垦堂皇ｌ堕 ２０１０笙７月第７卷第ｌ４期Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ｊｕｌｙ ２０１０，Ｖｏ１．７，Ｎｏ．１４ “蛇毒活性酒＂功效的动物实验研究 张春容。，余晓东 ，和七一 ，李 恒 ，文浩平 ，邓疆渝 （１．重庆市动物生物学重点实验室／重庆 师范大学生命科学学院４０００４７；２．重庆医科大学附属永川医院急诊科４０２１６０） 【摘要】 目的通过动物实验，评价“蛇毒活性酒”的生物效应。方法 采取动物对照组与动物实验组之间比 较的方法考察“蛇毒活性酒”的生物功效。结果“蛇毒活性酒”能明显延长果蝇寿命，对老年小鼠的疲劳等应激刺 激有明显保护作用，明显降低动物血浆中过氧化脂质含量，减少体内脂褐素，增加红细胞中超氧化物歧化酶（ｓ０Ｄ） 含量，显著升高老年大鼠血清皮质醇和睾酮含量，增强机体免疫功能，毒性极低。结论“蛇毒活性酒”对小鼠具有 增强免疫、抗衰老和抗疲劳等作用。 【关键词】蛇毒； 酒剂； 免疫； 动物实验 Ｄ１０：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—９４５５．２０１０．１４．００４ 中图分类号：Ｒ２８２．７４；Ｒ９４４．６３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２—９４５５（２０１０）１４—１４１６—０３ Ａｎｉｍａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｓｎａｋｅ－Ｖｅｎｏｍ Ａｃｔｉｖｅ Ｗｉｎｅ ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕｎ—ｒｏｎｇ ，ｙＵ Ｘｉａｏ—ｄｏｎｇ ，ＨＥ ，ＬＩ Ｈｅｎｇ ，ＷＥＮ Ｈａｏ－ｐｉｎｇ ，ＤＥＮＧ Ｊｉａｎｇ—ｙｕ ．１．Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００４７，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｐｅｏｐｌｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０２１６０，Ｃｈｉｎａ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃＵｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｓｎａｋ￣Ｖｅｎｏｍ Ａｃｔｉｖｅ Ｗｉｎｅ ｂｙ ａｍｉｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｓｎａｋｅ－Ｖｅｎｏｍ Ａｃｔｉｖｅ Ｗｉｎｅ ｃｏｕｌｄ ｅｌｏｎｇａｔｅ ｔｈｅ １ｉｆｅｔｉｍｅ ｏｆ ｆｒｕｉｔ ｆｌｙｅｓ，ｈａｖｅ ｓｏｍｅ ａｎｔｉ—ｔｉｒｅｄｎｅｓｓ ｅｆｆｅｃｔ，ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ＬＰＯ ａｎｄ ｌｉ— ｐｏｆｕｓｅｉｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｐｌａｓｍａ，ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ＳＯＤ ｉｎ ｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｃｏｒｔｉｓｏｌ ａｎｄ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｓｅｒａ，ｉｎｔｅｎｓｉｆｙ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｈａｖｅ ｎｏ ｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｓｎａｋｅ－Ｖｅｎｏｍ Ａｃｔｉｖｅ Ｗｉｎｅ ｈａｓ ｓｏｍｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｍｉｃｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｔｉ－ａｇｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉ—ｔｉｒｅｄｎｅｓｓ，ｅｔｃ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍ； ｗｉｎｅｓ； ｉｍｍｕｎｉｔｙ； ａｎｉｍａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ 毒蛇作为中药材在临床上使用已有两千多年历史，其功效 的黑腹果蝇，经乙醚麻醉后随机分为空白对照组、乙醇对照组 在民间广为流传，如可治愈风湿性关节炎、提高免疫力等等＿】］。 和蛇毒活性酒处理组，每组８Ｏ只，雌雄各半。空白对照组用基 随着现代生物技术的发展和成熟，毒蛇的毒液、肌肉、蛇鞭（雄 础培养基；乙醇对照组在基础培养基中加入乙醇，使培养基中 蛇的交接器或外生殖器）以及蛇胆等的化学组分及其多种生物 的乙醇终浓度为１ ，蛇毒活性酒处理组在基础培养基中加入 功能已被基本揭示，尤其是蛇毒可作用于动物和人体的神经系 ３８ “蛇毒活性酒”使培养基中的乙醇终浓度为１ 。在２５℃ 统、血液系统、肌肉系统及免疫系统等，并发挥各种生物效 温箱中培养，每天观察记录果蝇死亡数，直到全部死亡为止，计 应口＿６＿。为此，已从蛇毒中开发出多种药物，如治疗血栓的降纤 算果蝇平均寿命和最高寿命。 酶、清栓酶、去纤酶以及治疗疼痛的克洛曲等等。已有以毒蛇 １．２．２ 抗疲劳观察 参照高峰等［１ 或曲琰和贾天柱＿ｌ 方 为原料，辅以中药，在民间配伍成五花八门的保健酒（如三蛇 法，取幼年小鼠（１．５月龄）３０只和老年小鼠（１４月龄）３０只，雌 酒，蛇王酒 以及蛇鞭英雄酒ｌＬ８ 等）在局部地区使用，但这些保 雄各半。幼年酒剂组给予“蛇毒活性酒”每天灌胃每只１次，每 健品的配制所用的功效成分主要是蛇体、蛇鞭、蛇肉，至今还未 次每只０．１ ｍＩ ；幼年乙醇组给予每天灌胃等容量乙醇；幼年对 见采用蛇毒来配制保健酒的报道。本实验室从蛇毒分离出多 照组给予每天灌胃等容量生理盐水。老年酒剂组给予“蛇毒 种活性组分，并将这些组分经多次反复优化组合，研制开发出 活性酒”每天灌胃每只１次，每次每只０．４ ｍＬ；老年乙醇组给 “蛇毒活性酒”，其乙醇浓度为３８ 。本研究利用实验动物主 予每天灌胃等容量乙醇；老年对照组给予每天灌胃等容量生理 要考察该“蛇毒活性酒”的生物功效，如提高免疫力、增强性功 盐水。连续５ ｄ，末次给药后１ ｈ，将每只鼠后肢负荷１Ｏ 体质 能、延缓衰老和抗疲劳等等。 量的重物，放人（２５４－０．５）℃温水中，计算对照组与酒剂组每只 １材料与方法 鼠游泳时间之差。 １．１ 动物与试剂 Ｗｉｓｔａｒ种大白鼠和昆明种小白鼠由第三 １．２．３脾脏脂褐素观察 参照徐淑云等ｌ１ 方法，取老年（１４ 军医大学实验动物房提供；果蝇由本实验室提供；“蛇毒活性 月龄）小鼠３０只，分为２组，雌雄各半。酒剂组给予“蛇毒活性 酒”酒剂由本实验室研制。甲醛一丙酮液和 醋酸酯液等试剂 酒”每天灌胃每只１次，每次每只０．４ ｍＬ；对照组给予每天灌 皆为分析纯。 胃等容量生理盐水。连续１５ ｄ后颈椎脱臼处死，将脾脏于甲 １．２实验观察 醛溶液中固定，作组织石蜡包埋切片，ＨＥ染色，显微镜放大４Ｏ １．２．１果蝇寿命观察按常规方法ｌｃ 将同一批２４ ｈ内羽化 和１００倍观察脾脏组织脂褐素聚集和分布情况。 ＊ 基金项目：重庆市高校优秀成果转化重点资助项目（￣ｚｈ０８２１３）。 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｄｙｕｙｕ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ 检验医学与临床２０１０年７月第７卷第１４期Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，ＪｕＪ 兰 ！ 竺 ：！！ 竺： １ １．２．