第３１卷第２期 陕西科技大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ【．３ｌ Ｎｏ．２ Ａｐｒ．２０１３ ２Ｏｌ３年４月 文章编号：ｉ０００—５８１１（２０１３）０２—００８９—０４ 正交法优化保加利亚乳杆菌冻干保护剂 陈 合，李串娜，舒国 伟，罗 茜 陕西西安 （陕西科技大学生命科学与工程学院， ７１００２１） 摘要：通过单因素实验和正交试验设计，研究了乳糖、脱脂乳粉、蔗糖和抗坏血酸钠等４种物 质对保加利亚乳杆菌的冻干存活率及菌粉活茵数的影响，确定了适合保加利亚乳杆菌的最佳 冻干保护剂配方．结果表明，４种物质的保护效果依次为：蔗糖＞脱脂乳粉＞抗坏血酸钠＞乳 糖；最佳保护剂的配方为：３Ｏ 蔗糖＋２Ｏ ９／６脱脂乳粉＋４．０ 抗坏血酸钠＋２Ｏ 乳糖．加入冻干 保护剂后，保加利亚乳杆菌冻干后存活率可达９４ ，菌粉的活菌数达１．９２６×１０“ｃｆｕ／ｇ． 关键词：保加利亚乳杆菌；冷冻干燥；保护剂；正交优化 中图法分类号：Ｔ￥２０１．３ 文献标识码：Ａ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇ ｃｒｙ０ｐｒ０ｔｅｃｔａｎｔｓ ｆｏｒ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ＣＨＥＮ Ｈｅ，ＬＩ Ｃｈｕａｎ一 ｎａ，ＳＨＵ ＧＵＯ—ｗｅｉ，ＬＵＯ Ｑｉａｎ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉ ａｎ ７１００２１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌａｃｔｏｓｅ，ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ，ｓｕｃｒｏｓｅ ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｆｒｅｅｚｅ——ｄｒｉｅｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒ—— ｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｗａｓ ｓｕｃｒｏｓｅ￣ｓｋｉｍｍｅｄ ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ￣ｓｏｄｉｕｍ ａｓｃｏｒｂａｔｅ￣Ｌａｃｔｏｓｅ．Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ ｉｎ— ｇｒｅｄｉｅｎｔ ｗａｓ：３０％ｓｕｃｒｏｓｅ＋２０ ｓｋｉｍｍｅｄ ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ＋４．０ ｓｏｄｉｕｍ ａｓｃｏｒｂａｔｅ十２０ ９／６Ｌａｃ— ｔｏｓｅ，ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ａｎｄ ｖｉａｂｌｅ ｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｉｅｄ ｉｓ ｕｐ ｔｏ ９４ ａｎｄ １．９２６×１０“ｃｆｕ／ｇ ｗｈｅｎ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ；ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇ；ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ 于人体肠道，可降低肠道内的ｐＨ值，抑制肠道中 ０ 引言 菌的生长并减弱菌在肠道内的产毒作用， 保加利亚乳杆菌属于革兰氏阳性，厌氧细菌． 单个个体成长杆状或链状，两端椭圆，不具运动性， 也不会产生孢子．它属于化能异养型微生物，最适 防治细胞老化，降低胆固醇及调节人体生理机能等 医疗保健作用．因此，正受到越来越多消费者的欢 迎和喜爱 ． 目前，冻干菌粉的制备多采用真空冷冻干燥 法 ］．但其中冷冻和干燥两个过程均会造成微生物 细胞不同程度的损伤、死亡及某些酶蛋白的钝化． 生长温度一般为３７～４５℃，温度高于５Ｏ℃或低于 ２Ｏ℃则不能生长． 保加利亚乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ， ＬＢ）是有益于人体健康的益生菌之一［１］，主要存在 ＊收稿日期：２０１２－１１ ２３ 基金项目：陕西省科技厅工业攻关项目（２０１２Ｋ０８—１ ７） 作者简介：陈合（１９５６），男，陕西武功人，教授，研究方向：食品生物技术 ・ ９０ ・ 陕西科技大学学报 第３１卷 如果菌体直接进行冷冻干燥，存活率只有１０～ ３０ ９／６左右 ］，若将菌体悬浮于适宜的介质中再进 行冷冻干燥，菌体的存活率可达到７０ 以上．