯化钙、灭菌生理盐水、杆菌肽药敏纸片(含0.04单位)。
4 实验方法与步骤：
103
4．1溶血性链球菌检验程序（如图31-1） 4．2 样品处理
称取25g固体检样或称取25mL液体检样，加入225mL灭菌生理盐水制成混悬液。
图31-1 溶血性链球菌检验程序 检样25g（ml）＋225ml灭菌生理盐水 葡萄糖肉侵液肉汤 或匹克氏肉汤 36±１℃ 24h 血平板 36±１℃ 24h 血干板（分纯培养） 36±１℃ 24h 链激酶试验 杆菌肽敏感试验 观察溶血 革兰氏染色 报 告 4．3 一般培养
将上述混悬液吸取5mL，接种于50mL葡萄糖肉浸液肉汤或直接划线接种于血平板，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36±1℃培养24h后接种血平板，置36±1℃培养24h，挑取乙型溶血圆形突起的细小菌落在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。 4．4 形态与染色
本菌呈球形或卵圆形，直径0.5～1μm，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。 4．5 培养特性
该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时，管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑有乳光，直径约0.5～0.75m，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2～4mm界限分明、无色透明的溶血圈。 4．6 链激酶试验
致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶)，此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原成为血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。
104
吸取草酸钾血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水混匀，再加入18～24h 36±1℃培养的链球菌培养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25mL(如氯化钙已潮解，可适当加大至0.3%～0.35%)，振荡摇匀，置于36±1℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固 (凝固程度至试管倒置，内容物不流动)。然后观察凝固块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性。若24h后不溶解即为阴性。
草酸钾人血浆配制：草酸钾0.01g放入灭菌小试管中，再加入5mL人血混匀，经离心沉淀吸取上清液即为草酸钾人血浆。 4．7 杆菌肽敏感试验
挑取乙型溶血性链球菌液涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片放于上述平板上，置于36±1℃下培养18～24h，如有抑菌带出现即为阳性。同时用已知阳性菌株作为对照。
5 实验结果
（1）溶血性链球菌涂片染色镜检为革兰氏阳性，呈球形或卵原形直径为0.5～1微米，链状排列，链的长短不一，短者由4～8个菌体组成，长者达20～30个菌。液体培养基中易呈长链，固体培养基中常呈短链。
（2）溶血性链球菌在血平板上形成的菌落为灰白色，半透明，表面光滑有乳光，直径约为0.5～0.75mm的圆形突起的细小菌落。乙型溶血性链球菌菌落周围呈完全溶血，并有明显的溶血境界。在显微镜低倍镜下观察，菌落周围一般不能见到红血球。乙类溶血性链球菌在血平板上对杆菌胎敏感，经37℃培养18小时，出现明显抑菌圈。
6 注意事项
（1）做链激酶实验时注意人血浆应新鲜。
（2）实验中操作者须注意生物安全防护，实验结束后要消毒环境，把实验材料高压灭菌后方可清洗或弃之。
7 思考题
（1）溶血性链球菌在血平板上生长时的菌落特征？ （2）溶血性链球菌的致病力强弱与那些生物特性有关？
实验5 食品中沙门氏菌属的检验
1目的要求
（1）学习食品中沙门氏菌属的检验方法和基本原理。 （2）熟悉沙门氏菌属因子血清的使用方法。 （3）了解沙门氏菌属的生化反应及基本原理。
2 基本原理
沙门氏菌属是肠道杆菌科中最重要的病原菌属，它是引起人类和动物发病及食物中毒的主要病原菌之一。食品中沙门氏菌的含量较少，且常由于食品加工过程使其受到损伤而处于濒死的状态。为了分离与检测食品中的沙门氏菌，对某些加工食品必须经过前增菌处理，用无选择性的培养基使处于频死状态的沙门氏菌恢复其活力，再进行选择性增菌，使沙门氏菌得以增殖而大多数的其它细菌受到抑制，然后再进行分离鉴定。
沙门氏菌属是一群血清学上相关的需氧，无芽孢的革兰氏阴性杆菌，周身鞭毛，能运动，不发酵侧金盏花醇、乳糖及蔗糖，不液化明胶，不产生靛基质，不分解尿素，能有规律地发酵葡萄糖并产生气体。沙门氏菌属细菌由于不发酵乳糖，能在各种选择性培养基上生成特殊形态的菌落。大肠杆菌由于发酵乳糖产酸而出现与沙门氏菌形态特征不同的菌落，如在SS琼脂平板上使中性红指示剂变红，菌落呈红色，借此可把沙门氏菌同大肠杆菌相区别。根据沙门氏菌属的生化特征，借助于三糖铁、靛基质，尿素、KCN，
105
沙门氏菌属检验程序图32-1 检 样 赖氨酸等试验可与肠道其它菌属相鉴别。本菌属的所有菌种均有特殊的抗原结构，借此也可以把它们分辨出来。 3 实验材料 前增菌法： 直接增菌法： 3．1设备和材料 天平、均质器或研钵、培养箱、显微镜、灭菌广口瓶、灭菌三角烧瓶、灭菌吸管（l0mL）、冻肉、蛋品、乳品及鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工灭菌平皿、灭菌小玻管、灭菌毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、酒精灯、灭菌金属匙或玻璃棒、接种棒、其他加工食品 的食品25g＋灭菌生理盐水225ml，25g＋做成检液匀液 试管架等。 BP 225ml 3．2 培养基和试剂 缓冲蛋白胨水(BP)，氯化镁孔雀绿(MM)增菌液，四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液，36±１℃ 一般4h，干蛋品18～24h 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液，亚硫酸铋琼脂(BS)，DHL琼脂，HE琼脂，SS琼脂，三铁糖琼脂(TSI)，蛋 白胨水，靛基质试剂，pH7.2尿素琼脂，KCN培养基，氨基酸脱羧酶试验培养基，糖发酵管，ONPG培1ml 匀检样 1ml匀检样 1m匀检样+ 1ml匀检样＋养基，半固体琼脂，缓冲葡萄糖蛋白胨水(附MR、V·P试剂)，丙二酸钠培养基，氧化酶试剂，革兰氏染10ml TTB 10ml SC ＋10 ml TTB ＋10ml SC 色液，26种(初步分型)、57种(一般分型)、144种(详细分型)沙门氏菌因子血清。 42℃ 18～24h 18～24h 42℃ 18～24h 36±1℃ 18～24h 4 实验方法与步骤4．1 沙门氏菌属检验程序（如图32-1） 36±１℃ BS 40～48h 挑取可疑菌落 DHL(或HE、WS、SS) 36±1℃ 18～24h ，尿素（pH7.2）TSI（斜面、底面、产气、H2S），蛋白胨水（靛基质），KCN，赖氨酸 营养琼脂 H2S+，靛基质－ H2S+，靛基质＋ H2S－，靛基质－ 尿素－，KCN－ 尿素－，KCN－ 尿素－，KCN－ 赖氨酸＋ 赖氨酸＋ 赖氨酸＋/－ 营养琼脂 甘露醇+、山梨醇+ 沙门氏菌血清学试验 报告25g样品中检出或未检出沙门氏菌
106
非如左述的各种反应结果 ONPG 非沙门氏菌 非沙门氏菌 表32-1 沙门氏菌属各亚属在各种选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性 琼脂平板
亚硫酸 产H2S菌落为黑色有金属光泽、棕褐琼脂
色或灰色、菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生H2S，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变色。
DHL脂
琼
无色半透明，产生H2S菌落中心带黑色或几乎全黑色。
乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ相同，乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色。
HE琼脂
蓝绿色或蓝色，多数菌株产H2S，菌落中心黑色或几乎全黑色。
乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色。
SS琼脂
无色透明，产生H2S菌株，有的菌落
乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与亚属Ⅰ、Ⅱ、黑色有金属光泽。
亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ
亚属Ⅲ（即亚利桑那菌）
中心带黑色，但不如以上培养基明显。 Ⅳ、Ⅴ相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心
黑色，但中心无黑色形成时与大肠埃希氏菌不能区别。
4．2 前增菌和增菌
冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品均应经过前增菌。各称取样品25g，加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内，固体食品可用均质器，8000～10000rpm/min打碎lmin，或用研钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化。于36±1℃培养4h(干蛋品需培养18～24h)，移取10mL转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养18～24h。同时另取10mL，加入于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36±l℃培养18～24h。
鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其它未经加工的食品不必经过前增菌。各取25mL加入灭菌生理盐水225mL，按前法做成检样匀液，取其半量接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内于42℃培养24h，另半量接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36±l℃，培养18～24h。 4．3 分离
取增菌液一环，划线接种于BS平板一个和DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、或SS琼脂平板)一个。于36±1℃分别培养18～24h(DHL、HE，SS)或40～48h(BS)。观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌亚属I、Ⅱ，Ⅳ、V和亚属Ⅲ在各个平板上的菌落特征见表32—1。
4．4三糖铁高层琼脂初步鉴别
挑选上述选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种到三糖铁琼脂斜面试管中，于36±1℃分别培养18～24h，然后根据表32-2初步判断是否为可疑沙门氏菌。
107
表32-2 肠杆菌科各菌属在三糖铁琼脂内的反应结果
斜面 － ＋ －
底层 ＋ ＋ ＋
产气 ＋/－ ＋/－ ＋
H2S ＋ ＋ －
可能的菌属
沙门氏菌属、变形杆菌属、枸橼酸杆菌属、爱德华氏菌属 沙门氏菌属亚属Ⅲ、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属 沙门氏菌属、埃希氏菌属、哈夫尼亚菌属、摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属
－
＋
－
－
伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、埃希氏菌属、哈夫尼亚菌属、摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属
＋
＋
＋/－
－
埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、枸橼酸杆菌属
该表说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时H2S阴性的菌株可以排除，其它的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。因此需要做几项最低限度的实验。 4．5生化试验
在接种三糖铁的同时，再接种蛋白胨水(供作靛基质试验)、尿素（pH7.2）琼脂、KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于36±l℃培养18-24h，必要时可延长至48小时，按表32-3判断结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其它五种结果均可排除。
表32-3 肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表 反应序号 A1 A2
＋ ＋
－ ＋
H2S
靛基质
pH7.2 尿素 － －
－ － KCN
赖氨酸 脱羧酶 ＋ ＋
沙门氏菌属
沙门氏菌属（少见）、爱德华氏 菌属
A3 A4 B1
＋ ＋ － －
－ ＋ － －
＋ ＋ － －
＋ ＋ － －
－ － ＋ －
枸橼酸杆菌属、奇异变形杆菌
普通变形杆菌
沙门氏菌属、埃希氏菌属
甲型副伤寒沙门氏菌、埃希氏菌 属、志贺氏菌属
B2
－ －
B3
－ －
B4
－
＋ ＋ － － ＋
－ － ＋/－ ＋ ＋/－
－ － ＋ ＋ ＋
＋ － ＋ － －
埃希氏菌属
埃希氏菌属、志贺氏菌属
克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、 枸橼酸杆菌属
摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属
判定菌属
注：（1）三糖铁琼脂底层均应产酸，不产酸者可排除。斜面产酸与产气与否均不限。
（2）KCN和赖氨酸可选用其中一项，但不能判定结果，仍需补做另一项。 （3）＋阳性、－阴性、＋/－多数阳性、少数阴性。
108
（1）反应序号A1
典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸三项中有一项异常、按表32—3附1仍可判定为沙门氏菌。如有两项异常，则按A3，判定为枸橼酸杆菌。
表32-3-A 附1
pH7.2 尿素
－ － ＋
（2）反应序号A2
可先做血清学鉴定，当A—F多价血清不凝集时，补作甘露醇和山梨醇，按表32—3附2判定结果。
表32-3 附2
甘露醇 ＋ －
（3）反应序号B1
三糖铁斜面产酸的菌株可首先排除，不产酸者可先做血清学鉴定，当A—F多价血清不凝集时，补做鸟氨酸、ONPG、水杨苷、棉子糖和半固体动力试验，按实验表32—3附3判定结果。必要时按表32—4，进行沙门氏菌属亚属Ⅲ或其它亚属的鉴定.
