RNA干扰技术在肿瘤研究中的应用

基础兽医 陈洪博 S2008467

摘要 RNA干扰（RNAi）是由双链RNA（dsRNA）引起的与其同源的mRNA特

异性降解，导致转录后基因沉默。RNAi技术比传统的反义寡核苷酸技术更加有效，为在体内、外研究基因的功能提供了快速而相对简便的途径，并可能成为治疗肿瘤等疾病的有效手段。RNAi技术可以通过各种策略直接靶向肿瘤治疗。RNAi可以抑制癌基因、生长因子及其受体的过表达而抑制细胞生长；通过干扰细胞周期蛋白及其相关基因的表达可以抑制细胞增殖；靶向耐药基因的RNAi 有利于肿瘤治疗。

关键词 RNA干扰；肿瘤

近年来，生命科学领域内最令人兴奋的发现之一是RNA干扰（RNA

interference，RNAi）。RNAi是在mRNA水平上由内源性或外源性双链RNA double-stranded RNA, dsRNA 诱发的高度特异的转录后基因沉默[1]，是生物体清除病毒等外源性核酸或突变及异常表达内源性基因的一种自我防御机制。由此而引发的RNA干扰技术很快成为一种新的研究基因功能的方法。

1 RNAi 的发现

Napoli C和van der Krol Ar（1990）等所在的两的研究小组尝试着通过插入额外的色素合成基因来加深紫色牵牛花的颜色。结果转入的基因和与其相似的内源色素基因均被降解了，导致着色表型的缺失，牵牛花不但紫色未加深，反而变成杂色甚至白色了。这种与预期结果相矛盾的现象被称为“协同抑制”(co-suppression) [2][3]。不久，Cogoni C和RomanoN等在丝状菌类的研究中也发现这种由导入基因介导的基因沉默现象，被称为“阻抑”（quelling）[4][5]。1995年，Guo S等采用反义RNA技术研究华丽新小杆线虫（caenorhabditis elegans，C. Elegans）par-1基因功能，实验设计以正义链RNA为阳性对照，试图观察到基因表达的增强， 但结果是正义RNA和反义RNA均阻断了par-1基因的表达，此结果令他们困惑不解。直到1998年，Fire A等人首次将与内源性mRNA序列同源的dsRNA注入线虫体内，有效地干扰了此mRNA的表达，从而解释了Guo S的实验中是由于污染了dsRNA，而高效率地干扰了靶基因的表达，并由此创造了“RNAi”这一新名词[7]。

现发现RNAi现象广泛存在于生物界中，如低等的植物、真菌、线虫、果蝇、斑马鱼、及哺乳动物体内，是其抵御病毒感染，阻断转座子作用的进化保守的防御机制，可在RNA水平基因表达。

2 RNAi的作用机制

RNAi 的作用机制尚未完全清楚,据目前的研究成果来看主要有3 种形式,即转录水平、翻译水平和转录后水平。其中转录后水平是RNAi 在各种生物中实现的主要方式,其机制研究也较深入。 2.1 转录水平和翻译水平

转录水平上的干扰机制是通过对靶基因染色质结构的改变,使其基因转录受限,导致表达系统的关闭。dsRNA 被降解成21 个～23 个核苷酸长的小片段RNA 时,这些小的RNA 分子在细胞核可以诱导组蛋白H3 的基因及相应DNA 的甲基化[ 10 ]

