科研论文

学生科研训练计划（SRTP）

项目论文

项目名称：培养条件对马铃薯干腐病菌细胞壁降解酶的影响 主 持 人： 李夏妮 所在学院： 食品科学与工程学院 专业年级： 生物工程08级 指导教师： 李永才 副教授

学生科研训练计划（SRTP）项目管理办公室

二О一二年四月

1

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

目录

前言 ............................................................................................................................... 3 1 材料与方法 ............................................................................................................... 4

1.1 材料 ................................................................................................................. 4 1.2 方法 ................................................................................................................. 4

1.2.1培养基制作............................................................................................. 4 1.2.2制作标准曲线......................................................................................... 5 1.2.3酶液的制备............................................................................................. 3 1.2.4 PG（多聚半乳糖醛酸酶）的测定 ....................................................... 4 1.2.5 PMG（果胶甲基半乳糖醛酸酶 ）的测定 .......................................... 4 1.2.6 Cx（纤维素酶）的测定 ........................................................................ 4 1.2.7β-葡萄糖苷酶的测定 ............................................................................ 5 1.2.8结果统计................................................................................................. 5

2 结果与分析 ............................................................................................................... 6

2.1 PH值对马铃薯干腐病菌细胞壁降解酶的影响 ............................................ 6

2.1.1 PH对PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的影响 .................................... 5 2.1.2 PH对PMG（果胶甲基半乳糖醛酸酶）活性的影响 ......................... 6 2.1.3 PH对Cx（纤维素酶）活性的影响 ..................................................... 6 2.1.4 PH对β-葡萄糖苷酶活性的影响 ......................................................... 6 2.2培养时间对马铃薯干腐病菌细胞壁降解酶的影响....................................... 7

2.2.1 培养时间对PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的影响 ......................... 7 2.2.2 培养时间对PMG（果胶甲基半乳糖醛酸酶）活性的影响 .............. 7 2.2.3 培养时间对Cx（纤维素酶）活性的影响 .......................................... 8 2.2.4 培养时间对β-葡萄糖苷酶活性的影响 .............................................. 8 2.3 培养温度对马铃薯干腐病菌细胞壁降解酶的影响...................................... 9

2.3.1 培养温度对PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的影响 ......................... 9 2.3.2 培养温度对PMG（果胶甲基半乳糖醛酸酶）活性的影响 .............. 9 2.3.3 培养温度对Cx（纤维素酶）活性的影响 ........................................ 10 2.3.4培养温度对β-葡萄糖苷酶活性的影响 ............................................. 10

3 讨论 ......................................................................................................................... 12 4 结论 ......................................................................................................................... 13 参考文献 ..................................................................................................................... 13

2

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

培养条件对马铃薯干腐病菌细胞壁降解酶影响的研究

李夏妮

（甘肃农业大学食品科学与工程学院 兰州 730070）

摘要：本文通过体外试验，研究了不同培养条件（温度、pH）和培养时间对马铃薯干腐病菌主要细胞壁降解酶活性的影响。结果表明，不同培养条件及时间对马铃薯干腐病菌细胞壁降解酶具有一定的影响。除β-葡萄糖苷酶（最佳 pH 8）外，多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和纤维素酶（Cx）均在pH 6 的条件下活性最高；对温度而言，各种细胞壁降解酶在23-25 ℃下活性最高，低温对具有抑制作用；PG、PMG和Cx均在培养前期（第2d）活性最大，而β-葡萄糖苷酶在培养3d时活性最大，各种酶随着培养时间的延长其活性均呈现降低的趋势。 因此可通过调节培养条件来抑制病原物的主要致病因子—细胞壁降解酶的活性，从而有效地控制马铃薯块茎干腐病。 关键词：马铃薯；硫色镰刀菌；细胞壁降解酶；培养条件