表32-3 附3
赖氨酸 ＋ － － d
乌氨酸 ＋ － ＋ d
ONPG － － ＋ ＋
水杨苷 － － － d
棉子糖 － － － d
动力 ＋ － － d
判定结果 沙门氏菌属 志贺氏菌属 宋内氏志贺氏菌属 埃希氏菌属
山梨醇 ＋ －
判 定 结 果
沙门氏菌属靛基质阳性变种（要求血清学鉴定结果）
缓慢爱德华氏菌
KCN － ＋ －
赖氨酸 － ＋ ＋
判 定 结 果
甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） 沙门氏菌 Ⅳ 或 Ⅴ （要求符合本群生化特性） 沙门氏菌个别变种（要求血清学鉴定结果）
注：判定结果时应注意伤寒沙门氏菌鸟氨酸阴性，甲型副伤寒沙门氏菌赖氯酸阴性，鸡沙门氏菌无动力。表中d表示有不同反应结果。如果未做KCN试验时，常需做V-P试验（22～250C，4天），哈夫尼亚菌属为阳性。
109
表32-4 沙门氏菌属亚属的鉴定
项目
Ⅰ
乳糖 ONPG 卫矛醇 丙二酸钠 KCN 水杨苷
（＋）迟缓阳性
亚 属
Ⅱ － － ＋ ＋ － －
Ⅲ ＋/（＋）
＋ － ＋ － －
Ⅳ － － － － ＋ ＋
Ⅴ － ＋ ＋ － ＋ －
－ － ＋ － － －
4．6血清学分型鉴定 （1）抗原的准备
一般采用1.5％琼脂斜面培养物作玻片凝集试验用的抗原。
O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的(如2．5～3％)培养基上再检查，如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于lmL生理盐水中作成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。
H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7～0.8％半固体琼脂平板的，待菌落蔓延生长后，在其边缘部分取菌检查，或将菌株通过装有0.3～0.4％半固体琼脂的小玻管1～2次，自远端取菌培养后再检查。 （2）抗原的鉴定
用A—F多价O血清作玻片凝集试验，同时用生理盐水作对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。
被A—F多价O血清凝集者，依次用O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2、和O11因子血清作凝集试验，根据试验结果判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清作凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成份的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。
不被A—F多价O血清凝集者，先用57种或144种沙门氏菌因子血清中的7种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：
OA l，2，3，4，5，9，10，12，19，2l，26,46 OB 6，7，8，11，13，14,20，22，23，24 OC 16，17，18，28，30，35，38 OD 39，40，41，42，43，44，45 OE 47，48，50，51，52 OF 53，54，55，56，57，58，59
110
OG 60，61，62，63，65,66，67 （3）H抗原的鉴定
属于A—F各O群的常见菌型，依次用下述(表32一5)H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。 不常见的菌型，先用144种沙门氏菌因子血清中的6种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查以确定第1相或第2相的H抗原。
每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。
检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查。如仍只检出一个相应的抗原，要用位相变异的方法检验其另一个相。单菌相不必作位相变异检查。
表32-5 A—F群见菌型H抗原表
O群 A Β Β C1 C2
D(不产气的) D(不气的)
E1 E2 E4 E4 F
HA a，b，c，d，i，Z10，Z29
HB e，h；e，n，x；f，g；g，m，s；g，p；m，t HC k，l，v；r，y，Z，Z4，Z23 HD 1，2；l，5；1，6；1，7；Z6 HE Z35，Z36，Z38，Z39，Z41，Z42，Z44 HF Z52，Z53，Z54，Z55，Z56，Z57
（4）V1抗原的鉴定
用V1因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌。
111
第1相 a g,f,,s i,b,d k,v, r ,c b, d, r d g m p q h v h g s t i i 第2相 无 无 2 5 Z15 2，5 无 无 6，w，x 6w 无 Z6 2 5实验结果
综合以上生化实验和血清学分型鉴定的结果，按照考夫曼——怀特沙门氏菌属抗原表解和补充表解判定菌型，并报告实验结果。
6 思考题
（1）如何提高沙门氏菌的检出率？
（2）沙门氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何？ （3）沙门氏菌属检测主要包括哪几个主要步骤？
实验6 食品中志贺氏菌属的检验
1 目的要求
（1）了解志贺氏菌的形态、培养以及生化反应等特性。 （2）学习志贺氏属菌检验的基本原理和方法。
2 基本原理
志贺氏菌属为埃希氏杆菌，包括痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌四群，是引起人类细菌性痢疾的病原菌。它们主要通过食品加工、集体食堂和饮食行业的从业人员中痢疾患者或带菌者污染食物，从而导致痢疾的发生，是一种较常见的、危害较大的致病菌。志贺氏菌的鉴定主要根据血清学反应，再以生化反应证实。
3 实验材料
3．1样品：肉与肉制品、蛋与蛋制品、乳与乳制品等。 3．2 设备和材料
天平、均质器或研钵、培养箱、显微镜、灭菌广口瓶、灭菌平皿、酒精灯、载玻片、灭菌金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架。 3．3 培养基和试剂
GN增菌液、HE琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、三糖铁琼脂、半固体琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基、苯丙氨酸琼脂、西蒙氏柠檬酸盐琼脂、葡萄糖铵琼脂、糖发酵管、蛋白胨水、靛基质试剂、缓冲葡萄糖蛋白胨水、V-P试剂、甲基红试剂、氧化酶试剂、革兰氏染液、志贺氏菌属诊断血清等。
4 实验方法与步骤
112
图33-1 志贺氏菌检验程序 25g＋GN 225ml HE琼脂或SS 36±１℃，6－8h 36±１℃，18－24h 麦康觊或EMB 挑取可疑菌落 TSI，葡萄糖半固体 TSI底层产酸，斜面产碱， H2S－，不产气，无动力 非如左述的各种反应结果 血清学分型 进一步的生化试验 生化分群试验 志贺氏菌属分群及分型结果 葡萄糖铵试验、西蒙氏柠檬酸盐、赖氨酸、尿素、KCN、水杨苷和七叶苷 葡萄糖铵＋ 或任何其他阳性结果 非志贺氏菌 非志贺氏菌 报 告 4．1 志贺氏菌检验程序（如图33-1） 4．2 增菌
称取检样25g加入装有225mL GN增菌液的500mI广口瓶内（固体食品应用均质器以8，000～10，000r/mi打碎1min，或用研钵研碎），于培养36±1℃培养6～8h。 4．3 分离
取一环增菌液，划线接种于HE琼脂平板或SS平板一个，麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板一个，于36±1℃培养18～24h.。志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明的中等大小的光滑型菌落。 4．4 生化试验
（1）志贺氏菌属生化特性试验
挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和半固体琼脂各一管。志贺氏菌在三糖铁琼脂内的反应结
113
果为底层产酸而不产气(福氏志贺氏菌6型可微产气)，斜面产碱，不产生硫化氢，无动力，在半固体管内沿穿剌线生长。然后再做V-P\\苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、西蒙氏柠檬酸盐和葡萄糖铵试验，结果均应阴性反应。
（2）志贺氏菌属分群生化试验
要将志贺氏菌属分群，应做5%乳糖、甘露醇、棉子糖和甘油的分解试验，靛基质试验。结果见表33-1。
要将志贺氏菌属分型，还需进行血清学试验，具体为：挑取三糖铁琼脂上的培养物，作玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查，若因K抗原的存在而凝集被阻，应煮沸菌液破坏K抗原后再检查。若呈现凝集，则用A1、A2群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别试验，确定菌型。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原的血清学鉴定见表33-2、33-3。
表33-1 志贺氏菌属四个群的生化特性
生化群 A群：痢疾志贺氏菌 B群：福氏志贺氏菌 C群：鲍氏志贺氏菌 D群：宋内志贺氏菌
5%乳糖
- - - +/（+）
甘露醇 - + + +
棉子糖 - + - +
甘油 （+） - + d
靛基质 -/+ -/+ -/+ -
注：+阳性，-/+多数阴性，少数阳性，（+）迟缓阳性，d不同生化型。福氏志贺氏6型生化特性与A或C群相似。
表33-2 福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原
型和亚型
1a 1b 2a 2b 3a 3b 3c 4a 4b 5a
型抗原 Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅳ Ⅳ Ⅴ
114
群抗原 1、2、4、5、9…… 1、2、4、5、6、9……
1、3、4…… 1、7、8、9…… 1、6、7、8、9…… 1、4、6、（7、8、9）……
1、6…… 1、（3）… 1、6…… 1、4……
5b 6 x y
注：……均为省略号
Ⅴ Ⅵ - -
1、5、7、9…… 1、2、（4）…… 1、7、8、9…… 1、3、4……
表33-3 福氏志贺氏菌的血清学鉴定
群3.4 + + - - -
群6 - ＋ ＋ - -
群7.8 - - + + -
可能的型和亚型 2a、1a、6、4a、y变种
1b、3b、4b
3a 2b、5、x变种
4、6
6 实验结果
综合以上生化和血清学的试验结果，判定菌型并作出报告。 （1）根据培养和生化试验，有否检出志贺氏菌？
（2）根据生化特性和血清学试验，检出的志贺氏菌属哪个群？哪个型？
7 思考题
（1）志贺氏菌属有哪些重要的生化特性？
（2）你认为在志贺氏菌属检验过程中，哪些试验是不可缺少的?
实验7食品中蜡样芽孢杆菌的检验
1目的要求
（1）学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。 （2）了解腊样芽孢杆菌食物中毒情况。
2 基本原理
蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰氏阳性杆菌，在自然界分布较广，食品在正常情况下就可能有此菌存在，因而易从各种食品中检出。当人体摄入的蜡样芽孢杆菌数目达到一定数量后就会引起食物中毒。蜡样芽孢杆菌食物中毒中涉及的食品种类较多，包括乳类食品、肉类食品、蔬菜、汤汁、豆芽、甜点心和米饭等，引起的食物中毒表现为呕吐型和腹泻型。
3 实验材料
3．1 仪器与设备
培养箱、冰箱、显微镜、恒温水浴、天平、电炉、吸管（0.1mL、1.0mL和10m1）、广口瓶或三角烧瓶、玻璃珠、培养皿、试管、载玻片、酒精灯、均质器或乳钵、试管架、接种棒、L形涂布棒、灭菌
115
刀、剪、灭菌镊子、酒精棉球、记号笔等。 3．2 培养基和试剂
甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基、肉浸液肉汤培养基、营养琼脂培养基、酪蛋白琼脂培养基、动力－盐培养基、木糖－明胶培养基、缓冲葡萄糖蛋白胨水、血琼脂培养基、3％过氧化氢溶液、70%酒精、革兰氏染色液、甲醇、0.5%碱性复红染色液、甲萘胺－醋酸溶液、对氨基苯磺－醋酸溶液等。
4 实验方法与步骤
4．1蜡样芽孢杆菌检验程序（如图34-1） 图34－1
蜡样芽孢杆菌检验程
116
12～ 1212～～ 菌数测定
生长及菌落观察 肉汤培养基，营养琼脂培养基 染色镜检 生化试验 生化试验 报告
4．2 菌数测定
以无菌操作将检样25g或25mL按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10-1～10-5的稀释液。取各稀释液0.1mL，接种在选择培养基(甘露醇卵黄多粘菌素琼指)平板上，用L形棒涂布于整个表面，置37℃培养12～20h后，选取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为灰白色或微带红色，具紫红色背景(表示不发酵甘露醇)环绕有白色至淡粉红色的晕(表示产生卵磷脂酶)。计数后，从中挑取5个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。 4．3 分离培养
将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上，置370C培养12～20h，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试验。 4．4 证实试验
（1）形态观察：应为G+杆菌，宽度在1μm或1μm以上，芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体或稍偏于一端。
（2）培养特性：肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。
（3）生化特性：本菌有动力，产生卵磷脂酶和酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血，不发酵甘露醇和木糖，能液化明胶和还原盐，在厌氧条件下能发酵葡萄糖。 （4）与类似菌鉴别。本菌与其他类似菌的鉴别见表34-1。
表34-1 蜡样芽孢杆菌与其他类似的鉴别
特 性 过氧化氢酶 动 力 盐还原 酪蛋白分解
巨大 芽孢杆菌 ＋ ＋/－ － ＋/－
蜡样 芽孢杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋
117
苏云金 芽孢杆菌 ＋ ＋/－ ＋ ＋/－
蕈状 芽孢杆菌 ＋ － ＋ ＋/－
炭疽 芽孢杆菌 ＋ － ＋ －/＋
卵黄反应 葡萄糖利用（厌氧）
甘露醇 木 糖 溶 血 已知致病特性
－ － ＋ ＋/－ －
＋ ＋ － － ＋ 产生 肠毒素
＋ ＋ － － ＋
对昆虫致病的内毒素结晶
＋ ＋ － － －/＋ 假根样 生长
＋ ＋ － － －/＋ 对动物和 人致病
注：“＋”90～100%的菌株阳性。“－”90～100%菌株阴性，“＋/－”大多菌株阳性，“－/＋”大多菌株阴性。
本菌在生化性状上与苏云金芽孢杆菌极为相似，但后者可通过细胞内产生蛋白质毒素结晶加以鉴别。其检查方法为：取营养琼脂上纯培养物少许制片，加甲醇于玻片上，0.5min后倾去甲醇，置火焰上干燥，然后滴加0.5%复红液于玻片上，并用酒精灯加热至微见蒸汽后维持1.5min（注意勿使染液沸腾），移去酒精灯，将玻片放置0.5min后倾去染液，而后置洁净自来水下彻底清洗、晾干、镜检。如有游离芽孢和深染了的，似菱形的红色结晶小体即为苏云金芽孢杆菌（如游离芽孢未形成，培养物应放置室温再保持1～2d后查检），而蜡样芽孢杆菌用此法检查为阴性。
6 实验结果
根据以上实验作出检验报告。
7 思考题
如何区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌？
实验8 食品中副溶血性弧菌的检验
1 目的要求
（1）了解副溶血性弧菌的生长特性。 （2）熟悉食品中副溶血性弧菌的检验原理。
2 基本原理