。这种序列特异性甲基化的信号与RNA 和DNA 结合有关。当dsRNA 含有与启动子同源的序列,即可使同源靶启动子序列甲基化,从而使靶启动子失去功能,导致下游基因沉默,则转录不能进行。若甲基化出现在编码区,转录能进行,但在转录后水平上沉默。非致病病毒造成转录水平的基因沉默,最先发现于菜花样花叶病毒上,其35 S 启动子转录得到含有胭脂碱合成酶启动子(NOSp ro) 序列的NOSproRNA。在转基因烟草中, 据报告未腺苷酸化的NOSpro dsRNA 可以诱导同源NOSpro DNA 的甲基化,并使拷贝在转录水平上反式失活。在链孢霉属,DNA 的甲基化可能是异染色质siRNA 介导的组蛋白H3 K9 的甲基化,是由H3 甲基转移酶催化的[1 2 ] 。翻译水平上的干扰机制,是通过抑制相应mRNA 的翻译,使相应的蛋白质表达受阻。其中起重要作用的是微RNA (micro2RNA ,miRNA) ,它是由长度约70 nt 的RNA 形成的茎环样前体,经Dicer酶作用后形成长约21 nt～25 nt 的单链RNA ,与相关蛋白结合成RISC 复合体。然后识别并结合在mRNA 的3′末端非翻译区上,阻止核糖体与mRNA的结合及核糖体的移行,从而抑制翻译的进行。

2.2 转录后水平

目前, 在有关RNAi 发生机制的研究中, 转录后水平上的干扰是研究的最多、最清楚的一种机制。其作用大致可分为以下两个阶段。

2.2.1 siRNA 形成阶段。外源性(如病毒RNA 复制的中间体或人工导入的dsRNA) 或内源性(如细胞中单链RNA 在RdRP 的作用下形成的dsRNA)dsRNA 通过Argonaute 家族基因编码的蛋白质的识别,进一步诱导dsRNA 与Dicer 结合。目前已经分离出多个Argonaute 家族蛋白, 包括线虫中的RDE21 ,果蝇中的A GO21 、A GO22 、Aubergine ,锥虫中的TbA GO1 TbPWI1[13 ] ,人类细胞中的PI2WI亚族(4 个) 和eIF2C/ A GO 亚族(4 个) [14 ] 。dsRNA和Dicer 结合后, 在A TP 的参与下被Dicer 酶(RNase Ⅲ) 切成21 nt～23 nt 长度的小干扰RNA( small interfering RNA , siRNA) 。Billy E 等[1 5 ] 在小鼠畸胎瘤细胞F19 和P19 的细胞质提取物中发现长727 bp 的dsRNA 被剪切为约21 nt ～23 nt 片段,即siRNA , 其强烈抑制了同源基因的表达。Elbashir S M[1 6 ] 等从发生沉默的果蝇细胞中分离出siRNA ,可在果蝇胚胎裂解液和果蝇S2 细胞中(标准果蝇细胞系) 诱发特异性的基因抑制。Dicer 切出的siRNA 两条链末端均为5′2 P 和3′2 OH ,3′末端各有两个突出的核苷酸。切割后的siRNA 的一条链与蛋白复合物结合成RNA 诱导沉默复合物(RNA2induced silencing complex , RISC) 。它由多种蛋白质成分组成,包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 链搜索活性酶等。Zamore P D 等[17 ] 报道,无活性RISC 存在于胚胎细胞中,并以250 ku 分子质量的前体形式存在, 在A TP 激活下加工成100 ku的RISC ,切割底物mRNA。RISC 与互补的靶mRNA 结合,在酶的催化下切割、降解,从而达到干扰基因表达的作用。

2.2.2 扩增循环阶段。

RNAi 的扩增循环机制,是由Lipardi 等通过对果蝇胚胎提取物研究后提出的。如果特异性siRNA 与靶mRNA 结合后,没有被活性酶切割、降解;而是以siRNA 中的一条链为引物,以靶mRNA 为模板, 在RNA 依赖的RNA 聚合酶