前言

马铃薯是我国北方的重要经济作物，甘肃省作为我国马铃薯生产的最佳适宜区之一，目前全省马铃薯种植面积扩大到746万亩，居内蒙古自治区之后，列全国第二；总产量达到755万吨，居全国第一[1]。马铃薯的种植、发展越来越引起人们的重视。但是近年来，马铃薯贮藏期腐烂问题也日渐突出。据调查造成烂窖的主要原因是块茎携带病菌。虽然马铃薯块茎病害有15多种，但是其中Fusarium solani和晚疫病复合侵染或Fusarium solani诱发侵染是导致烂窖的主体，有调查显示，马铃薯贮藏期间，平均病薯率为27.59%，其中88.5%为黑色干腐病型病

3

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

薯[2]。最终导致马铃薯减产和商品性降低，对生产者造成极大的损失。

干腐病又名“干腐烂”，染病块茎长白色至灰色绒毛物，内部薯肉则呈灰褐色至深褐色病变，有的出现空心，空腔内充满菌丝体，严重时整个块茎僵缩或呈干腐状，不能食用[3]。干腐病是由镰刀菌（Fusarium spp.）[4]所致病的。干腐病是马铃薯产业化发展的主要采后病害之一，贮藏期间其发病率高达30%。目前主要利用化学杀菌剂进行控制，然而化学杀菌剂的大量使用不仅会产生环境污染、农药残留等问题，也会导致病原物产生抗药性，导致了抗药菌株的产生，使其使用受到越来越多的，因而，必须寻求新的安全高效的防腐剂，以逐步取代和减少化学杀菌剂使用[5]。

病原物产生的细胞壁降解酶（果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶等多种细胞壁降解酶）在侵入和定殖寄主组织中产生了重要作用，是其主要的致病因子之一[6]。研究发现培养\\条件对酶的产生及活性具有一定的影响，故而本试验以马铃薯干腐病菌(Fusarium sulphureum)为研究对象，系统研究培养条件(温度,pH等)对马铃薯干腐病菌(F. sulphureum)产生的细胞壁降解酶种类、活性的影响。进而了解不同培养条件下马铃薯干腐病菌细胞壁降解酶产生的情况，对有的放矢的进行病害控制具有十分重要的意义。

本研究通过体外试验，研究培养条件(温度，pH)和培养时间对马铃薯干腐病菌主要细胞壁降解酶产生的影响，以期为马铃薯干腐病的防治提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

马铃薯干腐病菌（Fusarium sulphureum ） 超净工作台（SW-CJ-2FD）、恒温培养摇床（THZ-100）、电冰箱（BCD-196TX）、分光光度计（UV-2450）、巴氏灭菌锅（YX-280B）、恒温水浴锅（HWS24）、烘箱、电磁炉

1.2 方法

1.2.1培养基制作

参照方中达 [9]法进行。制作马铃薯水琼脂培养基(PDB)，培养基成分：马铃薯250g，蒸馏水1000mL。将马铃薯切碎，大约1cm的小方块，加水煮沸30min后用四层纱布过滤并定容至1000mL。分装在三角瓶(每个三角瓶瓶子装100mL培养基)中进行高压灭菌。灭菌后制备平板PDB。

4

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

1.2.2 制作标准曲线

配置一系列已知浓度的标准葡萄糖溶液，按照3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖的方法，在540nm 处测定吸光度值，制作标准曲线。 1.2.3 酶液的制备

将培养的5个硫色镰刀菌菌柄扩于100mL经灭菌后的培养基中在三角瓶中进行培养，培养数天后将三角瓶中培养的菌培养液真空抽滤，置滤液于离心管中离心10min备用。

1.2.4多聚半乳糖醛酸酶（PG）的测定

取两只具塞刻度试管，每只试管中都分别加入1.0mL50mmol/L,PH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液和0.5mL10g/L的 PG溶液，往其中一只试管中加0.5mL酶液，另一只试管中加0.5mL蒸馏水作为对照，混匀后置于37℃水浴中保温反应1h。保温后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加热5min,然后迅速冷却至室温，加8mL蒸馏水稀释，混匀。在波长540nm处按照与制作标准曲线的方法比色，测定各试管中溶液的吸光度值。重复三次。