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是近海岸、河口处的栖息生物，常存在于海水、海底沉积物、海产品（鱼类、介壳类）及海渍食品中。人们由于食入污染本菌而未充分加热的海产品或食物可引起食物中毒或胃肠炎。副溶血性弧菌是一种嗜盐性弧菌，在不含NaCl培养基中不生长，在TCBS平板上，菌落0.5～2.0mm大小，因不发酵蔗糖而呈绿色或蓝绿色。
3 实验材料
3．1 菌种 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、大肠埃希氏菌（E. coli）。 3．2 检样 鱼类、贝类。
3．3 培养基及试剂 氯化钠结晶紫增菌液、TCBS培养基、3.5%氯化钠三糖铁琼脂、生化试剂等。
4 实验方法与步骤
4．1 副溶血性弧菌的检测程序（表35-1）
图35-1 食品中副溶血性弧菌的检验程序
118
涂片革兰氏染色镜检形态 氯化钠结晶紫增菌液 100mL 样品25g 加225mL 3.5％灭菌盐水，磨碎 37℃ 8～16h 氯化钠蔗糖琼脂平板 和选择性琼脂平板 37℃，18～24h 3.5％氯化钠三糖铁斜面 嗜盐性试验 37℃，18～24h 生化试验 报告
4．2样品处理
准备好灭菌用具及容器，以无菌操作取有代表性的样品25g，加入到含有225mL的3.5%灭菌盐水中，用均质器打碎或用力摇匀10～20min。 4．3增菌培养
取10mL加入100mL氯化钠结晶紫增菌液中，摇匀，放37℃培养8～16h。 4．4分离培养
取增菌液1环划线接种于TCBS平板，于37℃培养18～24h后，观察平板上生长的菌落，0.5～2.0mm大小、绿色或蓝绿色的为可疑菌落。 4．5初步鉴别
用接种针挑取可疑菌落，转种3.5%氯化钠三糖铁斜面，37℃培养24h观察结果。 4．6涂片镜检
将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄(葡萄糖产酸不产气)、上层斜面不变 (乳糖、蔗糖不分解)、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。 4．7嗜盐性试验
将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水(0％，7％，11％)于37℃ 24h培养后观察生长情况，在0％和11％盐的胨水中不生长，在7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。 4．8生化试验
分别接种下列各类微量生化培养基：葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加
119
试剂观察外，其他均在24h观察结果。
副溶血性弧菌对葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇，产生靛基质，不产生硫化氢，甲基红阳性，V-P阴性，赖氨酸阳性，精氨酸阴性，鸟氨酸多数为阳性少数呈阴性，溶血性多数阳性，有少数不溶血，
5 结果报告
根据镜检的菌体形态特征、TCBS平板上菌落特征、生化试验等判断样品中是否含有副溶血性弧菌。
6 注意事项
（1）副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于在低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，所以应防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
（2）样品中的菌体因受存放条件等的影响，常处于受伤状态，所以不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。
7 思考题
（1）副溶血性弧菌在TCBS平板上有何菌落特征？为什么？ （2）鉴定致病性副溶血性弧菌的重要指标是什么？
实验9 食品中空肠弯曲杆菌的检验
1 目的要求
（1）了解空肠弯曲杆菌的生长特性。 （2）了解食品中空肠弯曲杆菌的检验原理。
2 基本原理
空肠弯曲杆菌广泛存在于鸟、禽、猫、狗等动物体内，从牛奶、蟹肉、河水和无症状人群粪便中可分离到此菌。健康的鸡和奶牛携带该菌。空肠弯曲杆菌已涉及生的和未煮熟的鸡、生的和巴氏杀菌不彻底的牛奶、蛋制品、生火腿、未经氯处理的水。
空肠弯曲杆菌为革兰氏染色阴性菌，螺旋形，弯曲杆状，大小为(0.2～0.8)μm×(0.5～5)μm，有一个以上螺旋并可长达8μm，也可出现S形或似飞翔的海鸥形，菌体一端或二端有单根鞭毛，长度约为菌体的2～3倍，有活泼的动力或不产生动力，超过48h的培养物以衰老的球菌状居多。
空肠弯曲杆菌是一类微需氧菌，初次分离时需在含5%O2-85%N2-10%CO2环境中，该菌相对脆弱，对周围环境敏感，如对干燥、加热、消毒、酸性和21%氧气都敏感。培养适宜温度为25～43℃，最适宜温度为42℃。最适pH7.2。对糖类既不发酵也不氧化，呼吸代谢无酸性或中性产物。在布氏肉汤中生长呈均匀混浊。在血琼脂上，初分离出现两种菌落特征：第一型菌落不溶血，灰色，扁平，润湿，有光泽，看上去像水滴，边缘不规则，常沿划线生长；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的单个菌落（直径1mm～2mm），边缘整齐，半透明，有光泽，中心稍浑，呈单个菌落生长。
3 实验材料
3．1菌种 空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）。
120
3．2检样 碎牛肉、牛奶、鸡、污水。
3．3培养基 布氏肉汤、改良Camp-BAP培养基、血琼脂基础培养基、甘氨酸培养基。 3．4其他用品 生化试剂。
4 实验方法与步骤
4．1 空肠弯曲杆菌的检测顺序（如图36-1） 4．2 增菌 (1) 碎牛肉
称取25g样品，置于匀质杯中，加入100mL布氏增菌肉汤，用均质器以8000～10000r/min均质30s。将均质液通过灭菌纱布，倒入250mL三角瓶中，于微氧条件下，37℃预增菌4h后，42℃培养20～44h。 (2) 净膛全禽和分割肉
在一个灭菌容器中，用250mL灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min，肉汤经灭菌纱布过滤，于23000r/min、4℃离心20min，或于16300r/min、4℃离心30min，弃去上清液，将沉淀物置于250mL三角瓶中，加入100mL布氏增菌肉汤，摇匀。于微氧条件下，37℃预增菌4h后，42℃培养20～44h。 (3) 牛奶
称取40g牛奶放入离心管中，按2条中方法离心，弃去脂肪和上清液将沉淀物置于250mL三角瓶中，加入100mL布氏增菌肉汤，摇匀。于微需氧条件下，35℃预增菌4h后，42℃培养20～44h。 （4）河水或污水
取水样2～4L，每升水样加入5mL1mol/L硫代硫酸钠，用0.45μm微孔滤膜过滤，立即将滤膜置于100mL布氏增菌肉汤中，于微氧条件下，30℃预增菌3h后，再于37℃增菌2h，然后于42℃培养20～44h。 4．2 分离和初步鉴定
取5mL经20～44h增菌的培养物，以0.65μm孔径滤膜过滤。取经过滤和未经过滤的增菌培养物，分别在改良Camp-BAP培养基琼脂平板上划线接种，各不少于二个平板。将平皿置于微需氧条件下42℃培养24～48h。检查平板上有无不溶血、灰色、扁平、湿润、有光泽及有时沿接种线向外扩散的菌落。挑取典型菌落制作湿片，用相差(或暗视野)显微镜检查，本菌呈快速螺旋运动。涂片作革兰氏染色镜检时，本菌为革兰氏阴性，如小逗点状，两菌体的末端相连时，呈S形、海鸥形或螺旋状。挑取初步鉴定为弯曲杆菌的菌落，在布氏琼脂上划线作纯分离。培养方法同上，根据生化、生长特性和抗生素敏感性试验进行菌株证实。 4．3 证实试验
从用作纯分离的平板上挑选二个典型菌落。从每个典型菌落各挑取一满接种环，分别接种于50mL三角瓶中的4mL布氏肉汤中，于微需氧条件下42℃培养24～48h，同时接种一份阳性培养物作为对照。通常用于生长试验和生化反应的基础培养物是含0.18%琼脂的布氏肉汤。该培养基分装于试管中，每管7mL。从所有布氏肉汤中取出接种物，滴加0.2～0.3mL于琼脂表面。 (1) 生长温度试验
接种3管含0.002%中性红(NR)的基础培养基，其中一管置于37℃培养，检查在这一温度下的生长情况，并用于观察过氧化氢酶反应。另二管分别置于25℃和42℃培养。每日检查有无生长。对未生长者，需培养5d方可作出最后判断。弯曲杆菌的生长仅限于接近培养基表面的一薄层，广泛的生长不是弯曲杆菌属细菌所致。 (2) 过氧化氢酶试验
121
滴加3%过氧化氢溶液于有细菌生长的试管中，产生气泡者为阳性反应。 (3) 氧化酶试验
使用琼脂平板表面经24h培养的生长物。将氧化酶试剂滴于棉拭子上，用棉拭子接触生长物表面，接触点变为深蓝色者为阳性。 (4) 盐还原试验
将供试培养物接种于含1%钾的基础培养基中，置空气中于37℃培养5d。加入亚盐检测试剂，出现红色者为阳性反应。 (5) 1%甘氨酸中生长试验
将供试培养物接种于加有NR和1%甘氨酸的基础培养基中，置空气中于37℃培养，每日检查有无生长，对未生长者需培养5d，方可作出最后判断。 (6) 3.5%氯化钠中生长试验
将供试培养物接种于加有NR和3.5%氯化钠的基础培养基中，置空气中于37℃培养.每日检查有无生长，对未生长者需培养5d，方可作出最后判断。 (7) 硫化氢产生试验
将肉汤培养物接种于加有0.02%盐酸半胱氨酸的基础培养基，将一根浸有饱和乙酸铅的滤纸条悬于试管的上部(不让滤纸条接触培养基)，旋紧试管帽，置空气中于37℃培养.每日检查，观察滤纸条是否变黑，变黑表明有硫化氢产生，为阳性反应。对未出现阳性反应者需培养5d，方可作出最后判断。 （8）TSI试验
接种于TSI斜面，于微需氧条件35～37℃培养5d。空肠弯曲菌不产生硫化氢，所有弯曲杆菌属为碱性/碱性反应。 (9) 麦康凯试验
将供试培养物接种于麦康凯培养基，于微需氧条件37℃培养3d，记录有无生长。 (10) 马尿酸盐水解试验
用试管分装马尿酸盐水解培养基，每管0.4mL，冻存备用。将琼脂平板上培养过夜的生长物接种于1%马尿酸溶液中，振摇后置37℃水浴中放置2h。每管加入0.5mL茚三酮试剂(将3.5g茚三酮溶于100mL1:1丙酮和丁醇中)，室温下放置2h，出现紫色者为阳性反应。 (11) 抗生素敏感性试验
用灭菌棉拭子将预先准备好的布氏肉汤培养物涂布于布氏琼脂平板。将头孢菌新素(30μg)和奈啶酮酸(30μg)的圆纸片分别贴于平板表面。于微需氧条件37℃培养24h，检查有无抑菌圈。
空肠弯曲杆菌属各个种的生化特性见表36-1。
表36-1 弯曲菌属各个种的生化特性
试验项目
空肠 弯曲杆菌
空肠弯曲杆菌 多氏亚种
结肠 弯曲杆菌
胎儿弯曲菌 胎儿亚种
琢豚 弯曲杆菌
乌普萨拉 弯曲杆菌
122
25℃生长 37℃生长 42℃生长 盐还原试验 3.5%Nacl耐受试验 硫化氢试验（纸条法） 硫化氢试验（TSI） 过氧化氢酶试验
氧化酶 麦康凯琼脂 1％甘氨酸生长试验 马尿酸水解试验 奈啶酮酸试验 头孢菌新素试验
－ ＋ ＋ ＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ S R
+/－ ＋ +/－ － － ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ S R
－ ＋ ＋ ＋ － ＋ D ＋ ＋ ＋ ＋ － S R
+ ＋ D ＋ － ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ － R S
D ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － R S
0 ＋ ＋ ＋ － ＋ － － ＋ － ＋ － S S
注：＋：90％以上阳性；D：11－％阳性；－：90％以上阴性 ；〔－〕：一般不生长。R为耐受，S为敏感。
5 结果与报告
根据生化鉴定结果表对食品中是否含有空肠弯曲菌作出鉴定并报告。
6 注意事项
（1）所检样品在室温中放置不能超过24h，样品在分离前需放冰箱或冷处保存。
（2）配制培养基时，抗生素配量必须准确，分离培养用培养基不能放置过久，最好现用现配。
7 思考题
（1）空肠弯曲菌生长的条件是什么？ （2）如何鉴定一种细菌是空肠弯曲菌？
实验10 食品中肉毒梭状芽胞杆菌及肉毒毒素的检验
1目的要求
（1）了解肉毒梭状芽孢杆菌的生长特性和产毒条件。 （2）熟悉肉毒梭状芽孢杆菌及其毒素检验的原理和方法。
2 基本原理
肉毒梭菌广泛存在于自然界，引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品等。在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，在我国主要与发酵食品有关，如臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆豉
123
等。其它引起中毒的食品还有：熏制未去内脏的鱼、填馅茄子、油浸大蒜、、烤土豆、炒洋葱、蜂蜜制品等。
肉毒梭状芽孢杆菌属于专性厌氧的革兰氏阳性粗大杆菌，形成近端位的卵圆形芽孢，芽孢比繁殖体宽，使细菌呈汤匙状或网球拍状，在厌氧条件下产生剧烈的外毒素——肉毒毒素。
肉毒梭状芽孢杆菌具有4～8根周毛性鞭毛，运动迟缓；没有荚膜。在固体培养基表面上，形成不正圆形，大约3mm左右的菌落。菌落半透明，表面呈颗粒状，边缘不整齐，界线不明显，向外扩散，呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。在血平板上，出现与菌落几乎等大或者较大的溶血环。在乳糖卵黄牛奶平板上，菌落下培养基为乳浊，菌落表面及周围形成彩虹薄层，不分解乳糖；分解蛋白的菌株，常常在菌落周围出现透明环。在庖肉培养基中生长时，混浊、产气、发散奇臭，有的能消化肉渣。
肉毒梭菌的致病性在于所产生的神经毒素即肉毒毒素，而细菌本身则是一种腐生菌。这些毒素能引起人和动物的肉毒中毒，根据肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、B、C（1、2）、D、E、F、G等七个型。引起人群中毒的，主要有A、B、E三型。C、D二型毒素主要是畜、禽肉毒中毒的病原。F、G型肉毒梭菌极少分离，未见G型菌引起人群的中毒报道。各个型的肉毒梭菌分别产生相应的毒素，所以，肉毒毒素也分为A、B、C、D、E、F、G等七个型。C型包括C1、C2二个亚型。
A型毒素经60℃，2min加热，差不多能被完全破坏，而B、E二型毒素要经70℃, 2min才能被破坏；C、D二型毒素对热的抵抗更大些；C型毒素要经过90℃, 2min加热才能完全破坏，不论如何，只要煮沸1min或75℃加热5～10min，毒素都能被完全破坏。肉毒中毒是由于误食含有肉毒毒素的食品而引起的纯粹的细菌毒素食物中毒。肉毒梭菌生长和产毒的最适温度是25~30℃，而在人的体温条件下细菌表现为丝状，几乎不能产毒、芽孢也不会发芽。
3 实验材料
3．1 样品 罐头、臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆豉等发酵食品。 3．2 菌种 肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botuLinum）。
3．3 培养基与试剂 庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液、肉毒分型抗毒素诊断血清、胰酶（活力1：250）、革兰氏染色液。
3．4 其他 离心机、均质器、厌氧培养装置、小白鼠等。
4 实验方法与步骤
4．1 肉毒梭状芽孢杆菌及毒素的检验程序(如图37-1) 4．2肉毒毒素的检出
肉毒中毒的诊断，重要的是毒素的检出及定型；罐头食品的细菌学检验，有时需要证实肉毒梭菌的存在，不过，最终还是要根据产毒试验来鉴定细菌及其型别。 （1）初步的定性试验----小白鼠腹腔注射法
液状检样可直接离心，固体或半固体检样须加适量(例如等量、倍量或5倍量、10倍量)明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液进行检测。
另取一部分上清液，调pH6．2，每9份加10％胰酶(活力1：250)水溶液一份，混匀，经常轻轻搅动，37℃作用60min，进行检测。肉毒毒素检测以小白鼠腹腔注射法为标准方法。
124
检出试验：取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠2只，每只0.5mL，观察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h内发病、死亡。主要症状为竖毛、四肢瘫软、呼吸困难、呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛如峰腰，最终死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重新试验。 （2）确证试验
