枇杷叶多酚超声波辅助提取工艺优化及其抗氧性分析

枇杷叶多酚超声波辅助提取工艺优化及其抗氧性分析

作者：丁建英 王晓飞 张丽 权英 来源：《南方农业学报》2018年第02期

摘要：【目的】采用響应面法对超声波辅助提取枇杷叶多酚工艺条件进行优化，并评价其抗氧化性，为枇杷叶多酚的开发利用提供技术支持。【方法】以干燥枇杷叶为原料，在单因素试验基础上，依据Box-Behnken原理选择提取时间、提取温度、料液比和乙醇体积分数4个因素进行响应面试验，确定枇杷叶多酚超声波辅助提取的最佳工艺条件，并与传统溶剂浸提法的提取效率进行对比；以羟基自由基和DPPH自由基的清除率为评价指标，对枇杷叶多酚的抗氧化性进行研究。【结果】通过响应面设计分析得到超声波辅助提取枇杷叶多酚的最佳工艺条件为提取温度67 ℃、提取时间40 min、料液比1∶25、乙醇体积分数60%，在此条件下得到枇杷叶多酚提取率为48.24 mg/g，与理论值48.79 mg/g相近；提取温度、提取温度与料液比及提取时间与料液比的交互作用对枇杷叶多酚提取效果影响显著（P 关键词： 枇杷叶；多酚；超声波辅助提取；抗氧化

中图分类号： S667.309.9 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）02-0340-08 Abstract：【Objective】Ultrasonic assisted extraction of polyphenols from loquat leaves was optimized by response surface method， and antioxidant activity of polyphenols in loquat leaves was evaluated to provided technique support for the development and utilization of loquat leaf polyphenol. 【Method】According to the principle of Box-Behnken， the influencing parameters including extraction temperature， extraction time， solid-liquid ratio and ethanol concentration were optimized using response surface method on the basis of single factor experiment. The optimum

processing conditions of polyphenol extraction from loquat leaves by ultrasonic assisted method were determined， and the extraction rate was compared with that in traditional solvent-extraction method. The antioxidant properties of loquat leaf polyphenols were investigated with the scavenging rate of hydroxyl radical and DPPH as indicators. 【Result】Optimum processing conditions for ultrasonic assisted loquat leaf polyphenol extraction obtained by the response surface design analysis were as follows： extraction temperature was 67 ℃， extraction time 40 min， solid-liquid ratio 1∶25 and ethanol concentration 60%. The total polyphenol yield from loquat leaf was 48.24 mg/g in the optimal conditions， which was consistent with the predicted value（48.79 mg/g）. Extraction temperature， interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio， interaction between extraction time and solid-liquid ratio had significant effects on loquat leaf polyphenol extraction（P Key words： loquat leaf； polyphenol； ultrasonic assisted extraction； antioxidant 0 引言

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【研究意义】植物多酚是来源于植物体的多元酚类，具有很高的生物活性和极强的抗氧化、抑菌作用，在调节血脂和降血糖等方面也有良好效果（陈亮等，2013；张素斌等，2017），植物多酚的提取和分离研究可为天然抗氧化剂和多酚保健食品的开发提供原料。枇杷是一种蔷薇科植物，枇杷叶常作为传统中草药，能清肺止咳、降气化痰（林玉霖等，2006）。枇杷叶含有多种化学成分，如皂苷类、糖类、多酚类、熊果酸等（赖国新，2005）。目前，有关枇杷叶有效成分的分离提取主要集中在三萜类（吕寒等，2008）、黄酮（吕寒等，2014）、熊果酸（林国荣和郭养浩，2014）和多糖（张颖和潘俊羽，2014），但针对枇杷叶多酚的研究相对较少。因此，研究枇杷叶多酚提取工艺，提高其提取率，对枇杷叶有效成分的药用开发具有重要意义。【前人研究进展】近年来，国内外学者对植物多酚的提取技术已有较多研究，其目的主要是降低提取成本、减少污染和提高提取率，除传统的溶剂浸提法外，研究较多的方法还有微波提取（Chandrasekar et al.，2015；李育峰等，2016）、超声波提取（Ma et al.，2009；祖亿等，2017）、脉冲电场（王文渊等，2014；Yu et al.，2015）和酶解萃取（Ricardo et al.，2012；徐婕等，2016）等。目前，枇杷叶多酚的提取主要采用溶剂浸提法和微波提取法。贤景春和何雪燕（2013）采用正交试验优化乙醇浸提枇杷叶多酚工艺，发现在乙醇体积分数50%、浸提温度90 ℃、料液比1∶30的条件下浸提150 min，得到总多酚含量10.584 mg/g；黄正虹（2014）采用正交试验优化微波辅助提取枇杷叶多酚工艺，在最佳工艺条件（乙醇体积分数70%、提取温度80 ℃、提取时间30 min、液料比60∶1）下提取获得枇杷叶多酚含量9.34 mg/g；王建超等（2015）采用乙醇浸提枇杷叶多酚，利用响应面法优化得到提取工艺为乙醇体积分数48.5%、料液比1∶21、浸提温度60 ℃、浸提时间2.6 h，多酚提取率最高为34 mg/g。上述传统的溶剂浸提法提取时间较长，均超过2.0 h；微波辅助提取法虽然提取时间有所缩短，但多酚提取率较低。【本研究切入点】超声波辅助提取法是一种简单、方便的提取方法，具有提取时间短、效率高、成本低、可减少高温对提取物的影响等优点（李斌等，2015；杨申明等，2016），但利用此法提取枇杷叶多酚的相关研究目前鲜见报道。【拟解决的关键问题】以干燥枇杷叶为原料，探討超声波提取时间、温度、料液比、乙醇体积分数等参数对枇杷叶多酚提取率的影响，采用响应面法对提取工艺参数进行优化，确定最佳提取条件，并对提取的枇杷叶多酚抗氧化性进行研究，以期为枇杷叶多酚的开发利用提供技术支持。 1 材料与方法 1. 1 试验材料

枇杷叶采摘于苏州常熟虞山宝岩生态园，挑选无病虫害和机械损伤且成熟的叶片，经清水洗净，置于干燥箱中50 ℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛， -20 ℃保存备用。主要试剂：没食子酸标准品和福林酚试剂购自国药集团化学试剂有限公司；无水碳酸钠、无水乙醇、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基、水杨酸、双氧水和硫酸亚铁购自上海强顺化学试剂有限公司。主要仪器设备：LGJ-10冷冻干燥仪（北京四环科学仪器厂有限公司）、DJ-04粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）、TU-1091型紫外分光光度计（北京普析通用仪器责任有限公司）、HH-4数显恒温水浴锅（常州华冠仪器制造有限公司）、DL-5000B-II离心机（上海安亭科学仪器厂）、EL104电子天平[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司]、KH-300B超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

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1. 2 试验方法

1. 2. 1 枇杷叶多酚含量测定 采用福林酚比色法测定多酚含量。

1. 2. 1. 1 标准曲线制作 称取0.005 g没食子酸，用蒸馏水溶解并定容于50.0 mL容量瓶，制成没食子酸标准液；用移液分别移取100、200、300、400、500 µL没食子酸标准液置于10.0 mL容量瓶中，加入0.5 mL福林酚试剂和2.0 mL 15%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容，于40 ℃水浴反应20 min，显色后在765 nm处测定吸光值。以没食子酸为标准品绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.10877x+0.03110（R2=0.9991），式中，x为没食子酸质量浓度（mg/L），y为吸光值。

1. 2. 1. 2 多酚提取率计算 吸取一定量的样品提取溶液，进行适当倍数稀释后依次加入0.5 mL福林酚试剂和2.0 mL 15%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至10.0 mL，40 ℃水浴20 min后，在765 nm处测定吸光值，根据标准曲线方程计算样品溶液多酚质量浓度，再按公式计算枇杷叶多酚提取率。