1.2.5 果胶甲基半乳糖醛酸酶（PMG）的测定

取两只具塞刻度试管，每只试管中都分别加入1.0mL50mmol/L,PH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液和0.5mL10g/L的果胶溶液，往其中一只试管中加0.5mL酶液，另一只试管中加0.5mL蒸馏水作为对照，混匀后置于37℃水浴中保温反应1h。保温后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加热5min,然后迅速冷却至室温，加8mL蒸馏水稀释，混匀。在波长540nm处按照与制作标准曲线的方法比色，测定各试管中溶液的吸光度值。重复三次。 1.2.6纤维素酶（Cx）的测定

取两只具塞刻度试管，每只试管中都分别加入1.5mL10g/L的CMC（羧甲基纤维素）溶液，往其中一只试管中加0.5mL酶液，另一只试管中加0.5mL蒸馏水作为对照，混匀后置于37℃水浴中保温反应1h。保温后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加热5min,然后迅速冷却至室温，加8mL蒸馏水稀释，混匀。在波长540nm处按照与制作标准曲线的方法比色，测定各试管中溶液的吸光度值。重复三次。

1.2.7 β-葡萄糖苷酶的测定

取两只具塞刻度试管，每只试管中都分别加入1.5mL10g/L的水杨苷溶液，往其中一只试管中加0.5mL酶液，另一只试管中加0.5mL蒸馏水作为对照，混匀后置于37℃水浴中保温反应1h。保温后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加热5min,然后迅速冷却至室温，加8mL蒸馏水稀释，混匀。在波长540nm处按照与制作标准曲线的方法比色，测定各试管中溶液的吸光度值。重复三次 1.2.8结果统计

所有数据采用Microsoft Excel计算标准误差（±SE）并作图。

5

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

2 结果与分析

2.1 pH值对马铃薯干腐病菌细胞壁降解酶的影响

2.1.1 pH对PG活性的影响

0.24PG活性（mg/min·mL）0.220.20.180.156710pH值 pH value

图1 不同pH对F. sulphureum PG 酶活性的影响

由图1可见，不同pH的培养液对F. sulphureum PG活性的影响存在差异，其中pH为6时其活性最大，pH为8时PG活性最低。当pH大于6时，其活性呈现先降低后上升的趋势。 2.1.2 PH对PMG活性的影响

0.6

PMG活性（mg/min·mL）0.40.20456710pH值 pH value

6

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

图2 不同pH对F. sulphureum PMG 酶活性的影响

由图2可见，不同pH的培养液对F. sulphureum PMG活性表现出不同的影响，当pH大于6时，其活性呈现先降低后上升的趋势，其中pH为6时，PMG活性最大，pH为8时PMG（果胶甲基半乳糖醛酸酶）活性最低。 2.1.3 PH对Cx活性的影响

0.1440.139Cx活性（mg/min·mL）0.1340.1290.1240.119456710pH值 pH value

图3 不同pH对F. sulphureum Cx 酶活性的影响

由图3可见，不同pH的培养液对F. sulphureum Cx活性表现出不同的影响，随着pH的增加，呈现先上升后下降的趋势，其中pH为6时，Cx活性最大， pH为8时Cx活性最低。

2.1.4 PH对β-葡萄糖苷酶活性的影响

0.4β-葡萄糖苷酶活性（mg/min·mL）0.30.20.10456710pH值 pH value

7

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

图4 不同pH对F. sulphureum β-葡萄糖苷酶活性的影响

由图4可见，不同pH的培养液对F. sulphureumβ-葡萄糖苷酶活性表现出不同的影响，随着pH的增加，呈现先上升后下降的趋势，其中pH为8时，β-葡萄糖苷酶活性最大， pH为5时β-葡萄糖苷酶活性最低。

2.2 培养时间对马铃薯干腐病菌细胞壁降解酶的影响

2.2.1培养时间对PG活性的影响

1.00.8PG活性（mg/min·mL）0.60.40.20.0123456710培养时间 culture time（d）

图5 不同培养时间对F. sulphureum PG 酶活性的影响

由图5可见不同培养时间对F. sulphureum PG活性的影响存在差异，其中2d时其活性最大，培养时间为5d时PG活性最低。当培养时间大于6天时PG活性基本保持在0.16mg/min.mL左右，其活性呈现先上升后降低后上升的趋势。。 2.2.2 培养时间对PMG活性的影响