不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小鼠发病、死亡者，取样分成3份进行试验。1份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀，37℃作用30min；1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min；1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可，不做其他处理。3份混合液分别注射小白鼠各2只，每只0.5mL，观察4d，若注射加诊断血清与煮沸加热的2份混合液的小白鼠均获保护存活，而唯有注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有症状死亡，则可判定检样中有肉毒毒素存在，必要时进行毒力测定及定型试验。
图37-1 肉毒梭状芽孢杆菌及毒素的检验程序
检样 （食品）
毒素检测 增菌、产毒培养（30℃，5d）
报告 毒素
观察生长形状，染色
报告 分离培养
增菌产毒培养 30℃，5d 观察菌落性状，染色镜检
毒素 培养
报告 125
（3）毒力测定
取已判定含有肉毒毒素的检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成50倍、500倍及5 000倍的稀释液，分别注射小白鼠各2只，每只0．5mL，观察4d。根据动物死亡情况，计算检样中所含肉毒毒素的大体毒力(MLD／mL或MLD／g)。例如，5倍、50倍及500倍稀释致动物全部死亡，而注射5 000倍稀释液的动物全部存活，则可大体判定检样上清液所含毒素的毒力为1 000～10000LD／mL。 （4 ）定型试验
按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10～1 000 LD／mL的范围，分别与各单型肉毒抗毒诊断血清等量混匀，37℃作用30 min，各注射小白鼠2只，每只0.5mL，观察4d。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素液等量混合作为对照。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。 （5）结果分析
食物中发现毒素，表明未经充分的加热处理，可能引起肉毒中毒。检出肉毒梭菌，但未检出肉毒毒素，不能证明此食物会引起肉毒中毒。肉毒中毒的诊断必须以检出食物中的肉毒毒素为准。 4．3 肉毒梭菌的检验与分离鉴定
肉毒梭菌检验方法的重点乃是产毒及毒素的检出试验，如要证实是否有肉毒梭菌存在，只要分离、培养、毒素鉴定即可。
（1）肉毒梭菌检出（增菌产毒培养试验）
取疱肉培养基3支，煮沸10~15min做如下处理：
第1支急速冷却，接种检样均质液1~-2mL；第2支冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10min后急速冷却；第3支接种检样，继续煮沸加热10min 后急速冷却。
以上接种物于30℃培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同4.2，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。 （2）分离培养
选取经毒素检测试验证实含有肉毒梭菌的前述增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48h。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖特有的虹彩样（或珍珠层样）薄层，但G型菌无此现象。
根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种疱肉培养基，于30℃培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。
毒素检测：试验方法同4.2
培养特征检查：接种卵黄琼脂平板，分成2份，分别在35℃的需氧和厌氧条件下培养48h，观察生
126
长情况及菌落形态。肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼脂平板上生长并形成具有上述特征的菌落，而在需氧条件下则不生长。
5 实验结果
详细记录实验过程和现象，判断样品中是否含有肉毒梭状芽孢杆菌。
6 注意事项
（1）典型的肉毒中毒，小白鼠会在4~6h内死亡，而且98～99%的小白鼠会在12h内死亡，因此，试验前24h内的观察是非常重要的。24小时后的死亡是可疑的，除非有典型的症状出现。
（2）如果小白鼠注射经1：2或1：5倍数稀释的样品后死亡，但注射更高稀释度的样品后未死亡，这也是非常可疑的现象，一般为非特异性死亡。
（3）小白鼠要用不会抹去的颜料加以标记。小白鼠的饲料与水必须及时添加、充分供应。
7 思考题
（1）在食品中检出肉毒梭状芽孢杆菌，能否说明食物可引起食物中毒？ （2）在食品中检测肉毒梭状芽孢杆菌及其毒素的过程中，应注意那些事项？
实验11食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验
1 目的要求
（1）了解单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性。 （2）熟悉单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定方法。
2 基本原理
单核细胞增生李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青贮饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6～16%，有70%的人可短期带菌，4～8%的水产品、5～10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。
该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为（0.4～0.5）μm×（0.5～2.0）μm，直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽孢，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。 该菌营养要求不高，在20～25℃培养有动力，穿刺培养2～5d可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌的生长范围为2～42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35～37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8～4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，
127
呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5～7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用450角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。在科玛嘉李斯特菌培养基上培养1天就可见兰色菌落。
3 实验材料
3．1菌种 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）。 3．2 食品 鸡肉、生牛排、鲜牛奶、芹菜。
3．3培养基 EB增菌液、TSAYE培养基、MMA培养基、硫酸铁铵半固体（SIM）。 3．4其他 均质器、显微镜、小鼠。
4 实验方法与步骤
4．1 单核细胞增生李斯特菌的检测程序（图38-1） 4．2 增菌培养
取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h和44h.。 4．3 分离
共培养24h和48h后，取EB培养物分别在MMA琼脂平板、科玛嘉李斯特菌培养基平板上划线，置于30℃培养48h，然后，把MMA平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照射平板，通过目镜垂直向下观察寻找可疑菌落。李斯特氏菌在MMA平板上呈有光泽的兰色或灰色的小的圆形菌落。用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照。
在MMA平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。食品检验中在TSAYE平板上纯化是必须的，因为在MMA平板上分离菌落时可能沾有不可见的受抑微生物。挑取5个典型菌落的原因是一个样品中可能分离到一种以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培养24～48h，如果不用于动力观察，也可在35℃培养。 4．4鉴定
（1）观察TSAYE平板通过斜射光观察，寻找呈兰灰至兰色菌落。在TSAYE上用已知菌作对 照。
（2）从30℃或更低温度下培养的TSAYE平板上挑取典型菌落做成湿玻片在油镜下观察。湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。如果菌量太少，菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。李斯特氏菌是细短杆菌，可见轻微的旋转及翻滚。与已知的李斯特氏菌的对照相比，球形、大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。
（3）挑取典型菌落进行过氧化氢酶实验，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。
（4）取16～24h的培养物进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌。但是陈旧培养物革兰氏染色会发生变化，而且菌体可成球形。在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势，易误认为白 喉菌而错判。
128
（5）挑取典型菌落接种于TSAYE肉汤管中，35℃培养24h，用做糖类发酵和其它生化项目实验。TSAYE肉汤管在4℃下可存放几天，也可反复接种。
（6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺种到5%的绵羊血或马血琼脂平板上，刺种时避免触到平板底部和使琼脂破裂，同时设阳性对照（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照（英诺克李斯特氏菌），35℃培养48h。单核细胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血环。
（7）在明亮的光照下，观察经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌围绕穿刺点产生较清晰的β-溶血环，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象，而绵羊李斯特氏菌产生界限明显的较
129
革兰氏染色 显微镜下观察运动 MR - VP试验 盐还原试验 过氧化氢酶试验 木糖 鼠李糖 七叶苷 溶血试验 协同溶血试验 小鼠致病力试验 纯培养 确证试验 TSA-YE培养基 分离培养 SIM动力培养基 25℃ 2～5d(伞状) TSI琼脂 30℃，24h 选择性培养基（MMA） 30℃，18～24h 增菌 EB增菌液LB1增菌液225 mL 30℃，24h LB2增菌液10mL 30℃，24h 检样25g 图38-1 食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验程序
大溶血环，在此不要试图进行种间的区分，但要记录下溶血反应的特征，cAMP试验（协同溶血试验）可区分它们间的溶血反应。
（8）盐还原试验（选做）。用TSAYE肉汤培养物接种于盐肉汤中，35℃培养5天后，加入0.2mL试剂A，再加入0.2mL试剂B，混合，出现紫红色为阳性反应，表明盐已被还原，如无颜色出现，在试管内再加入少量锌粉，放置1h，如出现紫红色，表明盐仍存在，未被细菌还原。只有默氏李斯特氏菌还原盐，因此，从格氏李斯特氏菌中区分出默氏李斯特氏菌就必须进行这唯一的试验。本试验还有一等效试验，即加入0.2mL试剂A后，再加入0.2mL试剂C，出现橙色表明盐已被还原。如未出现颜色反应，也加入少量锌粉，若出现橙色表明盐未被还原。
（9）将TSAYE培养物穿刺到SIM试管中，室温培养7d，每日观察，李斯特氏菌呈典型伞状生长。同时，30℃的TSAYE培养物在油镜下可见细菌作翻转运动。
（10）将TSAYE肉汤培养物分别接种于0.5%（W/V）葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内（可选用倒立发酵管），35℃培养7d，呈阳性反应的李斯特氏菌产酸不产气，李斯特氏菌发酵鼠李糖和木糖的情况见下表。所有李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖均能发酵，除格氏李斯特氏菌均不能发酵甘露醇。
李斯特氏菌属不同李斯特氏菌的区别见表38-1。
表38-1 李斯特氏菌属的区别
糖 发 酵
种 别
溶血
盐
甘露醇
单增李斯特氏菌 英诺克李斯特氏菌 威尔斯李斯特氏菌 西尔李斯特氏菌 格氏李斯特氏菌 绵羊李斯特氏菌
V:反应不定
鼠李糖 + V V - V -
木糖 - - + + - +
+ - - + - +
- - - - - -
- - - - + -
4．5 血清学鉴定
表38-2显示了李斯特氏菌种间的血清学关系。
130
表38-2 李斯特氏菌的血清学关系
种 别
血清型
1/2A、1/2B、1/2C、3A、3B、3C、4A、4AB、
4B、4C、4D、4E、“7”
5
4AB、6A、6B、Un（未确定）
6A、6B
1/2B、4C、4D、6B、Un（未确定）
单增李斯特氏菌
绵羊李斯特氏菌 英诺克李斯特氏菌 威尔李斯特氏菌 西尔李斯特氏菌
接种2支TSAYE琼脂斜面，35℃培养24h。用3mL 0.01mol/l磷酸盐缓冲液将斜面菌苔洗下，菌悬液于80℃水浴中加热1h，以2500r/min离心30，弃去2mL上清液，将剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。 4．6 小鼠毒力试验
将分离的菌株接种到10 mL TSAYE肉汤中，35℃培养24h，将培养物离心、浓缩，使浓缩液1010cfu/mL，取0.5mL浓缩菌液注射小白鼠腹腔，3～5只，观察小白鼠死亡情况，致病株于2～5d内死亡。用已知致病的单增李斯特氏菌和非致病的英诺克李斯特氏菌相同方法进行，做对照试验。 4．7 协同溶血（cAMP）试验
在羊血琼脂平板上平行接种β-溶血金黄色葡萄球菌（S. aureus）和马红球菌(R. equi)，在它们中间垂直划线接种可疑李斯特氏菌，与两线相近但不相交，在30℃培养24h~48h，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，绵羊李斯特氏菌在马红血球附近的溶血增强。
5 注意事项
在实验过程的每一步骤都要用已知阳性菌和阴性菌作对照。
6 实验结果与报告
根据实验结果，报告你所做的食品中是否含有单核细胞增生李斯特氏菌。
7 思考题
（1）如何分离鉴定食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌？ （2）在日常生活中如何预防单核细胞增生李斯特氏菌引起食物中毒？
实验12 食品中大肠杆菌O157：H7的检验
131
1 目的要求
（1）了解出血性大肠杆菌对人类的危害。 （2）学习食品中大肠杆菌O157：H7检验的方法。
2 基本原理
E. coli O157：H7是肠出血性大肠杆菌中最常见的血清型。1982年美国首次报道了由E. coli O157：H7引起的出血性肠炎暴发。此后，世界各地陆续报道了该菌引起的感染，并有上升趋势。许多国家已把它列为法定的检测菌。