Y=[C×V×nm] （1）

式中，Y为多酚提取率（mg/g），C为提取液多酚质量浓度（mg/mL），V为提取液总体积（mL），n为稀释倍数，m为枇杷叶粉末质量（g）。

1. 2. 2 枇杷叶多酚提取工艺流程 枇杷叶粉末→加入乙醇溶液→混匀→超声波辅助提取（或溶剂浸提）→4000 r/min离心10 min→上清液即为样品提取液。

1. 2. 3 枇杷叶多酚提取单因素试验 用超声波提取法对枇杷叶多酚进行提取，以枇杷叶多酚提取率为评价指标，对超声波辅助提取的温度、时间、料液比、乙醇体积分数等工艺参数进行优化试验，考察4个因素对枇杷叶多酚提取效果的影响。各参数设置见表1。

1. 2. 4 工艺优化试验 根据单因素试验结果，依照Box-Behnken中心组合试验设计原理，将超声波辅助提取的工艺参数（乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间）设为试验因素，以枇杷叶多酚提取率为响应值，设计4因素3水平的响应面试验（表2），优化超声波辅助提取枇杷叶多酚的工艺条件。

1. 2. 5 超声波辅助提取和传统溶剂浸提对枇杷叶多酚提取率的影响比较 取相同质量的枇杷叶粉末，用60%乙醇溶液作提取溶剂，在料液比1∶25，提取温度67 ℃的条件下分别浸提60、90和150 min，计算多酚提取率；利用响应面优化得到的超声波辅助提取工艺（超声波功率300 W）对枇杷叶进行提取，计算多酚提取率，比较两种方法对枇杷叶多酚提取效果的影响。

1. 2. 6 枇杷叶多酚提取物抗氧化能力测定

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1. 2. 6. 1 清除羟基自由基能力测定 参考陈义勇等（2013）、李斌等（2015）的方法稍加改进，将提取液进行不同质量浓度梯度稀释并编号，分别在每支试管中加入1.0 mL 9 mmol/L硫酸亚铁溶液和1.0 mL 9 mmol/L水杨酸—乙醇溶液，混匀后加入不同质量浓度枇杷叶多酚提取液，最后加入1.0 mL 8.8 mmol/L双氧水溶液，37 ℃水浴30 min，以蒸馏水为参比，在510 nm处测吸光值。考虑到多酚溶液本身的吸收，将1.0 mL 9 mmol/L硫酸亚铁溶液、1.0 mL 9 mmol/L水杨酸—乙醇溶液、1.0 mL不同质量浓度枇杷叶多酚溶液和1.0 mL蒸馏水作为本底吸光值，根据公式（2）计算枇杷叶多酚对羟基自由基的清除率。 清除率（%）=（1-[A样品-A对照A空白]）×100 （2）

式中，A空白为空白对照液吸光值；A样品为加入多酚溶液后的吸光值；A对照为不加显色剂双氧水多酚溶液吸光值。

1. 2. 6. 2 清除DPPH自由基能力测定 参考袁建梅等（2012）的方法进行抗氧化测定。将提取液进行不同质量浓度梯度稀释并编号，将2.0 mL不同质量浓度枇杷叶多酚溶液、2.0 mL DPPH溶液逐步加入试管，振荡，遮光反应30 min，以60%乙醇为空白调零，测其在517 nm处吸光值。以2.0 mL不同浓度样品和2.0 mL 60%乙醇为对照，2.0 mL DPPH溶液和2.0 mL 60%乙醇为空白组。根据公式（3）计算枇杷叶多酚对DPPH自由基的清除率。 清除率（%）=（1-[Ai-AjAc]）×100 （3）

