前一周我刚刚做过单酶切连接,目的片段（pKB-2为克隆载体）4600多,载体pART27，11500,连接比例3:1,昨天刚刚鉴定出来阳性克隆，阳性克隆占30%。
步骤如下：
○1.前一天晚上用NoTI酶切pART27，用100μL的体系。体系如下：
质粒30μl
10×buffer 10μl
0.1%BSA10μl
0.1%TritonX-100 10μl
灭菌水 38μl
NoTI 2μl
○2.回收酶切产物，步骤如下：
1. 加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次。加溶液后上下颠倒混匀，冰上放置5min.12000,离心5min。
2. 吸取上清，尽量不要吸到有机相，加二倍体积的无水乙醇（提前在-20度预冷）沉淀DNA. 加溶液后上下颠倒混匀，冰上放置5min.12000,离心5min。
3. 倒去乙醇，然后加70%的乙醇洗涤沉淀，上下颠倒5次，静止1-2 min，弃上清，快速离心，吸干乙醇，平放无菌操作台，鼓风吹15 min。
4. 吹干后，加20μlTE溶解.
○3回收产物去磷酸化，体系如下：
DNA Framgents in TE buffer 20μl
10×Alcaline phosphatase buffer 5μl
CLAP 1μl
灭菌水 24μl
PS: NoTI是5′突出端，所以选用37度30 min反应。
○4.回收去磷酸产物，步骤如下：
1. 加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次。加溶液后上下颠倒混匀，冰上放置5min.12000,离心5min。（注：酶切说明书要求抽提二次，但考虑损失太多，故舍去一次。）
2. 加等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次。加溶液后上下颠倒混匀，冰上放置5min.12000,离心5min。
3. 添加5μl3MNaoAC。
4. 紧接着加125μl（2.5倍）冷乙醇，加完后上下颠倒混匀在-20℃下保冷30-60 min，12000,离心5min。
5. 用200μl的70%冷乙醇洗涤沉淀，上下颠倒5次，静止1-2 min，弃上清，快速离心，吸干乙醇，平放无菌操作台，鼓风吹15 min。
6. 吹干后，加10μlTE溶解.
○5.12：00，用NoTI酶切pKB-2，同时制1%胶，采用100μL的体系（同pART27酶切）。
○6.15：00，电泳pKB-2片段同时检测pART27片段。
○7.胶回收pKB-2片段回收步骤如下：
1. 加350μL的binding buffer,55℃条件下，水浴10 min，期间上下颠倒5次。
2. 室温下放置1 min，8000r/min,离心1min。
3. 倒去溶胶，加入500μL的Washing buffer，8000r/min,离心1min。
4. 重复步骤３.
5. 倒去溶液，快速离心１５Ｓ。
6. 加１０μL Ｅlution buffer溶解。
○8.17：00 ，做连接，连接体系如下：
连接buffer 5μL
pKB-2回收片段 3μL
pART27片段 1μL
连接酶 1μL
16度连接一个半小时，放入4度。
○9.做感受态，步骤如下：
1. 吸取二次活化的菌液1.5ML，快速离心30S,收集菌体。
2. 取预冷的0.1M的CaCI2200μL，重悬菌体。冰上放置25 min。
3. 快速离心30S，重新收集菌体。
4. 加入0.1M的CaCI275μL，重悬菌体，放入4度备用。
○10.转化，
1. 吸取连接产物，加入到150μL的感受态细胞中，冰上放置30分钟。
2. 42℃循环水浴中热激90S，迅速冰浴2min.
3. 加入600μLLB，37度振荡培养45 min。
4. 4000r/min离心10 min,弃450μL上清，
5. 悬沉淀，用100μL铺平板。
6. 37度培养12-24H。
希望对你有所帮助，如果还有问题的话，继续探讨