一般认为E. coli O157：H7的最初来源主要是出血性结肠炎病人及感染此菌人的排泄物和动物(特别是牛和羊)的粪便。这些带菌的排泄物在进入生态环境之前处理不当，便通过一定的渠道进入饮食链中，而当人们在摄取这些食物或水时，其加工手段又不足以杀灭其中所有的
E. coli O157：H7，从而引起感染。牛肉、牛奶及其制品、蔬菜、水果、饮料等都能成为该菌的载体，特别是牛肉是该菌的主要载体。
E. coli O157：H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。革兰氏染色阴性，有周生鞭毛，并有菌毛，无芽孢。除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌基本相似。但也有某些生化反应不完全一致，具有鉴别意义。E. coli O157：H7不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）产生荧光，即MUG阴性。
3实验材料
3．1培养基 改良EC新生霉素增菌肉汤（mEC），改良山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC），MUG-LST肉汤，普通营养琼脂。
3．2 试剂 9mL无菌生理盐水6支，E. coli O157：H7标准血清。 3．3仪器 恒温培养箱，灭菌均质器或无菌研钵，1mL无菌吸管。
4实验方法与步骤
4．1 E. coli O157：H7检验的程序（如图39-1） 4．2增菌培养
无菌条件下取25g样品（通常用肉或肉制品）放入225mL mEC中，于无菌均质机或研钵中均质或研磨均匀。41±1℃培养18~24小时。 4．3 分离
吸取mEC肉汤培养物1mL于9mL无菌生理盐水中，即成10度。然后从104，105，10
－
－
－6
－1
的稀释液，再依次稀释至10
－6
的稀释
稀释度中各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培养18~24小时。
E. coli O157：H7在TC-SMAC平板上菌落扁平，透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色中心，直径约2mm。
132
图39-1 E. coli O157：H7检验的程序
检样 25g
4．4 鉴定
挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接种MUG-LST，于36±1℃培养18~24小时，出现产气，且无荧光者，分离到普通营养琼脂。
对普通营养琼脂培养基上的纯菌落用E. coli O157：H7标准血清作凝集试验或胶乳凝集试剂作凝集试验，阳性者报告检出E. coli O157：H7。必要时进行生化试验， E. coli O157：H7的生化特点见表39-1。
此外，对第一步在41±1℃培养18-24小时的增菌液也可用mini-VIDAS作检测，45min即可获得结果。此方法可作快速筛选。
生化反应鉴定 血清凝集鉴定
或胶乳凝集试验 36±1℃ 18-24h vidas快速筛选法 mEC 225mL 41±1℃ 18~24h 阳性反应者 作进一步证实 10-4，10-5，10-6稀释度涂布36±1℃ 18~24h 挑取5~10个可疑菌落（无色）接种MUG-LST MUG阴性培养物转种普通营养琼脂5实验结果
描述出本实验鉴定出的E. coli O157：H7的相关特性。
6思考题
分析E. coli O157：H7与已鉴定大肠埃希氏菌的异同。
表39-1 E. coli O157：H7的生化特点
指 标 三糖铁培养基 山梨醇发酵 纤维二糖发酵
133
生化特点
底及斜面呈黄色，H2S阴性
阴性或迟缓 阴性
胰蛋白胨肉汤 MR-VP 西蒙氏柠檬酸盐 赖氨酸脱羧酶 鸟氨酸脱羧酶 动力试验培养基 棉籽糖发酵
靛基质阳性 MR阳性，VP阴性
阴性 阳性（紫色） 阳性（紫色） 有动力或无动力
阳性
实验13 冷却肉中假单胞菌的检测
1 目的要求
（1）学习冷却肉中假单胞菌的分离，计数方法。 （2）了解假单胞菌初步鉴定的原理和方法。
2 基本原理
冷却肉是指对严格执行兽医卫生检验制度屠宰后的胴体迅速进行冷却处理，使胴体温度在24h内降至0~4℃，并在后续加工、流通和销售过程中始终保持在0~4℃的生鲜肉。虽然在低温条件下，酶活很低，而且大多数微生物的生长也被抑制，但仍有一类嗜冷菌能够生长，引起肉的。其中假单胞菌就是一类在有氧条件下引起冷却肉的主要嗜冷微生物。
假单胞菌是直的或微弯的革兰氏阴性杆菌，不产芽孢，能运动，最适生长温度为30℃，氧化酶反应阳性（少数为阴性），接触酶反应阳性。在冷却肉中，假单胞菌优先利用肉中的葡萄糖，当细胞数目达到108cfu/cm2时，葡萄糖的供应不能满足其生长需要，假单胞菌便开始利用氨基酸作为生长基质，生成带有异味的含硫化合物、酯和酸等。假单胞菌的分离计数采用PSA培养基。根据Brown（1982）推荐的肉品微生物鉴定图谱，通过显微镜形态观察，革兰氏染色，接触酶试验，氧化酶试验，葡萄糖氧化发酵试验和精氨酸双水解酶试验可对分离得到的菌株进行初步鉴定。
3 实验材料
3．1 样品 托盘包装冷却肉。
3．2 培养基 PSA培养基；TSA培养基；葡萄糖氧化发酵培养基；精氨酸双水解酶实验培养基。 3．3 其他试剂和仪器 225mL无菌蛋白胨水（0.1%）1瓶，9mL 0.1%无菌蛋白胨水，革兰氏染色液，1％盐酸二甲基对苯二胺水溶液，1%α-萘酚－乙醇溶液，3~10％过氧化氢，1：1的凡士林液体石蜡混合灭菌液，灭菌的凡士林，滤纸片，白金接种针，灭菌均质机或研钵，30℃培养箱，移液，灭菌头和培养皿若干。
4 实验方法与步骤
4．1 冷却肉中假单胞菌的检测程序（见图40-1）
图40-1 冷却肉中假单胞菌的检测程序
134
假单胞菌属 假单胞菌属
4．2冷却肉中假单胞菌的分离与计数
（1）在无菌条件下称取表面样品肉25g，加入到225mL灭菌蛋白胨水（0.1%）中，均质（8000~10000/min，1min）或研磨，制成10-1的均匀样品稀释液。
（2）吸取以上样品稀释液1mL至9mL的无菌蛋白胨水，即成10-2的样品稀释液，按10倍梯度稀释到所需的稀释度。
（3）取适宜稀释度的稀释液1mL于无菌培养皿中，倒入溶化并冷却至45~50℃的PSA培养基约15mL，摇匀，每个样品取3个稀释度（若无法估计初始菌数，则可多取）。 （4）待培养基凝固后，倒置于30℃培养箱中培养48h。
（5）取菌落数在30~300的培养皿进行计数，根据稀释度换算出冷却肉中假单胞菌的数量。 4．3 假单胞菌的初步鉴定
（1）从以上实验的培养皿中挑取单菌落，进行革兰氏染色观察，并在TSA斜面培养基中划线培养。 （2）挑取18~24h菌龄的菌苔进行接触酶和氧化酶试验。对G—，氧化酶阳性，接触酶阴性的无芽孢杆菌进行下一步的初步鉴定。
（3）葡萄糖氧化发酵试验（O/F试验）：以18~24h的幼龄菌种穿刺接种于含有葡萄糖氧化发酵培养基的试管中，每株菌接4支，其中2支用油封盖（凡士林和液体石蜡1：1混合灭菌），约加0.5~1cm厚，以隔绝空气作为闭管。另2支不封油为开管。同时还要有不接种的闭管作对照。在30℃下培养1、2、4、7d观察结果。氧化型产酸者仅开管产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱（1~2d），后来才稍变酸。发酵型产酸者，则开管闭管均产酸。如产气则在琼脂柱内产生气泡。
（4）精氨酸双水解酶试验：将幼龄菌种穿刺接种于含有精氨酸双水解酶培养基的试管中，并用灭菌的凡士林油封管。在30℃下培养3、7、14d观察结果。当培养基转为红色者为阳性，以不含精氨酸的空白为对照。
135
革兰氏染色阴性杆菌 氧化酶阳性，接触酶阴性 在O/F培养基中不发酵 在O/F培养基中不产酸 在O/F培养基中氧化产酸 精氨酸双水解酶试验阳性 4 实验结果
记录以上各试验步骤得出的结果并报告冷却肉中存在假单胞菌的情况及其数量。
5 注意事项
取样时应严格按照无菌操作进行，取样时还应该注意均匀取肉表面样品，而不易过深。
6 思考题
为什么假单胞菌能够成为有氧条件下，导致冷却肉的主要微生物？
实验14 真空包装肉及肉制品中热杀索丝菌的检测
1目的要求
（1）了解热杀索丝菌对肉及肉制品的危害。 （2）熟悉肉及肉制品中热杀索丝菌的检测方法。
2 基本原理
索丝菌（Brochothrix）为G杆菌，最适生长温度20～25℃，兼性厌氧。包括热杀索丝菌(B. thermosphacta)和野油菜索丝菌(B. compestris)两个种。野油菜索丝菌来源于土壤和草，而热杀索丝菌是肉与肉制品，特别是真空包装的冷鲜肉中常见的菌。因此，用索丝菌的选择性培养基就能把热杀索丝菌从肉及肉制品中分离出来。
STAA是分离热杀索丝菌常用的良好的选择性培养基，22℃，培养5天后，在其上面生长的大部分菌落为热杀索丝菌，只有极少数为假单胞菌。通过革兰氏染色就很容易将二者区分开来。
＋
3 实验材料
3．1样品 真空包装的冷却鲜肉。
3．2 培养基 225mL 0.1%无菌蛋白胨水1瓶，9mL 0.1%无菌蛋白胨水，STAA培养基1瓶。 3．3 仪器 恒温培养箱，1mL无菌吸管，灭菌的剪刀，灭菌均质器，无菌培养皿。
4 实验方法与步骤
4．1 取样
无菌条件下取真空包装的冷鲜肉表层25g，用无菌剪刀剪碎，放入225mL 0.1%无菌蛋白胨水中，均质（8000～10000/min，1min），制成10-1的均匀样品稀释液。 4． 2 稀释
用1mL的无菌吸管吸1mL 10-1的均匀样品稀释液于9mL 0.1%无菌蛋白胨水中，混匀，即成10-2的样品稀释液。根据需要依次做10倍的稀释。一般未的冷鲜肉中热杀索丝菌不会超过103CFU/g。 4． 3 培养
吸取适宜稀释度的样品稀释液1mL（一般做2～3个稀释度）于无菌培养皿内，倒入融化并冷却至45～50℃的STAA培养基（约15mL），摇匀，待培养基凝固后倒置放入培养箱中22℃，培养5d。热杀索丝菌的菌落通常在48h可见。
5 实验结果
描述真空包装冷却肉中检测到的热杀索丝菌的特点特性。
136
6 注意事项
在STAA培养基上除热杀索丝菌主要生长外，有时也会有少量假单孢菌的生长，而热杀索丝菌进行革兰氏染色时，偶而也会出现阴性，故应加以区别。
6 思考题
（1）了解热杀索丝菌的分类地位。
（2）分析热杀索丝菌在低温肉制品中的危害。
实验15 奶粉中阪崎肠杆菌的检测
1 目的要求
（1）了解阪崎肠杆菌对婴儿的危害。 （2）观察阪崎肠杆菌的个体形态和培养特征 （3）熟悉阪崎肠杆菌的分类地位及检测方法
2 基本原理
阪崎肠杆菌为食源性致病菌，革兰氏阴性，属于肠杆菌科，肠杆菌属。1980年以前曾命名为产黄色色素阴沟杆菌。该菌主要在新生儿，特别是早产儿和免疫力弱的婴儿中引起脓毒症、脑膜炎、小肠坏死症和败血症，在某些情况下，死亡率达80%。目前，阪崎肠杆菌的传播途径还不十分清楚，但奶粉在传播过程中的作用被日益关注。目前我国还没有阪崎肠杆菌的检测方法，这里参考美国食品药品管理局（FDA）食品安全营养中心（CFSAN）2002年修订发布的“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离计数方法”介绍奶粉中阪崎肠杆菌的检测。
3 实验材料
3．1 设备和材料 水浴箱、温度计、培养箱、吸管（1mL，5mL和10mL）、L型玻璃涂布棒、接种环、天平、取样勺、灭菌平皿等。
3．2 培养基 胰蛋白胨大豆胨琼脂（TSA）；结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）；肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤）；显色培养基琼脂（X a-GLcA）等。
3。3 试剂及样品 API 20E 生化鉴定试剂盒或类似产品；VITEK生化鉴定系统或类似设备；氧化酶试验试剂等。奶粉
3．4 菌种 阪崎肠杆菌标准质控菌株ATCC29544。
4 实验方法与步骤
4．1 阪崎肠杆菌的检测流程（图42-1） 4．2 阪崎肠杆菌定量检测（MPN法）
定量检测是基于“三管”增菌法，以检测和定量样品中极少量的微生物。检测至少需要333g样品。 （1）无菌称取样品100g，10g和1g各三份分别加入2L，250mL，125mL的样品稀释液中，
图42-1 奶粉中阪崎肠杆菌的检测流程
137
样品100g×3，10g×3，1g×3加入9倍量的无菌
100g加入900ml无菌蒸馏水 蒸馏水或样品 25℃±1℃，48~72h
报 告 36℃±1℃，18~22h 36℃±1℃，18~22h 显色培养基琼脂（X a-GLcA）平板36℃±1℃，18~22h 36℃±1℃，18~22h 10ml加入90ml肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤） 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA） .胰化大豆蛋白琼脂（TSA）平板 36℃±1℃，革兰氏染色，氧化酶试验，API 20 E生化鉴定试剂盒或VITEK生化鉴定系统
加入9倍预热到45℃的灭菌蒸馏水（1：10稀释），或将样品直接称量到装有9倍预热到45℃的灭菌蒸馏水的样品稀释液中，振摇使样品充分混匀，36℃±1℃培养18~22h。
（2）分别取培养18~22h的悬液各10mL加入90mL肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤）中，36℃±1℃培养18~22h。 （3）轻轻混匀增菌液，用直接涂布法或直接划线法进行平板接种。具体为：
直接涂布法：取每份增菌液0.2mL，加到2个结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）平板或2个显色培养基琼脂（X a-GLcA）平板上，每个平板0.1mL，用无菌玻璃棒涂布。
直接划线法：用接种环取每份增菌液，分别接种到2个结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）平板或2个显色培养基琼脂（X a-GLcA）平板上，三区法或四区法划线，以得到单个菌落。将平板置36℃±1℃培养18~22h后观察。 （4）阪崎肠杆菌典型形态的观察
在VRBGA平板上：紫色菌落周围有一圈紫色的胆汁酸沉淀环，圆形，凸起，直径约2mm-3mm。 在X a-GLcA平板上：蓝绿色菌落，圆形，直径1mm-2mm。
（5）从VRBGA平板上挑取5个可疑菌落分别接种到5个胰蛋白胨大豆胨琼脂（TSA）平板，25℃±1℃
138
培养48~-72h。
（6）从X-a-GLcA平板上挑取5个可疑菌落，革兰氏染色，做氧化酶试验。革兰氏染色阴性，氧化酶试验阴性，应用API 20 E生化鉴定试剂盒或VITEK生化鉴定系统进行生化鉴定。
（7）从TSA平板上挑取黄色菌落，革兰氏染色，做氧化酶试验。革兰氏染色阴性，氧化酶试验阴性，应用API 20 E生化鉴定试剂盒或VITEK生化鉴定系统进行生化鉴定。表42-1列出了肠杆菌细菌生化的特性。
表42-1 肠杆菌属细菌的生化特性
试 验 赖氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶 鸟氨酸脱羧酶 KCN生长 发 酵
蔗 糖 卫矛醇 核糖酸 棉子糖 D-山梨醇 X-甲基-D-葡萄糖苷 D-阿拉伯糖 黄色素
阪崎肠杆菌
生 化 特 性
阴沟肠杆菌
产气肠杆菌
聚团肠杆菌
葛高菲肠杆菌
— ＋ ＋ ＋ ＋ — — ＋ — ＋ — ＋
— ＋ ＋ ＋ ＋ (—) (—) ＋ ＋ (＋) (—) —
＋ — ＋ ＋ ＋ — ＋ ＋ ＋ — ＋ —
— — — v (＋) (—) — v v — — (＋)
＋ — ＋ — ＋ — — ＋ — — ＋ —
注：＋为90-100%阳性； (＋)为：75-%阳性； v为25-74%阳性； (—)为10-24%阳性； —为：0-9%阳性。
（8）计算MPN值：根据每一稀释度检测出的阪崎肠杆菌的结果查MPN表，计算并报告每100g样品中的阪崎肠杆菌的最近似值。 4．2 阪崎肠杆菌的定性检测
（1）无菌称取样品100g至2L的样品稀释液中，加入900mL预热到45℃的灭菌蒸馏水，或者将样品直接称量到装有9倍预热到45℃的灭菌蒸馏水的样品稀释液中，振荡均匀，36℃±1℃培养18~22h。 （2）取培养18~22h的悬液10mL，加入90mL肠杆菌增菌液肉汤（EE肉汤）中，36℃±1℃培养18~22h后。
（3）其他操作内容及观察方法同上。
5 实验结果
（1）根据每一稀释度检测出的阪崎肠杆菌的结果查MPN表，计算并报告每100g样品中的阪崎肠杆菌的最近似值。
139
（2）根据检测结果，报告每100g样品中是否检出阪崎肠杆菌。
6 注意事项
（1）取样前应对样品包装的开启处和取样勺进行消毒。 （2）检测样品不能低于333克。
7 思考题
（1）阪崎肠杆菌的检测包括哪几个主要环节？
（2）阪崎肠杆菌对婴儿的危害有哪些？目前还有哪些检测方法？
