第３５卷第ｌ２期 ２０１０年１２月 环境科字 雷理 ＥＮＶＩＲＯＮ 皿ＮＴＡＩ ＳＣ妇￡ＮＣＥ ＡＮＤ Ｍ＾ＮＡＧＥＭ毫ＮＴ Ｖ０Ｌ３５ Ｎ １２ Ｄｏｅ．２ＯｌＯ 文章编号：１６７４－６１３９（２０１０）１２—００８６—０３ 活性污泥中微生物菌种的 分离筛选及固定化方法研究 王平宇 （南昌航空大学，江西南昌３３００６３） 摘要：采用稀释平板分离法和涂布平板法对活性污泥中的微生物进行了分离筛选，得到六种微生物茵种，对 六种茵落形态进行了观察。并对分离筛选出的菌株作简单的固定化研究，以海藻酸钠（浓度２％、ＣａＣｈ浓度为 ４％一５％）为包埋载体时最易操作，效果很好。 关键词：活性污泥；微生物；分离筛选；固定化方法 中图分类号：Ｘ７０３．１ 文献标识码：Ａ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｌｕｄｇｅ Ｍｉｃｒｏ——ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ Ｆｉｘｅｄ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｎｇ Ｐｉｎｇｙｕ （Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｈａｎｇｋｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００６３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓ ｔｅｓｔ ｉｓ ａｂｏｕｔ ｉｓｏｌａｔｅ ｍｉｅｒｏ—ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｓｉｍｐｌｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｌｕｄｇｅ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈ０ｄ ０ｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｍ— ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｃａｒｒｙ ｏｕｔ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｆｒｏｍ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｌｕｄｇｅ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｓｉｘ ｏｆ ｍｉｃｒｏ—ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｓｔｒａｉｎｓ，ａｎｄ Ｉ ｈａｄ ａ ｄｅｔ￣ｌｅｄ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｓｉｘ ｃｏｌｏｎｙ ｍｏｒｐｈｏｌ— ｏｇｙ．Ａｆｔｅｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｉｆｘａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ，ｆｉｎｄ ｔｈａｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｌｇｉｎａｔｅ（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｇｉｎａｔｅ ｉｓ ２％，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｉｓ ４％ｔｏ ５％）ａｓ ｃａｒｒｉｅｒ ｗｉｌｌ ｇｅｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｃａｎ ｏｐｅｒａｔｅ ｅａｓｉｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｌｕｄｇｅ；ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ 前言 微生物通常是肉眼看不到的微小生命体，而且 无处不在。