４血浆过氧化脂质（ＬＰＯ）观察取小鼠４Ｏ只，每只（２０ 间有量效关系。结果见表２。 表２“蛇毒活性酒”对小鼠游泳时间的影响（ 一１０， ±ｓ） ±２）ｇ，分为２组，雌雄各半。酒剂组给予“蛇毒活性酒”每天灌 胃每只１次，每次每只０．４ ｍＩ ；对照组给予每天灌胃等容量 生理盐水。连续１５ ｄ后禁食２４ ｈ断头取血，分离血浆。采用 硫代巴比妥酸化学测定法［１阳测定血浆ＬＰＯ含量。 １．２．５超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性观察取幼年（２月龄）和 老年（２０月龄）大鼠各２Ｏ只，分为４组，雌雄各半。幼年酒剂 组给予“蛇毒活性酒”灌胃每天１次，每次每只０．４ ｍＬ；幼年 对照组给予每天灌胃等容量生理盐水。老年酒剂组给予“蛇毒 活性酒”灌胃每天１次，每次每只３ ｍＬ；老年对照组给予每天 灌胃等容量生理盐水。连续１５ ｄ后禁食２４ ｈ，股动脉取血。 用黄嘌呤氧化酶硝基四氮唑蓝法测定红细胞内ＳＯＤ含 注：与对照组和乙醇组比较， Ｐ＞Ｏ．０５；一Ｐ＜Ｏ．Ｏ１。 量［１３１４］。 １．２．６血清皮质醇和睾酮观察取老年雄性大鼠２Ｏ只，分为 ２组。酒剂组给予“蛇毒活性酒”灌胃每天１次，每次每只３ ｍＬ；对照组给予每天灌胃等容量生理盐水。连续１５ ｄ，第１６ 天断头取血，分离血清，用双抗体放射免疫法测定血清皮质醇 和睾酮［１ ５１ ６］。 １．２．７外周血Ｔ淋巴细胞和Ｂ淋巴细胞观察 取大鼠２Ｏ 只，分为２组，雌雄各半。酒剂组给予“蛇毒活性酒”灌胃每天 １次，每次每只３ ｍＬ；对照组给予每天灌胃等容量生理盐水。 连续１３ ｄ，第１４天每鼠尾部经２５ 乙醇消毒后，剪去尾梢约 ０．２ ｒｎｍ取血推片，自然干燥后，将血片浸人４℃甲醛一丙酮缓 冲液中固定３０ Ｓ，然后用流水冲洗玻片约１ ｍｉｎ，空气干燥；再 浸入孵育液中３７℃温箱孵育２ ｈ，用流水冲洗玻片约３ ｒｎｉｎ，空 气干燥；最后用对比染色液复染１．５ ｈ，取出玻片空气干燥，油 镜下计数２００个淋巴细胞；同时在剪去尾梢后立即放血处死， 选取颈淋巴结制备淋巴细胞悬液０．２５ ｍＬ后与１ 玫瑰花节 （ＥＡＣ）悬液０．２５ ｍＬ在小试管中混匀，置３７℃恒温水溶液中 孵育３０ ｒａｉｎ，１ ５００ ｒ／ｒａｉｎ离心５ ａｒｉｎ，弃上清液，留少许液体轻 轻振摇，使细胞悬浮，加入１滴０．２ 美蓝溶液染色，混匀滴片 加盖玻片，高倍镜下计数２００个淋巴细胞＿１ 。 １．３毒性试验 １．３．１ 急性毒性试验［半致死量（ＬＤ５Ｏ）和最大耐受量（ＭＴＤ） 测定］取小鼠１００只，每只（２０±２）ｇ，分为１Ｏ组，雌雄各半； 分别腹腔注射和灌胃“蛇毒活性酒”，浓度为５、１０、２ｏ、２５ ｇ／ｋｇ， 观察７２ ｈ。 １．３．２亚急性毒性试验取小鼠４ｏ只，每只（２０±２）ｇ，分为 ４组，雌雄各半。大、中、小剂量组分别给予１５、２５ ３５ ｇ／ｋｇ浓 度的“蛇毒活性酒”每天灌胃，每只０．４ ｍＩ ，对照组给予生理盐 水每天灌胃，每只０．４ ｍＩ ；连续１５ ｄ，每５天观察记录并称 重；观察动物各组死亡和异常情况 。 １．４统计学方法数据用Ｍｉｃｒｏｓｏ｛ｔ Ｅｘｃｅｌ统计，进行ｔ检验。 ２结 果 ２．１果蝇寿命观察 见表１。由表１可见，“蛇毒活性酒”与 对照组和乙醇组相比，雌雄果蝇最高寿命均有显著延长，提示 “蛇毒活性酒”具有一定的延缓衰老、提高寿命作用。 表１“蛇毒活性酒”对果蝇寿命的影响（ 一８０， ±Ｓｊ 注：舍为雄性果蝇；早为雌性果蝇。与对照组比较， Ｐ＜Ｏ．Ｏ０１。 ２．２抗疲劳观察研究表明“蛇毒活性酒”对幼年小鼠游泳时 间无明显影响，但对老年小鼠均有明显延长作用，延长游泳时 ２．３脾脏脂褐素观察 结果表明对照组脂褐素量多而聚集， 而“蛇毒活性酒”组脾脏组织切片中脂褐素颗粒明显减少且 散在。 ２．４血浆ＬＰＯ观察血浆ＬＰＯ对照组为（１５．７１±０．９２）ｍｇ， “蛇毒活性酒”酒剂组为（１０．６５±０．９７）ｍｇ。两组比较，差异有 统计学意义（Ｐ＜ｏ．０１）。“蛇毒活性酒”组血浆ＬＰＯ含量比对 照组显著降低。 ２．５ ＳＯＤ活性观察研究表明“蛇毒活性酒”对幼年大鼠红 细胞Ｓ０Ｄ无明显影响，而对老年大鼠红细胞ＳＯＤ均有明显提 高。