实验16 噬菌体的检测
1 目的要求
（1）熟悉噬菌体与宿主菌的相互关系。
（2）学习与了解噬菌体的分离，纯化，噬菌体效价的计量单位及测定方法。
2 基本原理
以细菌当作寄主的病毒称为噬菌体（bacteriophages）。噬菌体效价的计量单位是pfu和RTD。pfu是噬斑形成单位（phages forming units），表示形成一个噬斑所需有感染能力的最少噬菌体数量，以pfu/mL表示。RTD是常规试验稀释度(routine test dilution)，一般以平板上滴加噬菌体的部位刚刚能够出现的噬菌体稀释度。噬菌体有严格的寄生性，须在活的易感的细菌体内增殖，并能将菌体裂解，噬菌体对相应的细菌有强大的溶菌力和严格的种型特异性，因而可用于细菌的鉴定、分型，检测标本中未知细菌和防治某些疾病。
3 材料与试剂
3．1 仪器 温箱（36+1℃）、恒温水浴锅、微波炉。
3．2 材料 吸管（0.1mL、1mL及10mL）、平皿、酒精灯、试管架、L型玻璃棒、薄膜滤器（孔径0.45um）。 3．3 培养基及样品 营养琼脂，营养肉汤，污水等。
4 实验方法与步骤
4．1 噬菌体的分离
每份未处理污水样品取100mL加入到呈轻度混浊的宿主菌培养物（营养肉汤6 mL）中，混合后，36℃培养18h，观察培养液是否浑浊。若培养液透明，表明有噬菌体存在；如果培养液微浑或浑浊，则通过孔径为0.45μm薄膜滤器，检查滤液中是否有噬菌体存在。因为初次分离时，即使有噬菌体存在，不足以完全溶解所有细菌，所以培养液会有不同程度的浑浊。通常也采用斑点试验法检查噬菌体。具体步骤为：
（1）将宿主菌肉汤培养物（2h）用营养肉汤作1：100稀释后涂布在己烘干的营养琼脂平板的表面使成一薄层，放置数分钟，使液滴被琼脂吸干。
（2）倒转平板，在36℃培养过夜，次日检查结果，如有少量噬菌体存在，则在琼脂表面滴加滤液的部位出现孤立的噬斑，如有大量噬菌体存在，则噬斑融合，形成裂解区。 4．2 单斑纯化
140
根据斑点试验法的结果，估计滤液内噬菌体的数量。
（1）将滤液按百倍稀释法作两次连续稀释，即吸取0.02mL，稀释在2mL肉汤内，使成10-2，再吸取此稀释液0.02mL，稀释在2mL肉汤内，使成10-4。
（2）以琼脂双层法作单斑分离，融化营养琼脂倾注在一个直径9cm平皿内，在水平台面上使其凝固，然后在36℃半开皿约一小时以烘干表面水分。
（3）加热融化装有2.5mL半固体琼脂试管并置于55℃水浴箱内保温，临用时取出。
（4）将0.1mL稀释滤液、0.1mL宿主菌2小时肉汤培养物加入到2.5mL已融化好的半固体琼脂试管中混和均匀，立即倾注到准备好的琼脂平板上面，覆盖整个表面，在水平台上使其凝固，36℃下培养过夜，次日检查结果。
（5）次日，用接种针接触噬斑并略靠近边缘有菌的部分，放在小试管营养肉汤管壁上研磨洗入肉汤内。用同样方法，单斑纯化3次，如果在平板上仍有大小不等的噬斑出现，还须进行再次纯化。 4．3 pfu的测定
将装有2.5mL的半固体琼脂试管加热融化，放在55℃水浴箱内保温。临用取出，每管加入不同稀释度的噬菌体液0.1mL及4小时宿主菌肉汤营养物0.1mL，混和均匀后倾注到准备好的琼脂平板上，覆盖整个表面并在水平台面上使其凝固。一般做三个稀释度，即10-4，10-6，10-8，36℃下培养过夜，次日检查结果。选取噬斑数在30～300范围内的平板，作噬斑计数，记录结果N。
例如：噬菌体稀释液为10-8，0.1mL内N为140。
N = 140 =140×109=1.4×1011pfu/mL 稀释度×0.1 10-8×0.1
4． 4 RTD的测定
将宿主菌肉汤培养作1:1001:200稀释，即挑取12满环，稀释在1mL肉汤内。依次挑取1环，在琼脂平板上作斑点状涂抹，斑点的直径约1mm，共涂抹10个菌斑。略等数分钟，待菌斑表面水分干燥后在每个菌斑的依次滴加噬菌体稀释液0.01mL（配41/2号针头的乳头滴管，每1mL约为100滴；或直径为3mm接种环，每个满环约为0.05mL）。共做10个稀释度，即原液，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9。如用一个滴管加不同稀释度的噬菌体，应从高稀释度开始。待滴加的噬菌体液被琼脂吸干后，倒转平皿，在36℃培养5h或过夜检查结果。能产生融合性裂解的噬菌体最高的稀释度，即是该噬菌体的RTD。由于在两个稀释度之间有10倍的间隔，结果的判定不够精确，常可在两个稀释度之间插入几个稀释度，例如在10-410-5之间插入： 1:1.6×10-4， 即：10-4稀释液1mL加肉汤0.6mL 1:2.5×10-4， 即：10-4稀释液1mL加肉汤1.5mL 1:4.0×10-4， 即：10-4稀释液1mL加肉汤3.0mL 1:6.3×10-4， 即：10-4稀释液1mL加肉汤5.3mL
141
5 实验结果
将实验结果按下表标准记录
融合性裂解 程度的表示
CL 噬斑的数量与判定标准 ― ± + ++ +++ 本实验噬斑的数量 及判定结果 0～5 6～20 21~40 61~80 >120 6注意事项 （1）噬菌体液的稀释：为了减少稀释中的技术误差，稀释噬菌体液一般作连续百倍稀释。即吸取0.02mL稀释在2mL肉汤内；使成10-2；另换吸管，吸取此稀释液0.02mL稀释在2mL肉汤内；使成10-4；再换吸管，依次作10-6和10-8稀释。吸管内肉汤按吹出量计算，决不可把吸管插入新的肉汤管内，更不可在新肉汤管内吹吸。如还要作成10-3和10-5稀释，可分别取10-2和10-4稀释液0.2mL，稀释在1.8mL肉汤内。 （2）注意供纯化用的平板上噬斑数不宜太多，在一个平板上，中等大小的噬斑一般不超过200个，且要求噬斑之间必须有足够的空隙。 （2）琼脂平板的准备：一般倾注25mL营养琼脂到9cm的平皿中，该平板作为双层法的底层用，以及供平板裂解试验用。 7 思考题 （1）什么是温和噬菌体，什么是裂性噬菌体？ （2）什么是pfu，什么是RTD？ （3）一般采用什么方法检测噬菌体？ 实验17 食品中霉菌的计数及生物量的测定 1 目的要求 （1）学习与掌握用平板菌落计数法计数食品中霉菌的原理和方法。 （2）掌握测定霉菌生物量的方法。 2 基本原理 稀释平板菌落计数法是根据微生物在高浓度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞（孢子）繁殖而成这一培养特征设计的计数方法。先将待测定的微生物样品按比例作一系列的稀释后，再吸取一定量某几个稀释度的菌液于无菌培养皿中，及时到入培养基，立即摇匀。经培养后，将各平板中计得的菌落数乘以稀释倍数，即可测知单位体积的原始菌样中所含的活菌数。稀释平板菌落计 142 数法既可定性又可定量，所以既可用于微生物的分离纯化又可用于微生物的数量测定。霉菌和细菌计数均可采用此方法，区别只在于霉菌和细菌计数所用培养基不同，霉菌培养基里加入了抑制细菌生长的抗生素，另外霉菌培养所使用温度亦不同于细菌培养。 当然，也可以通过测定霉菌菌体的湿重和干重来测定霉菌的生物量，从而了解霉菌生长的状况。从微生物的培养物中收集菌体称重为菌体的湿重，经烘干后称重为菌体的干重。 3 实验材料 3．1 菌种 霉菌。 3．2 培养基 马丁（Martin）孟加拉红-链霉素琼脂培养基。 3．3 溶液 灭菌生理盐水。 3．4器材 温箱、振荡器、天平、显微镜、三角瓶、试管、平皿、吸管（1mL及10 mL）、酒精灯、载玻片、盖玻片、广口瓶、牛皮纸袋（121℃灭菌20min）、试管架、接种针、橡皮乳头、金属刀/勺、定量滤纸、分析天平、电热干燥箱、无菌培养皿等。 4 实验方法与步骤 4．1 食品中霉菌的计数 （1）采样 首先准备好已灭菌的容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属刀勺等。在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品。采样后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。 粮食（包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮）样品的采集，可根据粮囤或粮垛的大小类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分随机采取不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检。小量存粮可使用金属小勺采取上中下各部位的混合样品。 海运进口粮的采样为每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船舱盛粮超过10，000t，则应加采一个样品。必要时采取有疑问的样品送检。 谷物加工制品（包括熟饭、糕点、面包等）、发酵食品、乳及乳制品以及其它液体食品，用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。 （2）编号 取四只盛有9mL无菌生理盐水的试管，依次标记10-1、10-2、10-3、10-4。再取无菌平皿8套，仍然标记为10-1、10-2、10-3、10-4（每个稀释度做两个平皿）。 （3）稀释菌液 以无菌操作称取检样25 g固体样（或25mL液体样），放入盛有225mL无菌生理盐水的500mL玻塞三角瓶中，振荡30min，即为1：10稀释液。用灭菌吸管吸取1：10稀释液10mL，注入10-1试管中，另取一支带橡皮乳头的灭菌吸管反复吹吸多次，使霉菌孢子充分散开。取10-1稀释液1mL注入含有9mL灭菌生理盐水的10-2试管中，另换一只1mL灭菌吸管吹吸几次，此液为10-2稀释液。按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换一只1mL灭菌吸管，根据对样品污染情况估计，选择3个合适的稀释度（一般情况做10-2、10-3、10-4这几个稀释度），各吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿。整个稀释流程如图44-1所示。 143 图44-1 样品稀释流程 （4）倒平板、培养 菌液加入平皿后立即倒入融化并冷却至50℃左右的马丁孟加拉红-链霉素琼脂培养基，倒入量约为1015mL，随即快速而轻巧地晃动平板，使菌液和培养基充分混匀后平置，待琼脂凝固后，倒置于2528℃温箱中培养，第3d开始计数，共培养观察5d。 （5）计数菌落 取出平板，选取菌落数在10150个之间的平板进行计数。同稀释度的两个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数即为每克（或每毫升）检样中所含霉菌数。可用彩笔在皿底点涂菌落进行计数，以防漏计和重复。 （6）清洗平皿 将计数后的平皿在沸水中煮30min后清洗晾干。 4．2霉菌生物量的测定 将霉菌接种于适宜液体培养基中，28℃振荡培养57d，取定量滤纸两张（质量、大小相同），分别在分析天平上称重（a1和a2）。取其中一张定量滤纸（a1）将霉菌培养物进行过滤，收集菌体，沥干后称重（b），然后置于80℃干燥箱中烘干至恒重（c）。取另一定量滤纸（a2），用滤液润湿，沥干后称重（d）。 菌体的湿重=（b- a1）-（d- a2） 菌体的干重=（c- a1） 5 实验结果 （1）将各皿计数结果记录在下表 稀释度 每皿菌落数 X1 X2 144 X3 平均值 10-2 10-3 10-4 活菌数的公式为： 活菌数（个）/mL=（x1+x2+x3）/3×稀释倍数 （2）记录培养液中霉菌菌体的湿重和干重。 6 注意事项 （1）每只移液管只能接触一个稀释度的菌液，每次移液前，都必须来回吹吸几次，使菌液充分混匀。 （2）菌液加入培养皿后要尽快倒入融化并冷至50℃的培养基，立即摇匀，否则菌体常会吸附在皿底，不易分散成单菌落，因而影响计数的准确性。 7 思考题 用平板菌落计数法计数霉菌为什么要在培养基中加入孟加拉红和链霉素？ 实验18 苹果汁中棒曲毒素的检测 1 目的要求 （1）学习一种能够进行药品的鉴别，杂质检查，含量测定等的方法。 （2）对检样中棒曲霉素进行分析。 2 基本原理 很多食品如苹果汁、变质的苹果和梨、面粉及麦芽饲料中都发现有棒曲霉素。对苹果汁而言，棒曲霉素已作为判断其质量的一个指标。在苹果制成苹果汁的过程中, 棒曲霉素很少被破坏。棒曲霉素具有强烈的抗菌活性, 对动物的细胞和组织具有很强的毒性, 并具有潜在的致癌性和诱变性。经皮下注射棒曲霉素对小鼠具有致癌性, 但没有公开的毒理学和流行病学资料表明棒曲霉素对人类具有致癌性。 建立快速而灵敏的测定果汁或果酱中棒曲霉素的定性和定量方法一直备受关注。70 年代首先建立了薄层液相色谱法(TLC) (ＧＢ14974-94)。该方法经过不断完善，再配合显色剂和薄层扫描仪，能够获得比较好的结果。TLC方法的最小检测限为3μｇ/Ｌ。本试验即采用薄层层析法检测样品中的棒曲霉素。 也有采用高效液相色谱法(HPLC)检测该毒素（SN05-1996）。Moller 等和Kubacki 等还提出了快速反相HPLC检测方法,同时，气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联机法(GC-MS) 也相继用于检测棒曲霉毒素。 薄层液相色谱法是把吸附剂均匀铺在玻璃板上形成薄层，进行色层分离。 利用不同物质在固定相和流动相之间分配系数不同或不同溶剂对不同物质的吸附力不同来加以分离，TLC的一般操作程序分为制板、点样、展开和显色四个步骤，样品中真菌毒素经提取浓缩后，在薄 145 层板上展开分离，然后利用荧光或显色液显色确定斑点的位置，计算Ｒｆ值，最后与标准物Ｒｆ值比较，以鉴定毒素。 TLC进行定量有几种方法：一是薄层展开后将被测物斑点或区带捕集后用溶剂洗脱，然后再用适当的分析方法测定毒物含量，例如可使用比色法、荧光分析法等。另一是斑点面积测定法，即薄层层析后直接测量斑点面积，然后与标准物在同一条件下测得的斑点面积相比较加以定量分析。TLC具有灵敏度高，显色方便，可同时检出几种毒素等优点，缺点是样品提纯较敏锁，需要使用标准毒素，易造出环境污染。 3 实验材料 玻璃板、硅胶（GF254）、涂布器、点样器、展开室（层析槽）、薄层扫描仪、紫外光灯、薄层色谱展开剂、棒曲霉素标准品、乙酸乙酯、1.5％碳酸钠溶液、无水硫酸钠、三氯甲烷、显示剂 4实验方法与步骤 4．1 棒曲霉毒素的提取 量取25mL混匀的果汁，置于分液漏斗中，加等体积的乙酸乙酯，充分振摇，静置分层，留取有机相；加2.5mL的1.5％碳酸钠振摇1min，静置分层后，弃去碳酸钠层，同上步骤再用碳酸钠处理一次；将提取液滤入100mL梨形瓶中，于40℃水浴上用真空减压浓缩至近干，用少许氯仿清洗瓶壁,，缩干后加氯仿0.4mL定容备用。 4． 2 薄层板的制备 取硅胶GF254和水（1：3）混合，涂布玻璃板上，薄层厚度均匀（0.2～0.3mm），室温下晾干后, 110℃烘烤30min，放入干燥器中备用；或直接购买预制板。 4．3 配制溶液 展开剂——甲苯-乙酸乙酯-甲酸(50:15:1)；显色剂——溶解0.1g MBTH·HCl·H2O（3-甲基-2苯并噻唑酮腙水合盐酸盐）于20 mL蒸馏水中，置于冰箱中保存, 即用即配。 4．4 点样 用点样器（或微量注射器，或毛细管）点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，滴加20μL样液,同时点5μg/L 的标准液为对照。 4．5 展开 将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm,密封室盖,待展开至规定距离(一般为10～15cm)，取出薄层板，晾干。在254nm紫外灯下观察，出现黑色吸收点则样品为阳性。 4．6 阳性样品的确证 将阳性样品的薄层色谱板,喷以MBTH显色剂，130℃烘烤15min，冷至室温后，于365nm紫外灯下观察，棒曲霉素应呈橙黄色点。 4．7 定量测定 使用薄层色谱扫描测定。测定波长270nm；参考波长310nm；扫描速度40nm/min，录仪纸速20nm/min；测定标准及样品中棒曲霉素峰面积。 146 4．8 计算 棒曲霉素含量（μg/mL）=c×A/S×V×D×1/V1 其中c为棒曲霉素标准液浓度，μg/mL；A为样液棒曲霉素峰面积；S为标准溶液棒曲霉素峰面积；V为加入氯仿定容体积，mL；D为样液点稀释倍数；W为样品的重量，g；V1为液体样品的体积，mL。 5 实验结果 （1）观察并图示层析结果。 （2）计算样品中棒曲霉素含量。 6 注意事项 （1）该实验要戴口罩、手套，并在通风橱中完成提取以及分析步骤。 （2）点样时样品直径要尽量小，最好不要超过3mm，样品点吹干后再展开。 7 思考题 （1）该实验成败的关键步骤在那里，为什么？ （2）限量检测和定量检测的区别？ 实验19食品中黄曲霉毒素的检测 1 目的要求 （1）了解黄曲霉素B1的免疫学检测原理。 （2）熟悉花生中黄曲霉毒素B1的ELISA检测方法。 