(RNA2dependent RNA polym erase , RdRp) 的作用下, 延伸形成新的dsRNA ,

被Dicer 内切酶或相关酶切割为新的21 nt ～23 nt siRNA (即次级siR2NA) 。Dicer 内切酶是Bernstein E 等[18 ] 从果蝇中分离出一种能特异性降解dsRNA 的核酸酶, 属于RNase Ⅲ核酸酶家族成员。Dicer 具有以下结构域,即与A rgonaute 家族同源的PAZ 区域、Ⅲ型RNA酶活性区域、dsRNA 结合区域以及DEA H/ DExHRNA 解旋酶活性区,在其进化中高度保守。试验发现,在对dsRNA 分子降解时,2 个Dicer 能够形成二聚体。每个二聚体包括4 个活性中心, 在降解RNA 时其中的2 个要失活, 从而使降解过程间隔进行。这个间隔正好为22 个核苷酸, 即每隔22 个核苷酸Dicer 将dsRNA 降解一次。然而, Dicer 结构上的微小改变将会引起间隔的改变, 所以不同的物种产生的siRNA 长度也略有不同。次级siRNA又能再次与相关蛋白质形成RISC , 继续反作用于靶mRNA , 令其切割、降解。这就使作为模板的dsRNA 和作为引物的siRNA 都能得到循环扩增,从而使RNAi 具有惊人的潜力和强大的扩增效应。转基因RNA 和病毒RNA 都在RdRP 的识别下启动RNAi 的反应过程。

此外,RNAi 的扩增效应还可能存在另外两种机制: ①Dicer 将长dsRNA 切成初级siRNA ,这一放大水平取决于dsRNA 的长度。②siRNA 在酶的作用下可以多次应用,产生进一步的放大效应。这些扩增机制只是一种推测,是否存在尚需进一步的实验研究确定。

3 RNAi技术与反义寡核苷酸技术的比较

与传统的基因功能研究方法反义寡核苷（antisenseoligodeoxynucleotides AS ODN）技术相比，两者均是在转录后水平上抑制靶向基因的表达，但AS ODN通过碱基配对关系与靶mRNA 5’端编码区，主要是与起始密码AUG结合，或与5’端非编码区结合，如SD序列或核糖体结合位点（RBS），直接或间接抑制翻译；此外，有研究发现，细胞核内ASODN与mRNA形成互补链，还可能阻断mRNA向细胞质转移，使其蛋白质的翻译过程不能正常进行，从而阻断了翻译过程。而siRNA的设计却要避免选择5’和3’端非编码区和起始密码区，因为这些地方有丰富的蛋白结合区域，这些非编码区结合蛋白或翻译起始复合物可能会影响RISC结合mRNA，从而影响RNAi效果。AS ODN是在核内与前体mRNA结合而发挥作用，而siRNA是胞质内与成熟mRNA结合而使其降解，而且适合于AS ODN的mRNA序列并不一定是siRNA的靶序列，这与两者的靶序列二级结构有关。其次，如前所述，RNAi具有放大效应，其抑制效率远高于AS ODN技术，siRNA通常只需AS ODN几十到几百分之一的浓度即可取得相同效果的靶基因表达抑制。再次，与AS ODN技术相比，RNAi具有高稳定性。siRNA分子是3’端有突出的非配对碱基的双链分子，使其不易被细胞内的核酸酶降解，在细胞内可稳定存在3~4天，半衰期远长于AS ODN，不必像AS ODN那样需要进行广泛的化学修饰。另外，针对靶基因的siRNA分子很容易选定并可用现有的化学工业常规方法快速合成，而AS ODN技术通常需要花费很长时间去寻找活性AS ODN分子。

4 RNAi技术在肿瘤研究中的策略

作为一种更为有效的抑制基因表达的工具，RNAi技术很快取代了ASODN技术，成为基因功能研究的首选工具。由RNAi引起的基因敲除是暂时的，但是通过质粒转染靶组织或靶细胞可以得到稳定的RNAi。siRNA的长期表达使得RNAi后对基因功能进行长期分析成为可能。肿瘤的发生、发展涉及到原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的异常表达过程，部分自分泌生长因子和受体以