人类利用微生物已经有几千年的历史， 稀释倒平板法 固体培养基ｌ涂布平板法 分离纯培养１平板划线法 Ｌ稀释摇管法（用于厌氧菌的分离纯化） 纯培养 液体培养基分离纯培养：稀释法 单细胞（单孢子）分离法 选择培养基分离 二元培养物 利用微生物处理人类的各种污染物也有１００多年的 历史。分离纯化，是研究和利用微生物的第一步，是 微生物工作中最重要的环节之一。从混杂的细胞群 体中将不同的细胞区分开来达到分离纯化，主要是 根据不同的细胞所具有的各种各样的特性来实现 微生物固定化技术是２０世纪６０年代由生物化 工中的固定化酶技术发展起来的生物技术，所谓固 定化微生物技术，是利用化学或物理手段将游离的 的，包括细胞的物理特性如密度、体积、电荷等，以及 细胞的生物学特性如特异性表面标志和功能、对某 种营养元素或抗生素的敏感性¨Ｊ。不同种类的微生 微生物和酶固定在载体上使其高度密集并保持其生 物活性功能，在适宜的条件下还可以增值以满足应 用之需的生物技术。与其它应用游离微生物的过程 相比，固定化微生物技术可以使微生物在某一固定 区域具有较高的密度，减轻或消除微生物的流失，提 物，其特性和生理功能不同，因此微生物的分离纯化 也有差异。常采用的方法如下 引： 收稿日期：２０１０—０６—１１ 高反应速度，同时便于培养优势微生物种群，提高处 作者简介：王平宇（１９７３一），女，研究生，副教授，主要从事环境生物 技术方面的研究。 理过程的稳定性，减少或消除副反应的发生，便于控 制处理过程 。目前，固定化微生物技术己成为国 ８６· 嘉 期 王平字·活性污泥中微生物菌种的分离筛选及固定化方法研究 ＶｏＬ Ｄ３ｅ５ｅ ．Ｎ２ｍ１０ｌ０２ 内外生物科学、环境科学及其相关学科研究的重点。 ２Ｏ世纪８０年代起，中国在废水生物处理方面 进行固定化酶及固化微生物的生物处理废水研究， 次，用手摇１０ ｍｉｎ将颗粒状样品打散。即为１０ 浓 度的菌液。用１ ｍｌ无菌移液管吸取１ ｍｌｌＯ 浓度 的菌液于一管９ ｍｌ无菌水中，将移液管吹洗三次， 从好氧活性污泥和厌氧污泥中分离筛选对某一种废 水成分分解能力强的微生物，将其固定化用于废水 处理试验 。 摇匀即为１Ｏ 浓度菌液。同样的方法，依次稀释到 １０～。 １试剂与仪器 菌种：菌种来源于南昌市朝阳污水处理厂的活 ③平板的制作取１Ｏ套无菌培养皿编号，ｌＯ～、 ｌ０～、ｌＯ一个三个，另一个为空气对照。取一支１ ｍｌ 无菌移液管从浓度小的１０一菌液开始，以ｌＯ一、 ｌ０一、ｌ０ 为序分别吸取０．５ ｍｌ菌液于相应编号的 性污泥。 （Ｉ）试剂： 氢氧化钠：ＡＲ分析纯；蛋白胨：Ａ．Ｒ；琼脂：Ｃ． Ｐ；牛肉膏； １００ ｓ／Ｌ ＮａＯＨ：在电子天平上准确称取固体氢 氧化纳１０ ｇ，用去离子水定容至１００ ｍＬ； １００ ｇ／Ｌ ＨＣＬ：取１０ ｍＬ盐酸，用去离子水定容 至１００ ｍＬ； （２）仪器： ＢＳ／ＢＴ系列电子天平，北京赛多利斯仪器系统 有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，ＤＧＧ一９１４０Ｂ，海森 信实验仪器有限公司；不锈钢立式电热蒸汽压力消 毒器，ＬＤＺＸ一４０型；上海申安医疗器械厂恒温振荡 器，ＣＨＡ—Ｓ，常州国华电子有限公司；可见分光光度 计，ＶＩＳ一７２２０，北京瑞利分析仪器公司；生化培养 箱，ＬＲＨ一１５０Ｂ，广东省医疗器械厂； （３）移液管：１ ｍｌ，２ ｍｌ，１０ ｍｌ若干。锥形瓶若 干，烧杯２个（５００ ｍｌ，１ ０００ ｍ１），试管若干，酒精灯 １个，电热炉１个。 ２实验过程 ２．１培养基制备 固体培养基：胰化蛋白胨ｌ０ ｇ、氯化钠５ ｇ、酵母 提取物３ ｇ、琼脂ｌ８ ｇ、水ｌ ０００ ｍＬ、ｐＨ ７．０～７．２。 以上培养基都在灭菌箱中以１．１０ ＭＰａ下高温 灭菌 ２．２菌种分离筛选 ２．２．１稀释平板分离法 （１）取样将从南昌市朝阳污水处理厂的活性污 泥制成悬液 （２）稀释水样将１瓶９０ ｍｌ和３管９ ｍｌ的无菌 水排列好，按ｌ０～、１０～、ｌ０ 及１０ 依次编号。在 无菌操作条件下，用１Ｏ 的无菌移液管吸取ｌＯｍｌ 水样置于第一瓶９Ｏ 无菌水中，将移液管吹洗三 培养皿内，冷却后即成平板，倒置于３Ｏ℃培养２４ ｈ ４８ ｈ，然后观察结果。 ２．２．２涂布分离法 点燃酒精灯，取５个已灭菌的干净培养皿，在酒 精灯火焰旁分别依次向其中倒入培养基，培养基的 量以刚刚盖住培养皿底１ ｎ，ｌｌｌｌ处为宜，让培养皿自 然冷却，培养基就会凝固成光滑的平面。 用无菌吸管吸取少量南昌市朝阳污水处理厂的 活性污泥于无菌小量杯中，用大量无菌蒸馏水进行 稀释，摇匀静置约２０ ｍｉｎ；然后用无菌小吸管吸取少 量上面制备的活性污泥稀释液，在酒精灯火焰旁，滴 滴于平板上，将平板倒置放在水平桌面上，在室温 下培养２ ｄ一３ ｄ，然后观察结果。 ２．３菌种的固定化 分别称取１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ ｇ海藻酸钠加 热溶于１００ ｍｌ水，加入１０ ＩＩｌｌ纯种活性污泥菌液，搅 拌均匀，用针形管吸取海藻酸钠与菌体混合液滴人 ４％一５％的ＣａＣＩ 溶液中，固定化７ ｈ一８ ｈ，过滤并 用生理盐水洗净，待用 Ｊ。 ３实验结果与讨论 ３．１菌落形态特征观察 由于微生物个体表面结构、方式、运动能力 的不同生理特性及产生色素的能力等各不相同，因 而个体及它们的群体在固体培养基上生长状况也不 样。经过驯化与分离，在培养皿上可以观察到六 种不同的菌落特征，分别以ＭＢＦ一１、ＭＢＦ一２、… ＭＢＦ一６表示。ＭＢＦ一１号菌落长成绒状或棉絮状， 能扩散生长，疏松，用接种环易挑取。ＭＢＦ一２菌落 表面呈粉状，与基质结合紧密不易挑取。ＭＢＦ一３ 表面皱折呈龟裂状。ＭＢＦ一４菌落呈圆形，表面光 滑性，颜色为乳白色。ＭＢＦ一５菌落边缘粗糙，不规 则，呈树枝状。ＭＢＦ一６菌落呈圆形，表面稍有皱 折。 ８７· ３５￣２。ｌ。年１２期 １２月王平宇活性污泥中微生物菌种的分离筛选及固定化方法研究 ｖｏｋ ３５ Ｎ“ｌ２ Ｄｅｃ．２ＯｌＯ ３．２微生物分离筛选的影响因素 表Ｉ 海藻酸钠浓度对固定化细胞成球难易的影响 ３．２．１培养基对分离筛选产生的影响 般来说，营养越丰富的培养基越有利于微生 ３．４讨论 物的培养，但是污泥中的各类微生物之间对营养要 求差别较大。不同的微生物器生长有其自身的特 点，所以都有适合各自生长繁殖的培养基。 碳源、氮源、碳氮比、磷酸盐、营养因子、其他物 质这些培养基的基本组成都会对微生物的分离筛选 起重要的作用，其中人员一项的改变都会对分离出 本实验为微生物提供了最适合的生长条件（培 养基、温度、ＰＨ值），对分离筛选菌落非常的有利。 通过稀释平板分离法和涂布分离法比较容易的分离 筛选出六种微生物菌种。稀释平板分离法得到的平 来的菌种起决定性作用，不同组成比例的培养基分 离筛选的菌种可能会完全不一样。 ３．２．２ ｐＨ值对微生物分离筛选的影响 对特定的微生物来说，存在最适合自己的ｐＨ 和一定的ｐＨ值范围，ｐＨ值过高或过低均不利于微 生物的培养。所以要在同一培养基中尽可能多的分 离筛选出更多的菌种出来，就要将培养基稳定在一 个ｐＨ值范围内。 ３．２．３ 温度对微生物的分离筛选的影响 温度对微生物培养是个很重要的影响因素，不 同的微生物的生长稳定是不尽相同的，有些时候会 相差很大。但是一般的微生物的最适宜温度在 ２５℃一３５℃之间。高温可能使大部分微生物失去活 性，温度过低则会使培养基中的微生物大部分处于 休眠状态。 ３．３菌种固定化形态与效果 固定化菌种形态如图Ｉ所示。 图１ 菌液固定化后的形态 海藻酸钠是一类天然高分子多糖类，对微生物 没有毒害作用，但海藻酸钠的浓度会影响固定化细 胞的成球难易，进而影响到微生物的活性，其浓度对 固定化细胞成球难易的影响如表Ｉ所示。 ８８· 板上菌落分明，但操作过程较麻烦。在进行微生物 分离纯化时，该方法需要样品与热的培养基混合，因 此对热敏感微生物的影响明显。该方法操作过程 中，样品中的微生物有的分布于平板表面，有的则裹 在培养基中，后者则会影响严格好氧微生物的生长； 而且，对于同一种微生物，平板表面的菌落形态与培 养基内的菌落形态会存在着明显的差别，影响菌落 形态的判别。在进行微生物计数时，该方法细胞分 散均匀，计数较准确。 稀释涂布平板方法操作相对简单，它克服了倾 注平板方法对热敏感微生物、严格好氧微生物和培 养基内部菌落带来的不利影响，是实验室中经常使 用的常规分离方法。其存在的问题是有时会由于菌 液太多或者涂布不均匀而使细胞分散不充分，影响 计数结果和分离纯化效果。 ４结论 从南昌市朝阳污水处理厂所取的活性污泥中分 离筛选到得到六种微生物菌落，对六种菌落形态进 行了观察。以海藻酸钠（浓度２％、ＣａＣＩ：浓度为４％ ５％）为包埋载体进行固定化最易操作，易成球， 效果很好。 参考文献： ［Ｉ］徐亚同．污染控制微生物工程［Ｍ］．北京：化学工业 出版社。２００１． ［２］徐龙君，余荣升．从污水处理厂活性污泥中分离选 育微生物的研究［Ｊ］．安全与环境学报，２００８，８（４）：５４—５７． ［３］宋应民，欧富初．包埋法固定化微生物处理化工废 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