2 基本原理 1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。目前已分离鉴定出该组化学结构类似物有近20种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。黄曲霉毒素危害人及动物肝脏组织，严重时，导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。 黄曲霉毒素的检测方法很多，其中薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法，它的缺点是检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多，已不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的黄曲霉毒素检测方法。尤其免疫学方法应用较多，例如：酶联免疫吸附，免疫亲和柱法，免疫层析法等，虽然这些方法优点很多，但由于检测费用较高，无法普及。现今先进国家广泛使用的金标试纸法是一个检测方面的新亮点。 本试验采用间接性酶联免疫方法测试花生中的黄曲霉毒素B1。其基本原理为：已知抗原吸附在固态载体表面，洗除末吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液的混合液，竞争培养后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合，再加入酶底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。。 3 实验材料 3．1 试剂与溶液 抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，人工抗原(AFB1－牛血清白蛋白结合物),黄曲霉毒素B1 147 标准品，三氯甲烷，甲醇，石油醚，邻苯二胺(OPD)，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG，过氧化氢(H2O2)，硫酸，ELISA缓冲液，包被缓冲液，洗液(PBS－T)，抗体稀释液，底物缓冲液，封闭液。 3．2 仪器与用具 研钵、摇床、酶标仪、水浴锅、培养箱、酶标板、微量加样器、吸头、具塞锥形瓶、20目筛、移液管、量筒、烧杯、定性滤纸、蒸发皿、分液漏斗、具塞试管。 4 实验方法与步骤 4．1 花生的毒素提取 样品去壳去皮捣碎、研磨后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加入100.0mL甲醇-水(55：45)溶液和30mL石油醚。盖塞后150r/min振荡30min。静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中。 放出下层甲醇－水溶液于100mL烧杯中，从中取20.0mL置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置。 将三氯甲烷收集于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复上一步骤，一并收集三氯甲烷于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。 用2.0 mL 20%甲醇-PBS分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管，加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当于2.0g样品。 4．2 酶联免疫吸附测定(ELISA) ⑴ 包被微孔板 用AFB1－BSA人工抗原包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。阴性对照：在已包被好的酶标板孔中，加入7%甲醇PBS液与AFB1抗体，再加羊抗兔-辣根过氧化物酶，其OD值最高；空白对照孔：不包被AFB1-蛋白结合物，以下操作与阴性对照孔相同，其OD值最低。 ⑵ 封闭 已包被的酶标板用洗液洗3次，每次3min后，加封闭液封闭，250μL/孔，置37℃下1h。 ⑶ 抗体抗原反应 酶标板洗3×3min后，加抗体抗原反应液，100μL/孔，37℃，2h，以抗体稀释液为阴性对照；将黄曲霉毒素B1纯化单克隆抗体稀释后分别与等量样品提取液用2mL试管混合振荡后，4℃静置15min。此液用于测定样品中黄曲霉毒素B1含量。 ⑷ 酶标记反应 酶标板洗3×3min，加酶标二抗(1:2000，V/V)100μL/孔，1h。 ⑸ 显色反应 酶标板用洗液洗5×3min；加底物溶液(1mg OPD)，加2.5mL底物缓冲液，加37μL30% H2O2，待底物充分溶解后加入酶标板，100μL/孔，37℃，15min反应。 ⑹ 终止 加2mol/LH2SO4，40μL/孔，终止反应。 ⑺ 测定 酶标仪490nm测出OD值。 148 5 实验结果 （1）求出各孔的吸收校正值。 吸收校正值=吸收实测值－空白对照孔吸收值(均值)。 （2）求出待测样的吸收值 吸收(%)=[吸收校正值÷阴性对照孔吸收校正值(均值)]×100%。 （3）求出待测样AFB1含量(ng/g) 将待测样的吸收(%)值带入标准竞争抑制曲线，算出AFB1含量。（GB/T 5009.22—1996中，从标准曲线直接求得的数值，即为所测样品中黄曲霉毒素B1的浓度） 6 注意事项 （1）该试验的操作要求在通风厨中完成；检测时要戴口罩和乳胶手套，以防止标准品和浓缩检测液接触皮肤，或者进入呼吸道。 （2）试验用具要在4%的次氯酸钠溶液中浸泡以解除污染。 （3）本试验黄曲霉毒素B1标准曲线的绘制方法为：黄曲霉毒素B1抗体稀释后分别与等量不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液用2mL试管混合振荡后，4℃静置15min。测其OD值。以不同浓度的黄曲霉素标准溶液的浓度的对数值做横坐标，对应获得的A%做纵坐标，做标准竞争抑制曲线。 7 思考题 （1）本实验的检测限是多少？ （2）在检测中，多次温育的原理是什么？ 实验20 化学诱变剂的微生物检测实验——Ames法 1 目的要求 （1）了解Ames试验的基本原理。 （2）熟悉Ames法的检测步骤。 2 基本原理 食品安全中的一个重要问题就是食品安全性检测，化学物质致突变的主要检测方法之一，就是采用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typohimurium)—微粒体系统(简称Ames法)。由于化学物质对微生物的诱发突变的作用间接地反映了该物质对哺乳动物的潜在致癌性，而且这种方法简便、快速，准确性高达90%以上，已成为国际上公认的化学诱变检测常规方法。该方法还可用来探索化学物质导致遗传物质突变的分子基础，为研究遗传毒理、基因突变提供了一种有效手段。 1975年美国Ames等人用紫外线照射诱导鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株，筛选出若干不同的组氨酸营养缺陷突变菌株为测试标准菌株。它们除了组氨酸(histidine) 和生物素(biotin) 缺陷以外，还有紫外线切割修复系统(excision repair)缺失突变(^UVrB)和脂多糖屏障(lipopo—lysaccharide barrier)突变，形成细菌表面粗糙突变体（rfa）。TA 98和TA100菌株还带有抗氨苄青霉素(ampicillin)R因子。这些突变特性和R因子可作为鉴定菌株生物学性状的标记。鼠伤寒沙门氏菌的突变型(即组氨酸缺陷型)菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时， 149 则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型(表现型)，在含有生物素基本培养基平板内长出菌落。若诱发回复突变菌落数超过自发回复菌落数一倍以上为阳性反应，即待测化学物质是一种化学诱变剂。 许多化学物质体外检测是阴性反应，它是非诱变剂。但是经过体内肝脏某些酶的作用可以转变为诱变剂，Ames等人在检测化学物质过程中，加入由9000g高速离心处理后获得的大鼠肝脏提取掖(简称为s-9)，建立了鼠伤寒沙门氏菌-微粒体系统，大大地提高了检测的准确性。 3 实验材料 3．1 菌株 鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102。TA97和TA98可检测各种移码型诱变剂；TA100可检测引起碱基对置换的诱变剂；TA102能检出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂，如甲醛、各种过氧化氢化合物和丝裂霉素C等交联剂。一般用来测试受试物诱变性时，必须通过4个菌株的检测。必要时可增加TA1535，TA1537或TA104任一菌株。部分菌株诱变的标记见表47-1 表47-1 部分测试菌株的标记 菌株 组氨酸 缺陷型 TA1535 TA100 TA1537 TA98 野生型 3．2 仪器 低温高速离心机、液氮罐、洁净工作台、培养箱、水浴、蒸气压力锅、匀浆器等。 3．3 培养基及试剂 营养肉汤培养基，Ames检测底层培养基，Ames检测顶层培养基，氨苄青霉素平板，氨苄青霉素－四环素平板，组氨酸－生物素平板，10%s-9混合液，结晶紫溶液，二甲基亚砜等（具体配制见附录）。 His- His- His- His- His+ 结晶紫 敏感性 rfa rfa rfa rfa 不缺失 修复 缺陷型 ΔuvrB ΔuvrB ΔuvrB ΔuvrB 不缺失 突变的标记 生物素 缺陷型 bio- bio- bio- bio- Bio+ 抗生素耐药性 - R - R - 检测的 突变型 置换 置换 移码 移码 - 4 实验方法与步骤 4．1 试验菌株的特性鉴定 将试验菌株接种于5mL营养肉汤培养基中，37℃振荡(100次/min)培养10h或静置培养16h，备用。 （1）组氨酸缺陷型实验（his-鉴定） 加热融化底层培养基两瓶(his-，his+各一瓶)，不加组氨酸者仅加分子D-生物素0.6mL（0.5mg/100mL）；加组氨酸者须另外添加L-组氨酸1mL(0.4043g/100mL)，各倒两个平皿。 将菌株编号，并分别划线接种在有组氨酸和无组氨酸培养基平皿内，37℃培养48h，观察细菌的生长情况。 150 （2）结晶紫敏感试验（rfa鉴定） 加热融化营养肉汤琼脂培养基；取0.1mL菌液移入平皿，稀释倾注平板法接种；将一片无菌滤纸放入已凝固的培养基平皿，用移液器在滤纸片上滴加0.1%结晶紫溶液10μL，每菌做一个平皿，37℃培养24h，观察结果；阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在rfa(深粗型)突变。 （3）抗生素耐药性试验（R因子的鉴定） 用移液器吸0.8%氨苄青霉素10μL，在凝固的营养肉汤琼脂培养基表面依中线涂成一条带，待氨苄青霉素溶液干后，用接种环与氨苄青霉素带相交叉划线接种要鉴定的菌株，37℃培养24h，观察结果。 （4）四环素抗性的鉴定 用移液器各吸取5～10μL 0.8%四环素溶液和0.8%氨苄青霉素溶液，在营养肉汤琼脂培养 基平皿表面依中线涂成一条带，待四环素和氨苄青霉素液干后，用接种环与四环素和氨苄霉 素带相交叉划线接种TA102和一种有R因子的菌株(作四环素抗性的对照)，37℃培养24h。 （5）修复缺陷型实验（uvrB的鉴定） 在营养肉汤琼脂培养基平皿表面用接种环划线接种需要的菌株；接种后的平皿一半用黑 纸覆盖，在距15W紫外线灭菌灯33cm处照射8s，37℃培养24h。 （6）自发回变率的测定 准备底层培养基平皿8个；顶层培养基中分别加入待鉴定的测试菌株的菌液0.1mL，两个 重复，摇匀并迅速将此试管的内容物倾入已固化的底层培养基平皿中，转动平皿，使顶层培养基均匀分布，37℃培养48h计菌落数。 4．2 Ames试验 可分为平板掺入法、预培养平板掺入法及点试法等，本部分实验操作可以选择其中一种方法，我们的试验选择的是平板掺入法。 （1）增菌培养 接种菌株于5mL营养肉汤培养基试管中，37℃振荡(100次/min)培养，不少于1～2×109 cfu/mL活菌数. （2）处理 在45℃保温的顶层培养基中依次加入测试菌株新鲜增菌液0.1mL，混匀；加受试物0.05～0.2mL(需活化时加10%S－9混合液0.5mL)，再混匀，迅速倾入底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化；只加标准诱变剂的阳性对照以及空白对照要并行处理； （3）培养 37℃培养48h观察结果。 5 观察结果 以直接计数培养基上长出回变菌落数的多少而定，如在背景生长良好条件下，受试回变菌落数增加一倍以上(即回变菌落数等于或大于2乘以空白对照数)，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物为诱变阳性。 一般而言，本试验的阳性结果至少应做三次测试，阴性结果至少进行二次测试，才能对受试物作出 151 判定。受试物的诱变性要用平板掺入试验来确证。 6 思考题 （1）细菌检测致癌物质的依据是什么？ （2）该实验有何优缺点 （3）为什么要做试验菌株的特性鉴定？ 实验21 微生物的微量诊断系统 1 目的要求 （1）了解微生物微量诊断系统的工作原理。 （2）学习E75/15细菌鉴定系统的使用方法。 2 基本原理 微生物的微量诊断系统将各种不同的脱水试验培养基和指示剂吸附于滤纸或直接加入特殊的分隔室内，构成微量生化诊断卡。加入试验菌液培养后即能得到反应结果，从而用来对试验菌进行诊断与鉴定。 目前国内外开发出许多微生物的微量诊断系统。与常规的生化反应鉴定方法比较，微量诊断系统具有快速、准确、重复性好、操作简易和在人力、物力、时间、空间以及经济上节约等优点，是微生物快速检测、自动化诊断和鉴定的重要发展方向。国际上广泛使用的有API-20E系统和Vitek-AMS系统。 API-20E系统有20个塑料分隔室，即含有20种不同的脱水培养基，每一分隔室可进行一种生化反应，个别分隔室可进行两种生化反应，主要用来鉴定肠杆菌科细菌。另外，API系列的其他产品涵盖了几乎所有细菌群，可鉴定超过550个不同的种的细菌。 Vitek-AMS系统用于微生物的鉴定，自动化程度较高，对微生物的分析已被国际分析化学家协会（AOAC）列为法定分析方法。系统鉴定的微生物范围较广，可对69种革兰氏阴性菌、44种革兰氏阳性菌、27种酵母菌、65种厌氧菌和17种G（+）芽孢杆菌进行鉴定，总数超过400种微生物。 国内研制的系统主要为肠杆菌科细菌鉴定系统，如： （1）E-15系统 E-15系统有15个分隔室，各含一种供不同生化反应的脱水试验培养基，是一种微量快速生化鉴定肠杆菌科细菌的简易试验系统。 E-15系统由生化诊检卡、标准色板、编码检索表等组成，可鉴定肠杆菌科中14个属41个种。 （2）E75/15肠杆菌科细菌鉴定系统 E75/15系统通过16种生化反应项目，鉴定75种肠杆菌科细菌。 E75/15由15个含不同培养基的安瓿瓶组成。安瓿瓶接种细菌悬浮液培养一定时间后，通过代谢作用产生颜色变化，或加入试剂后会产生颜色变化，根据生化反应表判断反应结果，换算成数值编码，查阅E75/15编码表或软件，得到鉴定结果。 3 实验材料 3．1 被检细菌。 152 3．2 E75/15系统材料 15支安瓿瓶（1套）、氧化酶试纸1条、0.5麦氏浊度比浊管1支、灭菌水（制作细菌悬浮液用）、吲哚、V－P、苯丙氨酸试剂、液体石蜡。 3．3 实验器皿 灭菌试管、灭菌毛细滴管等。 4 实验方法与步骤 在分离平板上挑选单个菌落，菌体若革兰氏染色阴性、氧化酶试验阴性（可用试剂盒中提供的试纸）、发酵葡萄糖后，按下述方法进行鉴定。 4．1实验准备 从包装盒中取出安瓿瓶，朝易折点（瓶颈上方蓝点）反方向用力折开安瓿瓶，按顺序插入安瓿瓶架中。 如果需要对多支菌株进行鉴定，需对试验菌株顺序标记。 4．2 接种物的制备 （1）取一灭菌试管，内盛2mL的无菌水； （2）用接种针从选择性平板上挑取单个菌落至无菌水中； （3）仔细研磨以制备0.5麦氏浊度的均一细菌悬浮液（与试剂盒中的浊度管比较）； （4）同时，取同一菌落进行氧化酶试验：取出一条氧化酶试纸放于平皿中，用一滴无菌水润湿纸片，用接种针将试验菌落涂于纸片上（避免接触铁质），一分钟内出现紫色者为阳性反应，无色者为阴性。 4．3 接种 （1）用接种针挑取同一菌落穿刺于半固体琼脂安瓿瓶（动力试验）。 （2）用试剂盒中的一次性吸管吸取菌悬液依次滴入其余安瓿瓶中，每瓶3滴。 （3）接种后，在鸟氨酸、赖氨酸、硫化氢和尿素安瓿瓶中覆盖液体石蜡，每瓶4滴。 （4）36℃培养1824小时（安瓿瓶无需加盖）。 4．