及部分关键酶的过量表达也与细胞癌变有密切关系，所以可以把在细胞癌变过程中发挥重要作用的基因、蛋白作为靶点，应用RNAi技术使其表达下降，癌细胞生长受到抑制，从而达到治疗的目的。目前还主要处于实验研究阶段，真正用于肿瘤的治疗还有很长的路要走。

4.1 癌基因作为靶基因

某些癌基因的激活会造成信号通路的紊乱，影响细胞的正常生命过程而引起肿瘤。siRNA可以特异地封闭这些基因的转录产物而不影响其他基因的表达。K-ras基因突变是胰腺腺癌进展的早期事件，所以直接针对突变的K-ras基因的RNAi可以实现治疗效果。Fleming JB等在Panc-1和MiaPaca-2细胞中通过RNAi引起癌基因K-ras的活性特异性降低。K-ras 经RNAi后，细胞增殖能力均下降，但仅MiaPaca-2细胞显示凋亡增加。K-ras低表达后，两个细胞株都显示移动性降低，但在两个细胞间都没有整合素水平的改变。GLUF-1是一个代谢相关基因，是c-myc的下游基因，K-ras低表达后，Panc-1细胞GLUF-1表达水平下降，而MiaPaca-2细胞中其表达水平增加。K-rasRNAi后，两个细胞的血管生成潜力都下降。通过RNAi沉默突变的K-ras基因，导致体外肿瘤细胞行为的改变，说明特异地靶向突变的K-ras基因可能是体内治疗胰腺癌的有效方法。

4.2 生长因子及其受体基因作为靶基因

许多肿瘤细胞有生长因子及其受体的高表达，被认为是肿瘤细胞无限增殖的重要原因，RNAi技术可以阻断生长因子及其受体的表达，还可以抑制生长因子及受体的相互作用，从而抑制肿瘤的生长。人表皮生长因子受体EGFR在实体瘤中，包括脑原发和转移瘤中起重要作用。Boado R.J通过携带小发夹shRNA表达质粒的PIL，由U6 RNA聚合酶启动，直接通过RNAi靶向干扰EGFR表达，scid鼠的试验性人脑肿瘤模型通过RNAi基因治疗降低了肿瘤EGFR的表达，而这些有进展性脑瘤的鼠存活时间延长了88％，提示EGFR可以作为治疗肿瘤的一个靶点。 Wannenes F等用以载体为基础的RNAi抑制前列腺癌血管内皮生长因子（VEGF）的表达，结果携带靶向VEGF所有异构体的siRNA质粒转导，显著降低了人前列腺癌细胞株PC3中VEGF的表达， 导致PC3细胞失去了诱导血管产生的基本步骤之一的体外管状网络形成的作用，而且治疗用的载体能在体内消弱肿瘤的生长速度和血管生成。向进展期的瘤块注射裸露的质粒明显地降低了男性激素难控制的前列腺异种移植物中微血管的密度，并且能维持肿瘤生长的长期、缓慢的下降[20]。

4.3 细胞周期基因作为靶基因

多细胞生物体细胞数量恒定决定于细胞增殖与凋亡之间的动态平衡，此平衡破坏可导致肿瘤发生，恶性肿瘤发展期细胞增值和凋亡同时增加，只是增殖数率大于凋亡数量。现代观点认为肿瘤是一种细胞周期病，其中与包括p27Kip，p21和c-myc在内的细胞周期者降解有关的Skp-2的增加是各种肿瘤中细胞周期失控的重要机制之一。SumimotoH等对Skp-2高表达的人小细胞肺癌细胞株用HIVlentitiral或ladenoviral载体进行针对Skp-2的RNAi基因治疗，导致p27Kip1和p21表达增加，癌细胞生长被有效抑制[27]。在NOD/SCID鼠中，针对Skp-2的siRNA腺病毒载体有效地抑制了已有的皮下肿瘤的生长。Gondi CS等用RNAi方式沉默uPAR和组织蛋白酶B表达，在体外和体内模型中均降低了神经胶质细胞瘤的侵袭和血管生成。用表达uPAR和组织蛋白酶B的质粒载体转染颅骨肿瘤细胞，导致以前形成的颅骨内肿瘤的退化，抑制了细胞增殖。