结果见表３。 表３“蛇毒活性酒”对大鼠红细胞ＳＯＤ含量的 影响Ｉ 一１０。ｉ±Ｓ） 注：与对照组比较， Ｐ＞Ｏ．０５；一Ｐ＜Ｏ．Ｏ１。 ２．６血清皮质醇和睾酮观察研究表明“蛇毒活性酒”可明显 提高老年大鼠血清皮质醇和睾酮含量。结果见表４。 表４“蛇毒活性酒”对大鼠血清皮质醇和睾酮的 影响（，ｚ一１０，ｉ±Ｓ） 注：与对照组比较， Ｐ＞Ｏ．０５；～Ｐ＜Ｏ．０１。 ２．７外周血Ｔ淋巴细胞和Ｂ淋巴细胞观察研究表明“蛇毒 活性酒”使动物Ｔ细胞数量和玫瑰花结数量增加。结果见 表５。 表５“蛇毒活性酒”对大鼠免疫功能的影响（，２—１２。 ±ｓ｝ 组别 酒剂量（ｇ／ｋｇ）Ｔ细胞（ ） ＥＡＣ形成百分比（ ） 注：与对照组比较， Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ。ＥＡＣ表示玫瑰花结。 ２．８急性毒性试验ＬＤＳＯ和ＭＴＤ测定小鼠全部活动自如， 均存活。因限于浓度和灌胃容量，未能求出ＬＤＳＯ。计算小鼠 口服“蛇毒活性酒”ＭＴＤ大于人体用量３５０倍。 ２．９亚急性毒性试验１５ ｄ后小鼠体质量，大、中、小剂量组 增加率为（２６．４８±２．１０）％，对照组为（１９．６０±２．５３）％ 第 检验医学与临床２０１０年７月第７卷第１４期Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ｊｕｌｙ ２０１０，Ｖｏ１．７，Ｎｏ．１４ １６天动物处死，其心、肺、胸腺、肝、脾、肾、肾上腺和消化道等 ［５］Ｍａｒｋｌａｎｄ ＦＳ．Ｓｎａｋｅ ｖｅｎｏｍｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃｓ ｓｙｓｔｅｍ 均未见明显病理改变，表明“蛇毒活性酒”对小鼠无明显毒性 ｒＪ］．Ｔｏｘｉｅｏｎ，１９９８，３６（１２）：１７４９—１７５３． 作用。 ［６］刘瑞兴，郭振华，董君英．蛇肉有限酶解法制备低肽营养 ３讨 论 液的研究［Ｊ］．河南工业大学学报（自然科学版），２００５，２６ 研究证明，“蛇毒活性酒”能明显延长果蝇寿命（表１），对 （４）：６２—６９． 老年小鼠的疲劳等应激刺激有明显保护作用（表２），明显降低 ［７］唐三定．永州异蛇系列产品的研制与生产［Ｊ］．食品工业 动物血浆中ＬＰＯ含量，减少体内脂褐素，增加红细胞中ＳＯＤ 科技，２００５，２６（１１）：１１１—１１２． 含量（表３），显著升高老年大鼠血清皮质醇和睾酮含量（表４）， ［８］张士卿，施一帆，李军，等．蛇鞭英雄酒主要功效学研究 增强机体免疫功能（表５），毒性极低。目前，临床和实验中对 ｌＪ］．甘肃中医学院学报，１９９６，９（１）：３１—３３． 自由基与衰老之间的关系研究，常以血液ＬＰＯ含量作为衰老 ［９］陈勤．抗衰老研究实验方法［Ｍ］．北京：中国医药科技出 和抗衰老作用的指标。ＬＰＯ又是脂褐素形成的来源，其减少 版社，１９９６：５９—４８９． 脂褐素与降低血中ＬＰＯ含量有关。ＳＯＤ是生物体内０ 的清 ［１ｏ］高峰，仲路华，庞立杰，等．杞蜜延寿参抗疲劳抗缺氧实验 除剂，可以防止０ 引起的自由基连锁反应，保护红细胞膜免受 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Ｍｏｔｏｙａｍａ Ｓ，Ｍｉｕｒａ Ｍ，Ｈｉｎａｉ Ｙ，ｅｔ ａＩ＿ＣＲＰ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙ— ２００８，９（４－６）：３７５—３８７． ｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ［５］ 李景涛，高德军，程思强，等．经左胸颈二切口食管癌根治 ｔｈｏｒａｃｉｃ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ Ｅ Ｊ］．Ａｎｎ Ｓｕｒｇ 术２１８例治疗体会［Ｊ］．河南肿瘤学杂志，２００５，１８（３）： Ｏｎｃｏｌ，２００９，１６（９）：２４７９—２４８５． ２２３—２２４． ［６］ 冯永健，薛会岗，何佳虹．食管癌切除颈部胃食管吻合术 （收稿日期：２０１０－０３—１２）