4 结果观察与记录 （1）培养后，取出安瓿瓶，吲哚、V－P、苯丙氨酸安瓿瓶中需加入试剂观察结果。 * V－P试验：加6滴VP甲和3滴VP乙试剂，1小时后，出现浅粉红色和红色为阳性反应，否则为阴性。 * 吲哚试验：加2滴吲哚试剂，上层立即出现粉红色为阳性反应，否则为阴性。 * 苯丙氨酸试验：加2滴苯丙氨酸试剂，立即出现绿色为阳性反应，否则为阴性。 4．5 编码的检索方法 根据各项生化反应结果，按记录编码表的顺序，把三个生化试验编为一组，其顺序代号分别是4、2、1三个数字，凡结果阳性者记“+”，阴性者记“-”。15种生化反应编为五组，将每组生化反应阳性者的代号数相加即得编码数，全阳性编码为7，全阴性编码为0，这样就形成了5位数字的编码。 表49-1 E75／15 生化反应表 序 试验 阴性结果 阳性结果 序 试验 阴性结果 阳性结果 号 项目 号 项目 153 穿刺线（红线） 穿刺线周围呈 1 动力 清晰周围无变 红色雾状 化 2 3 4 5 6 7 8 鸟氨酸 赖氨酸 柠檬酸盐 硫化氢 尿素 吲哚 VP 黄色 黄色 淡绿／黄 无色／微灰 黄色 无色 无色 红色／粉红 红色／粉红 蓝绿／绿 黑色沉淀 红／橙色 粉红／红色环 粉红／红色杯 10 11 12 13 14 花醇 15 棉子糖 紫色／紫灰 黄色／淡黄 甘露醇 肌醇 山梨醇 蜜二糖 侧金盏 紫色／紫灰 黄色／淡黄 紫色／紫灰 紫色／紫灰 紫色／紫灰 紫色／紫灰 黄色／淡黄 黄色／淡黄 黄色／淡黄 黄色／淡黄 9 氨酸 苯丙 无色／微黄 淡绿／绿色 例如：某细菌经分离培养，挑选单个菌落，先确定该菌为革兰氏阴性、氧化酶阴性、发酵葡萄糖，符合肠杆菌科定义，然后按常规方法进行表49-2的15项生化反应。36℃培养1824小时后根据表49-1 E75／15 生化反应表记录反应结果，然后按表49-2方法得出编码后，检索编码表。 表49-2 15项生化反应得出的编码及检索结果表 试验组 1 动力 试验 赖氨酸 鸟氨酸 2 柠檬酸盐 硫化氢 尿素 3 吲哚 VP 苯丙氨酸 4 甘露醇 肌醇 山梨醇 5 蜜二糖 侧金盏花醇 结果 单值 总值 － 4 3 ＋ ② ＋ ① ＋ ④ 4 － 2 － 1 － 4 0 － 2 － 1 ＋ ④ 7 ＋ ② ＋ ① ＋ ④ 6 ＋ ② － 1 棉子糖 鉴定编码：34076。查检索表得鉴定结果为：粘质沙雷氏菌，概率100％。 5 实验结果 （1）将结果填入E75/15鉴定系统原始记录单。 根据所得的编码，查E75/15编码检索表，得到试验菌株的分类答案。也可将实验所得的编码输入计算机，使用鉴定软件查阅，得到试验菌株的鉴定答案。 6 思考题 154 根据实验结果，你认为微生物的微量诊断系统有什么优点？有何不足之处？ 实验49 食品加工过程中微生物的快速检测 食品(含原料、中间产品)中的微生物数量，是判定食品被微生物污染程度的标志，也可作为观察食品中微生物的性质以及微生物在食品中繁殖的动态，以便对被检的食品进行卫生学评价。常规方法中的“菌落总数测定”和“霉菌和酵母数的测定”主要是用于评价食品品质的，而“大肠菌群测定”则是评价食品卫生质量的重要指标。因此，微生物数量的检测经常用于各种食品和食品加工场所、加工工具的卫生检查。一般的微生物检测，均为活细胞计数，需要将微生物培养成肉眼可见的菌落才可确认，因此比较麻烦，耗时较长，不能适应现代化食品生产的要求，食品中微生物的快速检测成为亟待解决的问题。 一 食品中微生物的微量快速检测 1 目的要求 了解4种快速检测食品中微量微生物的方法、原理与基本操作。 2 基本原理与操作方法 2．1疏水性栅格滤膜法 疏水性栅格滤膜法可用于菌落总数、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌及霉菌、酵母的检测。 基本原理 用疏水性栅格滤膜（HGMF）过滤样品，然后把疏水性栅格滤膜放置在相应的固体培养基中培养，最后观察细菌、酵母菌或霉菌菌落。疏水性的栅格作为栅栏以防止菌落的 扩散，保证所有菌落都是正方形的，从而便于人工或机械计数。 图 49-1 HGMF过滤装置 仪器和试剂 HGMF过滤装置见图49-1，5μm网眼的初滤膜，孔径为0.45μm并以无毒疏水材料印成栅格的滤膜，均质器，各种酶和稀释液。 操作方法 使用HGMF过滤装置，先经5μm网眼的初滤膜过滤去除食品颗粒（每个样品需要一套），再经孔径为0.45μm并以无毒疏水材料印成栅格的滤膜。首先将样品均质、稀释后（某些样品需要进行酶处理），根据要求的计数范围选择适宜的稀释度用于检验，通常选用1：100的稀释倍数。操作时首先打开真空泵，将灭菌过的过滤装置连接于多枝管或真空抽滤瓶上。打开夹具1，向后转动漏斗3，以无菌操作将灭菌的HGMF放于底座的表面上。向前转动漏斗，用不锈钢夹具的滑动夹片将漏斗3和底座4延伸的整圈边缘2夹住，旋转移动臂8于水平（闭锁的）位置。以无菌操作加约15~20mL无菌水于漏斗中，吸移所需要体积的适宜的样品稀释液放于漏斗中，将真空管5的自由端接于吸孔6以通过前过滤器孔7抽吸液体进行初滤；再用无菌操作加入另外的15～20mL无菌水于漏斗中再次抽吸后关闭夹具1，使真空泵直接作用于过滤装置的底座，通过HGMF抽吸液体。然后以无菌操作取出HGMF，并放在预先干燥的琼脂平板表面(避免在滤膜和琼脂之间产生气泡)，用适宜的温度培养后，按阳性方格计数。 根据选用的培养基不同可用于菌落总数、大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌计数，还可以用于 155 霉菌和酵母菌计数，另外还可根据菌落在培养基上产生的不同颜色来分类计数。 经AOAC认可的方法主要有：AOAC公定方法986.32《食品中的需氧平板计数疏水性栅格滤膜法》；AOAC公定方法983.25《食品中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌疏水性栅格滤膜法》；AOAC公定方法995.21《食品中的酵母和霉菌计数——疏水性栅格滤膜法(1SO-GRID)使用YM—11琼脂方法》。 2．2 皿膜系统法 皿膜系统可用于菌落总数、大肠菌群、大肠埃希氏菌、霉菌、酵母和金黄色葡萄球菌等的检测。 原理 皿膜系统由双层膜构成。在双层膜系统内含有干燥的营养物质(类似平板计数琼脂培养基或其他的选择性培养基成分)和冷水可溶的胶体物质，以每系统1mL的加样量将样品(稀释或未经稀释的样品)直接加到基础膜中间，盖上含有胶凝剂和TTC的覆盖膜，培养后细菌在双层膜之间生长并显色即可直接计数。 仪器和试剂 专用培养箱或普通培养箱、塑料涂布器、菌落计数器 操作方法 将皿膜系统置于平面上，掀开上层覆盖膜，取1mL样品加在基础膜中间，盖上上层膜用塑料涂布器在膜上轻轻向下按压以使样液均匀分布在规定的生长区内；然后静置lmin使凝胶凝固，再置于培养箱内培养(根据需要选择培养温度和培养时间)后取出计数，菌落有各种深或浅的红色，如为大肠菌群计数，则计数有气泡产生的菌落。为了分离菌落作进一步鉴定，可拉起上面的膜，挑取凝胶处的菌落。 代表方法有：AOAC 986.33《牛奶中的细菌和大肠菌群计数》；AOAC 9.10《乳品中的细菌和大肠菌群计数》；AOAC 990.12《食品中需氧平板计数》；AOAC 991．14《食品中大肠菌群和大肠埃希氏菌计数》；AOAC 996.02《乳制品中的大肠菌群计数》；AOAC 997.02《食品中酵母和霉菌计数(PertrifilmTM方法)》。 2．3 酶底物法 酶底物法可用于大肠菌群和大肠埃希氏菌计数，采用此技术的方法已被列为国家标准（GB/T47.32-2002）。 原理 存在于食品样品中的大肠菌群特有的β－D－半乳糖苷酶系统能将5－溴－4－氯－3－吲哚－β—D—吡喃半乳糖苷分解为5－溴－4－氯－3－吲哚，该中间产物经过氧化生成水不溶性蓝色的二聚物。β－葡萄糖苷酶为大肠埃希氏菌(埃希氏菌和志贺氏菌)和一些沙门氏菌所特有，能将4—甲基伞形酮—β—D—葡萄糖苷（MUG）分解为葡萄糖苷和甲基伞形酮，可在长波UV光下(366nm)产生荧光。以此作为确认是否有大肠菌群和大肠埃希氏菌存在的依据。 仪器和试剂 均质器、涡旋混合器、培养箱、UV光源(366nm)、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST)、酶底物载体圆片SSD（含有5－溴－4－氯－3－吲哚—β-D-吡喃半乳糖苷和MUG的直径5mm的聚乙烯圆片）、磷酸盐缓冲稀释液。 操作方法 以无菌操作称取50g样品，加入450mL灭菌稀释液，均质后取l0mL样液加90mL灭菌稀释液，10倍梯度稀释、振荡混匀。然后选择适宜的连续样品稀释度接种于LST管中，以无菌操作每管加入一片SSD于35℃培养。最后进行结果判定。 总大肠菌群：培养24h后，试管中的圆片或培养基周围出现蓝色为阳性反应。若为阴性则需再培养 156 24h后观察，仍无蓝色出现则判定为阴性，否则为阳性。 大肠埃希氏菌：培养至30h土2h后，在366nm的UV光下检测试管（不要直视光源）产生荧光的试管为阳性结果。 2．4直接外荧光法 直接外荧光技术是测定许多食品如奶、肉、禽和禽制品、鱼和鱼制品、水果和蔬菜、啤酒和葡萄酒、辐射食品等食品及水中的微生物的快速方法。 原理 利用紫外光显微镜来快速测定活菌数。首先用一特殊滤膜过滤样品，经吖啶橙染色后，用紫外光显微镜观察，活细胞呈橙色荧光，死细胞呈绿色荧光。 仪器和试剂 过滤装置、落射光荧光显微镜、36％的甲醛、0.1％的吖啶橙溶液、0.2μm的聚碳酸酯滤膜。 操作方法 取10mL液体样品于试管中，加入0.5mL 36％的甲醛固定样品，将2mL0．1％的吖啶橙溶液加入样品中，染色3min，然后将细菌过滤到事先用Irgalan黑染色的聚碳酸酯滤膜上，滴上一滴无自发荧光的香柏油，盖上盖玻片，置于落射光荧光显微镜油镜下计数10个视野中的细菌数，经测量视野面积及滤膜有效面积而换算出样品中所含细菌数量。 吖啶橙染色计数法在国外已逐步作为细菌计数的一种标准方法，应用于水、食品等领域。 二 食品中微生物数量的快速估测 1 目的要求 了解阻抗法和食品中微生物快速鉴定的基因芯片技术快速估测食品中微生物数量的方法、原理与基本操作。 2 基本原理与操作方法 食品中微生物的快速估测将物理、化学领域中的新知识、新技术应用于微生物检测，通过测量微生物在生长和代谢活动中发生的变化来估测微生物的数量。 2．1 阻抗法 阻抗法是用电阻抗作为媒介，测定因微生物生长而产生的阻抗改变，从而对微生物数量进行快速估测。 阻抗法近年来已逐步用于食品检测之中，如法国的Bathometer系统已可用于乳制品、肉类、海产品、蔬菜、冷冻食品、糖果、糕点、饮料、化妆品中的总菌数、大肠菌群、霉菌和酵母计数、乳酸菌、嗜热菌测试，比传统方法减少了检验时间，结果准确。 阻抗法的主要优点是可以进行数据自动测试、自动分析储存，但必须预先制定相应的标准曲线方可对样品进行测试。 （1）Bactometer系统 原理 当细菌生长时，周围液体的电导发生变化，通过测定阻抗或电导，可以了解微生物的活动。Bactometer系统是利用阻抗变化来检测微生物。系统测定细菌的阈值为106~107个／mL，酵母阈值为102~104个／mL。Bactometer系统可同时处理～512个样本。 157 仪器设备及试剂 Bactometer系统(由BPU电子分析器／培养箱、电脑、彩色终端机及打印机组成)，专用培养基，一次性反应检测盒，加样器。 操作方法 开机后打开BPU选择试验类型(检测样品的标准曲线须预先制定)，将培养基加入检测盒的检测池内，每一池加0.5－1.0 mL，将选择好所需要稀释度的样品每一池加0.1mL，将检测盒插入培养箱内的电极板上培养，检测结束后仪器将自动分析检测结果。 （2）Malthus微生物快速分析仪 原理 微生物在培养基中生长时，由于本身的代谢作用，将培养基中的生物大分子(如蛋白质、脂肪、糖等)分解成带电荷较多的小分子(如氨基酸、脂肪酸等)，导致培养基中的电导度增加。Malthus系统是以电阻为检测讯号，将电阻转换为电导度。电导度产生改变的时间是与初始菌数成反比，污染量越高，得到结果的时间越快。 仪器设备及试剂 Malthus Microbial Analyser系统、备有专用的检测瓶和培养基。 操作方法 将样品注入含液体媒介的检测瓶中(固体先在稀释液中均质，液体直接注入)，然后将检测瓶放入分析仪中分析，微生物污染的程度会自动检测和报告出来。 （3）ATP生物发光技术 ATP生物发光技术是利用产生于生物体内的化学发光现象而建立起来的检测方法。 原理 所有的生物都含有ATP，当荧光素酶系统和ATP接触时就会发光。萤火虫荧光素酶以荧光素(1uciferin)、ATP和O2为底物，在Mg2存在时将化学能转变成光能的高效生物催化剂，催化D－荧 ＋ 光素(D-1uciferin)氧化脱羧，同时发出光，最大发射波长为562nm，但酶结构不同则发射光略有不同。 Luciferin+ATP+O2 MgoxyluciferinAMPPPiH2O Luciferase2 （荧光素） （氧化型荧光素） （焦磷酸盐） 测定时先将样品与ATP提取试剂混合，使细胞膜和细胞壁开孔，提取出ATP，然后再与荧光素和荧光素酶生物发光试剂作用，用荧光仪进行测定。 检测仪器和试剂 用于微生物ATP测定的仪器较多，如ATP测定仪AF－100，Charm LUM－T和生物光测定仪Biometer、Lab-LineATP光度计等。试剂为ATP提取液，生物荧光试剂。 2．2 食品中微生物快速鉴定的基因芯片技术 基因芯片是将核酸或核酸片段按照一定顺序排列在固相支持物上组成密集的分子阵列，利用核酸杂交原理检测未知分子。按照其结构基本上可分为两种类型： I型，将待测 DNA分子样品固定在固相支持物上并与一系列游离的标记探针杂交，杂交探针或是单一的或是混合的；II型，按照预先设定顺序将寡核苷酸固定于固相支持物上再与标记的DNA样品进行杂交，由已知的寡核苷酸序列确定被检测的DNA样品。通过检测标记信号的分布谱型（Pattern）得到分子杂交情况，并由计算机分析处理。 目前的基因芯片技术可用于微生物的定性和半定量检测，但主要用于定性检验。 Ribo Rrinter®全自动细菌自动鉴别系统采用基因芯片技术鉴定和鉴别微生物，仪器的计算机自动分析软件自动将结果与数据库内贮存的标准菌株进行比较，并提供结果报告。 158 36±１℃ （1）RiboPrinter®系统的工作原理 微生物细胞经裂解剂处理后释放出DNA，性内切酶将DNA消解成片段，然后将DNA片段转移到一个有13个孔的琼脂凝胶盒中，将样品放入其中的8个孔内，另外5个孔则加入已知分子量的标记DNA（marker DNA）做参照，再进行电泳，DNA片段根据分子量的大小分离并自动转移到一个与电泳方向垂直移动的尼龙膜上，将膜上的DNA片段变性后，与一个由E．Coli得来的化学标记的rRNA操纵子杂交，将膜用缓冲液和防磺化的DNA抗体／碱性磷酸酶结合剂清洗和处理，然后与化学发光底物结合。 RiboPrinter®系统特制的CCD照相机捕集包含有rRNA基因信息的电泳条带，CCD相机检测到谱带的光强度并将发光DNA片段转化成数字信息模式，存储于系统计算机的硬盘。计算机将上述5个标记DNA片段的光强度和位置进行归一化处理，再对样品进行数算后输出数据。通过与数据库的已知标准菌株比较，系统自动产生报告，给出每个样品的鉴别或鉴定信息。 （2）仪器和试剂 RiboPrinter®全自动细菌自动鉴别系统，加热器，手持搅拌器，细胞裂解剂，性内切酶，标记DNA，rRNA操纵子，防磺化的DNA抗体／碱性磷酸酶接合剂， 缓冲液，琼脂糖及尼龙膜等。 （3）操作方法 样品制备：用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取要分析的菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活。 上机检测：将样品架放入RiboPrinter®系统中，系统将自动进行以下步骤。 a．DNA制备 从细菌细胞裂解液中提取DNA并用性内切酶将DNA切成片段。 b．分离转移 通过凝胶电泳按DNA片段分子量大小将其分离，然后将DNA片段转移到膜上。 c．检测 用一个标记的DNA杂交后，导入化学发光试剂，从杂交片段发射的光由数码相机记录并存储为图像数据。 d．数据处理 使用专用数算模型，从每一个样品的图像数据中提供一个RiboPrinter®模式，与储藏在系统中的其他模式进行比较，以鉴别或鉴定样品。 e．打印报告 系统自动打印鉴别或鉴定细菌的报告，数据分析工具可进一步处理信息并在网络用户中分享标准化信息。 3 思考题 （1）食品中微生物的快速测定有何意义？ （2）食品中微生物的定性快速检测有何用途？ 159
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容
Copyright © 2019- 91gzw.com 版权所有 湘ICP备2023023988号-2
违法及侵权请联系：TEL:199 18 7713 E-MAIL:2724546146@qq.com
本站由北京市万商天勤律师事务所王兴未律师提供法律服务