口腔磷状细胞癌中常发现Skp2过表达，而p27表达下降。Kudo Y等用siRNA质粒载体转染口腔磷状细胞癌细胞，降低了Skp2蛋白表达，诱导了p27蛋白的

积累，在体内、体外均抑制了口腔磷状细胞癌的增殖，说明siRNA介导的Skp2基因沉默可以是一个抑制p27基因下调的癌基因治疗的一个新方法。

4.4 RNAi技术对耐药逆转的研究

肿瘤耐药是指该基因在细胞表达后，使细胞对毒性药物不敏感。通过封闭化疗抵抗基因，提高机体对化疗药物的敏感性，可以减轻化疗对于机体的损伤，提高肿瘤的治疗效果。

P-糖蛋白是一种跨膜蛋白，其过表达导致肿瘤细胞内化疗药物泵出增强，是肿瘤细胞产生多药耐药性（MDR）的重要原因，也是化疗失败的主要因素。Yague E等用携带2各不同的质粒稳定转染耐阿霉素（ADM）的K562细胞株，靶向MDR1的RNAi导致MDR1 mRNA表达下降，P-糖蛋白表达下降，且与亲本细胞株相比，完全逆转了细胞的多药耐药性。

Bcl-2基因是在凋亡中起重要调节作用的基因，在细胞的增殖、肿瘤的发生和生长中起重要作用，该途径的紊乱将导致发育异常和加速肿瘤的发生和恶化。同时其编码蛋白BCL-2高表达的肿瘤细胞通过抑制细胞凋亡而增强细胞的存活力，从而拮抗化疗药物诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用，与肿瘤耐药性的形成密切相关。Yin ZH等用靶向bcl-2的shRNA的载体稳定转染鼻咽癌细胞株CNE1，抑制了BCL-2蛋白的表达，虽没有影响细胞增殖，但能增强细胞对顺铂的敏感性。

p53R2基因以依赖p53的方式参与DNA的修复过程。Yanamoto S等以人口腔癌细胞株SASHSC-4、Ca9-22和人乳腺癌细胞株MCF-7及正常成纤维细胞株NHDF为实验模型，用高特异RNAi进行转录后抑制，沉默p53R2的表达，显示p53R2的表达与p53突变不相关。p53R2高表达的细胞株对5-FU的耐药性更强，RNAi介导的p53R2表达降低抑制了肿瘤细胞生长，促进了药物敏感性，但在正常成纤维细胞中未见此变化。结果显示针对p53R2的RNAi可能是一个新的耐药治疗的靶点，可能对口腔癌的基因治疗有用。

5 RNAi在肿瘤基因治疗中的应用进展

目前认为RNAi是一种古老的自我防御进化机制。它的主要作用是抵御转基因或外来病毒侵犯以及维持基因组中转座子的稳定。随着对RNAi机制的进一步研究,发现它是一种非常有用的研究应用工具。由于RNAi技术操作的可行性和高效致基因沉默特性,故可利用RNAi技术特异性封闭在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用的原癌基因、细胞凋亡相关基因、周期相关基因、生长因子和受体以及耐药基因等,从而达到治疗肿瘤的目的。

5.1 原癌基因

原癌基因的过表达是肿瘤发生的一个重要因素。M2BCR /ABL癌基因是导致慢性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病发生的主要致病基因。Wilda等〔31〕用M2BCR /ABL siRNA转染慢性髓性白血病K562细胞系,发现M2BCR /ABL mRNA和蛋白表达均被抑制,细胞恶性度降低,并导致强烈的细胞凋亡。B2raf基因是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导系统中的一个调节因子,在多数黑色素瘤中,发现有B2raf基因的突变,设计针对突变型B2raf的特异RNAi病毒载体,转染黑色素瘤细胞后,发现癌细胞生长停滞且发生凋亡〔32〕。宫颈癌的发生与人乳头状瘤病毒( human pap illomavir2us, HPV)癌基因E6和E7的表达息息相关, Yoshinouchi等〔33〕向体外培养的SiHa宫颈癌细胞内导入癌基因E6 的siRNA后,发现癌细胞生长受到抑制;进一步研究表明,导入E6基因siRNA的SiHa宫颈癌细胞体内接种后,较未受抑制的对照组生长明显缓慢,甚至停止生长。