式中，Ai为2.0 mL DPPH溶液+2.0 mL样品液的吸光值；Aj为2.0 mL样品液+2.0 mL无水乙醇的吸光值；Ac为2.0 mL DPPH溶液+2.0 mL无水乙醇的吸光值。 2 结果与分析 2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 提取温度对枇杷叶多酚提取率的影响 图1显示，提取温度在40～60 ℃内，枇杷叶多酚提取率隨提取温度的升高而不断增加，60 ℃时达最大值，超过60 ℃后多酚提取率下降。这是由于提取温度升高导致分子运动变快，多酚在乙醇中的析出增加；但温度达60 ℃后，乙醇挥发加速，多酚结构被破坏，提取液纯度降低，多酚提取率也随之降低。因此，选择提取温度50～70 ℃进行后续的响应面试验。

2. 1. 2 提取时间对枇杷叶多酚提取率的影响 由图2可知，当提取时间为20～40 min时，枇杷叶多酚提取率随时间的延长而增加，料液接触时间越长越有利于多酚的溶出；但超过40 min后多酚提取率逐渐降低，可能是多酚溶出后易被空气氧化，或超声波对溶出的多酚产生破坏。故选择提取时间为30～50 min，以进行后续的响应面试验。

2. 1. 3 料液比对枇杷叶多酚提取率的影响 由图3可知，料液比为1∶10～1∶25时，多酚提取率随料液比的减小而增加，说明枇杷叶多酚与溶剂间浓度差增大更有利于溶质的溶出，但

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料液比达1∶30时不利于提取液的后期处理，导致提取率下降。因此，选择料液比1∶20～1∶30进行后续的响应面试验。

2. 1. 4 乙醇体积分数对枇杷叶多酚提取率的影响

图4显示，乙醇体积分数为40%～60%时，枇杷叶多酚提取率呈明显上升趋势，60%时达最大值；但在乙醇体积分数为60%～80%时逐渐降低，可能是多酚与乙醇的极性相差较大，当乙醇达到一定体积分数后无法再将多酚充分溶出，或是乙醇体积分数过大溶出更多的醇溶杂质，导致多酚提取率受到影响。因此，选择提取液乙醇体积分数为50%～70%进行后续的响应面试验。

2. 2 响应面试验优化提取条件

2. 2. 1 响应面分析结果 利用Box-Behnken对单因素试验结果选择的工艺条件进行试验设计，以枇杷叶多酚提取率Y为响应值，设计出4因素3水平的29个试验（其中中心点重复试验5次），以优化枇杷叶多酚的工艺参数。设计参数及试验结果见表3。

根据试验结果得到枇杷叶多酚提取率对提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）及乙醇体积分数（D）4个因素的二次多项回归模型：Y=51.32+1.28A-0.50B+0.84C+0.16D+0.028AB-2.02AC-0.52AD+1.77BC-0.26BD-0.033CD-7.09A2-5.97B2-6.00C2-3.99D2。

对模型进行回归分析，其结果见表4。由表4可知，提取温度一次项、提取温度与料液比的交互项、提取时间与料液比的交互项达显著水平（P0.05）差异不显著，可用于枇杷叶多酚超声波辅助提取工艺的优化分析。

2. 2. 2 因素间交互作用分析结果 图5为4个因素对枇杷叶多酚提取率影响的响应曲面图，可看出各因素的最佳水平及因素间的交互作用。若响应曲面呈山峰状，表明存在极大值；呈山谷状，表明存在极小值；呈马鞍状，表明极值不存在。从图5可看出，料液比与提取温度交互作用的响应曲面图表现为曲面较陡，交互作用显著；料液比与提取时间交互作用的响应曲面图呈山峰状，当料液比一定时，多酚提取率随提取时间的延长而增大，达极大值后逐渐减小，二者的交互作用对枇杷叶多酚提取率也有显著影响。

2. 2. 3 验证试验结果 利用响应面建立的模型优化枇杷叶多酚超声波辅助提取工艺参数，得到最佳工艺条件为提取温度66.99 ℃、提取时间39.52 min、料液比1∶24.72、乙醇体积分数59.72%、超声波功率300 W。为了确保实际操作的可行性，将提取条件设为提取温度67 ℃、提取时间40 min、料液比1∶25、乙醇体积分数60%，此时枇杷叶多酚提取率理论值为48.79 mg/g。利用最佳工艺条件提取枇杷叶多酚，经3次平行试验，得到多酚提取率为48.24 mg/g，接近于理论值，表明建立的模型可行。