8

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

0.8PMG活性（mg/min·mL）0.60.40.20123456710培养时间 culture time（d）

图6 不同培养时间对F. sulphureum PMG 酶活性的影响

由图6可见不同培养时间对F. sulphureum PMG活性的影响存在差异，其中2d时其活性最大，培养时间为5d时PMG活性最低。当培养时间大于6天时PMG活性基本保持在0.17mg/min.mL左右，其活性呈现先上升后降低后上升的趋势。 2.2.3 培养时间对Cx活性的影响

0.60.5Cx活性（mg/min·mL）0.40.30.20.10123456710培养时间 culture time（d）

图7不同p培养时间对F. sulphureum Cx 酶活性的影响

由图7可见不同培养时间对F. sulphureum Cx活性的影响存在差异，其中2d时其活性最大，培养时间为8d时Cx活性最低。当培养时间大于5天时Cx活性基本保持在0.129mg/min.mL左右，其活性呈现先上升后降低后上升的趋势。。

9

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

2.2.4 培养时间对β-葡萄糖苷酶活性的影响

0.6β-葡萄糖苷酶活性（mg/min·mL）0.50.40.30.20.10123456710培养时间 culture time（d）

图8 不同培养时间对F. sulphureum β-葡萄糖苷酶活性的影响 由图8可见不同培养时间对F. sulphureum β-葡萄糖苷酶活性的影响存在差异，其中3d时其活性最大，培养时间为5d时β-葡萄糖苷酶活性最低。当培养时间大于6天时β-葡萄糖苷酶活性基本保持在0.130mg/min.mL左右。

2.3培养温度对马铃薯干腐病菌细胞壁降解酶的影

2.3.1 培养温度对PG活性的影响

0.30PG活性（mg/min·mL）0.250.200.150.100.05202325温度（℃）2830

图9 不同培养温度对F. sulphureum PG 酶活性的影响

由图9可见，不同培养温度对F. sulphureum PG活性表现出不同的影响，当温度高于25℃时，其活性呈现先降低后上升的趋势，在温度为25℃时，PG活

10

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

性最大，在温度为20℃时，PG活性最低。 2.3.2 培养温度对PMG活性的影响

0.30PMG酶活（mg/min.mL）0.250.200.150.100.05202325温度（℃）2830

图10 不同培养温度对F. sulphureum PMG 酶活性的影响

由图10可见，不同培养温度对F. sulphureum PMG活性表现出不同的影响，当温度高于25℃时，其活性呈现先降低后上升的趋势，在温度为25℃时，PMG活性最大，在温度为20℃时，PMG活性最低。 2.3.3 培养温度对Cx活性的影响

0.25Cx活性（mg/min·mL）0.200.150.100.05202325　温度（℃）2830

图11 不同培养温度对F. sulphureum Cx 酶活性的影响

由图11可见，不同培养温度对F. sulphureum Cx 酶活性表现出不同的影响。随着培养温度的升高，其活性呈现先降低后上升的趋势，在温度为25℃时，Cx 酶

11

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

活性最大，在温度为20℃时，Cx 酶活性最低。 2.3.4 培养温度对β-葡萄糖苷酶活性的影响

0.25β-葡萄糖苷酶活性（mg/min.mL）0.200.150.100.05202325温度（℃）2830

图12不同培养温度对F. sulphureum β-葡萄糖苷酶活性的影响

由图12可见，不同培养温度对F. sulphureumβ-葡萄糖苷酶活性表现出不同的影响，当温度高于25℃时，其活性基本不变（约为0.153mg/min.mL），在温度为25℃时，β-葡萄糖苷酶活性最大，在温度为23℃时，β-葡萄糖苷酶活性最低。