5.2 细胞凋亡相关基因

在肿瘤细胞中,抑制细胞凋亡的相关基因,如bcl22、livin、survivin等往往过度表达。利用RNAi技术抑制这些基因的表达将是肿瘤基因治疗的一个潜在策略。Williams等〔34〕利用RNAi在一个结肠癌细胞系HCT116阻断survivin表达,结果在动物模型体内及体外均明显抑制肿瘤的生长。将livin siRNA导人Hela细胞后,发现细胞在不同凋亡诱导剂作用下细胞凋亡率均明显升高〔35〕。Fu等用bcl22 siRNA转染人肿瘤细胞HelaB2和BGC2823,结果表明:BALB / c鼠肿瘤生长抑制了66. 5%。Cioca等报道了联合应用bcl22和C2raf基因特异的siRNA能够诱导白血病细胞系HL260、U937和THP21的凋亡,并增强其对依托泊苷和柔红霉 素的敏感性。

5.3 细胞周期相关基因 CyclinE是细胞从G1 期到S期转变的关键分子,在许多肿瘤细胞中高表达,针对CyclinE的siRNA可使肿瘤细胞停滞于G1 期。Gp210是核孔复合体上的一个整合膜蛋白,在细胞(M期)中对细胞质和细胞核间的相互沟通起着重要作用。Cohen等将Gp210 siRNA导入Hela细胞后,发现在5 d内超过60% 的肿瘤细胞发生死亡,说明Gp210是细胞存活的一个必要基因,可成为肿瘤基因治疗的一个潜在靶点。

5.4 生长因子及其受体 血管内皮细胞生长因子(VEGF)在肿瘤的发生发展中起多种作用。Filleur等利用RNAi抑制VEGF在鼠成纤维肉瘤细胞的表达,并将VEGF siRNA经腹腔注射到致瘤的裸鼠中,发现瘤细胞生长受抑制,瘤大小降低86% 。胰岛素样生长因子受体( IGF1R)介导肿瘤细胞生长、肿瘤转移和抗凋亡,是一个有潜力的治疗靶点。Rochester等〔41〕用IGF1R siRNA 转染3 个前列腺癌细胞系: DU145、PC3、LNCapC,发现IGF1R表达减少至15% ,细胞存活分别减少为35%、32%、15%。

6 现状和展望

利用siRNA在各种细胞中成功地抑制了不同基因的表达，充分反映了siRNA可作为一种功能基因组学研究的有效工具。一些科学家预言，一旦RNAi技术能用于临床治疗艾滋病、肝炎和恶性肿瘤，这将是病毒性、寄生病原性、突变基因和癌基因表达等所引起的疾病在基因治疗方面的一场新的。随着RNAi的不断研究，下列问题有望得到解决：

（1）RNAi中RNA合成和降解的复杂相互作用是如何的？ （2）在不同的真核生物物种中作用机制如何？ （3）对于不同的机制、组织和通路来说， RNAi引起的基因沉默意义是什么？ （ 4）RNAi基础上的基因沉默是如何灵活而准确地使包括点突变在内的突变基因的抑制在医学上的应用成为可能？

（5）如何将它的高潜能有效地应用在基因组功能研究、疾病治疗和合理的药物设计上？

（6）是否通过siRNA有效干扰基因表达可以引起酶功能降低（蛋白也许可以在很低水平也有功能）？我们期待着RNAi引领的新医学的到来。

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