2. 3 超声波辅助提取和传统溶剂浸提对枇杷叶多酚提取率的对比分析结果

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由图6可知，超声波辅助提取40 min时，得到枇杷叶多酚47.12±1.40 mg/g，溶剂浸提150 min得到枇杷叶多酚为14.72±0.85 mg/g，对比结果表明超声波辅助提取法的效率高于传统的溶剂浸提法。

2. 4 枇杷叶多酚溶液的抗氧化能力分析结果 2. 4. 1 枇杷叶多酚溶液对羟基自由基的清除效果

图7显示枇杷叶多酚对羟基自由基有一定的清除能力，且随多酚质量浓度的增加，清除率逐渐增大。枇杷叶多酚质量浓度为20 µg/mL时，其清除率为40%。

2. 4. 2 枇杷叶多酚溶液对DPPH自由基的清除效果 从图8可看出，多酚溶液质量浓度为4～20 µg/mL时，其对DPPH自由基的清除率随多酚溶液质量浓度的增加而逐渐增大，清除能力逐渐增强，对应的线性关系方程式为y=1.8125x+20.7900（R2=0.9887），当多酚溶液质量浓度为20 µg/mL时，清除率达56%。说明枇杷叶多酚对DPPH自由基有较好的清除效果。 3 讨论

超声波辅助提取是植物多酚常用的提取方法，具有提取率高、操作简便、溶剂用量少等优点。陶令霞等（2008）利用超声波辅助提取苹果渣中多酚，在最佳工艺条件下得到苹果多酚提取率为4.29 g/kg。祖亿等（2017）利用超声波辅助提取燕麦多酚，在最佳条件下燕麦多酚提取率为1.83 g/kg。影响超声波辅助提取植物多酚的因素较多，如超声波功率、料液比、提取温度、提取时间等，本研究利用4因素3水平响应面试验优化超声波辅助提取枇杷叶多酚工艺，得到最佳工艺条件为提取温度67 ℃、提取时间40 min、料液比1∶25、乙醇体积分数60%。其中，提取温度、提取温度与料液比、提取时间与料液比的交互作用对多酚提取率影响显著。在最佳提取工艺条件下，得到枇杷叶多酚提取率为48.24 mg/g，明显高于贤景春和何雪燕（2013）采用正交试验优化乙醇浸提工艺条件得到的枇杷叶多酚提取率（10.584 mg/g），也高于王建超等（2015）采用响应面法优化乙醇浸提工艺条件得到的多酚提取率（34 mg/g），超声波辅助提取法与溶剂提取法相比，可明显提高多酚的提取效率。

植物多酚的酚羟基中邻位酚羟基极易被氧化，且对活性氧等自由基有较强捕捉能力，使得植物多酚具有很强的抗氧化性和清除自由基能力（刘畅和周家春，2011）。本研究通过测定枇杷叶多酚对羟基自由基和DPPH自由基的清除能力，结果表明，随着多酚质量浓度的不断升高，羟基自由基和DPPH自由基的清除能力不断增强，枇杷叶多酚质量浓度为20 µg/mL时，羟基自由基和DPPH自由基的清除率分别为40%和56%。但本研究未与维生素C进行比较，在后续的研究中将增加枇杷叶多酚质量浓度开展其他抗氧性试验，并与维生素C进行比较分析，进一步完善枇杷叶多酚抗氧化性的研究。 4 结论

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响应面法优化的超声波辅助提取枇杷叶多酚工艺条件合理可行，与传统溶剂浸提法相比，超声波辅助提取法可明显提高多酚提取率；枇杷叶多酚具有较强的抗氧化性。 参考文献：

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