3 讨论

本试验通过控制培养条件（温度、PH）和培养时间来有效的控制马铃薯由硫色镰刀菌引起的腐烂，保持茎块的品质包括对马铃薯病害的控制。据报道，研究发现，由植物病原菌产生的细胞壁降解酶在病菌致病过程中起重要作用，随胞壁降解酶浓度增加，酶浸解能力增强，两者呈显著的正相关。同时还发现培养及贮藏条件对酶的产生及活性具有一定的影响，但关于培养条件(温度, pH)对马铃薯干腐病菌(Fusarium sulphureum)细胞壁降解酶产生和活性的影响尚未见报道。本试验中培养条件（温度、时间、pH）可以有效抑制硫色镰刀菌（F. sulphureum Schlechlendahl）生长，在对硫色镰刀菌菌丝生长产生的细胞壁降解酶活性的抑制上有显著的效果。实验表明：（1）在pH为8、培养时间为5d、温度为20℃时对PG抑制作用最显著：（2）在pH为8、培养时间为5d、温度为20℃时对PMG的抑制作用最显著；（3）在pH为8、培养时间为8d、温度为20℃时对Cx抑制作用最显著；

12

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

（4）在pH为5、培养时间为5d、温度为23℃时对β-葡萄糖苷酶的抑制作用最显著。故而可通过调节培养条件来抑制病原物的生长从而有效地控制马铃薯干腐病，可见培养条件抑菌在马铃薯干腐病菌控制中具有良好的应前景。

随科学技术的发展和进步，细胞壁降解酶的作用机制应该可以明确，这可为研究病菌致病的分子机制及新的病害控制措施奠定基础。

4 结论

本试验通过研究培养条件（温度、PH）和培养时间对硫色镰刀菌（F. sulphureum）细胞壁降解酶活性的影响，结果表明：

4.1 pH为6，温度为23℃，培养2d时PG的活性最大，而pH为8，温度为20℃，培养时间延长至5d时，其酶活性显著被抑制。

4.2 pH为6，温度为25℃，培养2d为PMG产生和活性被激活最佳的条件，而pH为8，温度为20℃，培养时间延长至5d时，其酶活性最低。

4.3 Cx产生和活性被激活最佳的条件pH为6，温度为25℃，培养时间2d，而pH为8，温度为20℃，培养时间延长至8d时，其酶活性最低。

4.4 β-葡萄糖苷酶活性最大的培养条件和时间为：pH为8，温度为25℃，培养时间3d，而pH为5，温度为23℃，培养时间延长至5d时，其酶活性显著被抑制。

参考文献

[1] 赵永平, 韩建民.甘肃马铃薯产业竞争力分析[J]. 甘肃农业大学学报, 2005,

40(2): 250-255.

[2] 何苏琴, 金秀琳, 魏周全等. 甘肃省定西地区马铃薯块茎干腐病病原真菌的

分鉴定[J]. 云南农业大学学报, 2004, 5(19):550-552

[3] 张维一, 毕阳. 果蔬采后病害与控制[M]. 北京:中国农业出版社, 1996 [4] 叶琪明, 王拱辰. 浙江马铃薯干腐病病原研究初报[J]. 植物病理学报, 1994, 25:148

[5] 葛永红, 毕阳, 杨冬梅. 诱抗剂处理对“银帝”甜瓜采后粉霉病和黑斑病的抑制

效果[J]. 食品科学, 2006, 27(1):246-249

[6] 张红,徐敬友. 细胞壁降解酶在病菌致病中的作用[J]. 上海农业科技，2008, 6: 1 -28

13

硼酸盐对马铃薯干腐病菌的抑制特性研究

[7] 杜密茹.马铃薯干腐病病原菌鉴定及病害防治的研究[D]. 内蒙古大学, 2008：

1-82

[8] 张红,徐敬友.培养条件对病原物胞壁降解酶种类和活性的影响. 农业科学

2005.

[9] 张杰, 张廷义. 定西市马铃薯贮藏期主要病害及成因分析[J]. 中国马铃薯 2008 12:60-61 [10] 任向宇.马铃薯干腐病田间及贮藏期化学防治效果和致病菌抗药性测定研究

[D]. 内蒙古大学,2011:1-75

[11] 何苏琴, 金秀琳, 魏周全, 张廷义, 杜玺, 骆得功. 甘肃省定西地区马铃薯

块茎干腐病病原真菌的分离鉴定[J]云南农业大学学报, 2004, (05) . 3 （51-53）

[12] 赵蕾,张天宇;植物病原菌产生的降解酶及其作用[J];微生物学通报;2002, 01，

5 : 92-96

14