因 此，选择合适的冻干保护剂非常必要． 保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、 化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损 害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活 性 ．冻干保护剂不仅影响乳酸菌在冻干过程中 的细胞存活率，还影响保藏期间的细胞稳定性＿ｌ ． 正交试验设计是使用正交表来安排多因素多 水平试验，并采用统计学方法分析结果的一种实验 设计方法．它不仅可以解决多因素选优问题，而且 还可以用来分析各因素对试验结果影响的大小，从 而找出主要因素． 本课题组在前期通过Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ试验 设计优化筛选了对保加利亚乳杆菌生长影响较为 显著的几种氮源，初步确定了３种氮源的添加 量 ｊ．本研究则通过单因素实验研究了乳糖、脱脂 乳粉、蔗糖和抗坏血酸钠等４种物质对该菌的冻干 存活率及菌粉活菌数的影响；在此基础上，并采用 正交实验对保加利亚乳杆菌的抗冻保护剂进行了 优化，从而为保加利亚乳杆菌冻干菌粉的生产提供 了一定的参考依据． １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１菌种及培养基 ＭＲＳ培养基（ｇ／１００ｍＬ）：葡萄糖２，蛋白胨１， 牛肉膏０．８，酵母浸粉０．４，柠檬酸二铵０．２，磷酸 氢二钾０．２，乙酸钠０．５，ＭｇＳＯ ０．０２，ＭｎＳＯ４ ０． ００４，吐温一８０ ０．１ ｍＩ ． １ｌ８℃灭菌１５ ｍｉｎ，用于菌种的活化、培养及 计数． １．１．２主要试剂与仪器 试剂：蔗糖，乳糖、脱脂乳粉和抗坏血酸钠及以 上ＭＲＳ培养基中所用试剂均为生化试剂级． 仪器：ＳＷ—ＣＪ ＩＦ无菌操作台，苏州净化； ＤＨ５０００ＡＢ电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器 有限公司；手提式蒸汽压力灭菌器，江阴滨江医疗 器械厂；电热鼓风干燥箱，天津泰斯特仪器有限公 司；ＬＧ１０—２．４离心机，北京医用离心机厂；ＦＤ一１Ｄ一 ５０真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公 司；离心机，北京医用离心机厂． １．２ 实验方法 １．２．１ 工艺流程 菌种活化一菌种培养一离心收集菌泥一加保 护剂一预冻一真空冷冻（２４ ｈ）一复水一活菌计数． １．２．２ 菌种活化 将Ｉ Ｂ以２ 的接种量接种于ＭＲＳ培养基 中，活化三次，镜检无杂菌后，置于４℃冰箱保存． １．２．３菌体培养及收集 将活化好的Ｉ Ｂ以４ （Ｖ／Ｖ）接种量接种于 ＭＲＳ培养基中，３７℃培养１８ ｈ．然后将培养液置 于离心管中，以８ ０００ ｒ／ｍｉｎ的转速离心１５ ｍｉｎ， 倒掉上清液，从而获得菌泥． １．２．４冷冻干燥工艺 向菌泥中加入保护剂后，于一４０℃冰箱内预 冻４ ｈ，然后置于真空冷冻干燥机内，于一５１℃、６． ９３ Ｐａ下冻干２４ ｈ． １．３ 测定方法 １．３．１菌体形态观察 采用甲苯胺蓝染色法：在涂片上滴加０．２ 的 甲苯胺蓝染色液，酒精灯上稍加热后移开，置于室 温下染色２ ｍｉｎ后水洗，然后用１ 的乙酸脱色１ ～２ Ｓ后用水冲去，用滤纸吸干周围多余的水分或 自然干燥后镜检． １．３．２活菌数测定 （１）冷冻干燥前对菌悬液进行活菌计数．（２）冷 冻干燥后，用３０ ｍＬ灭菌后的生理盐水复水冻干 菌粉再进行活菌计数．通过梯度稀释法，将菌悬液 适当稀释，选择合适的稀释度取０．１ ｍＩ 接种于 ＭＲＳ计数培养基中，涂布均匀后，于３７℃培４８～ ７２ ｈ后，选３０～３００个之间的菌落数进行活菌计 数，每个稀释度做三个求均值． １．３．３存活率和菌粉活菌数计算 存活率（ ）一冻干后总活菌计数／冻干前总活 菌计数×１００ 菌粉活菌数（ｃｆｕ／ｇ）一冻干后总活菌数×菌悬 液体积／菌粉重 ２结果与分析 ２．１蔗糖对保加利亚乳杆菌冻干效果的影响 保加利亚乳杆菌经过三次活化后，在３７℃恒 温箱中培养１８ ｈ，然后于８ ０００ ｒ／ｍｉｎ、离心１５ ｍｉｎ，倒掉上清液，获得菌泥，向菌泥中加入蔗糖保 护剂，使蔗糖浓度分别为５ 、１０ 、１５ 、２ｏ 、 ２５ ，并补充磷酸缓冲液使添加物总量与菌泥等 重，预冻后进行冻干．冻干存活率与菌粉活菌数如 图１所示． 从图１中可以看出，随着蔗糖浓度的增加，保 第２期 陈 合等：正交法优化保加利亚乳杆菌冻干保护剂 ・ ９１ ・ 奄 ＼ Ｉｕ ＿。 ０ ＼ 鼎 坦 忙 麒：糖／％ 图１蔗糖对保加利亚乳杆菌冻干的影响 加利亚乳杆菌的存活率不断增加，菌粉活菌数先减 小后增加，当蔗糖浓度达到２５％时，菌体的存活率 为２４．５ ，菌粉活菌数达到０．６９２×１０¨ｃｆｕ／ｇ． ２．２乳糖对保加利亚乳杆菌冻干效果的影响 保加利亚乳杆菌经活化，培养后离心获得菌 泥，再加入乳糖，使乳糖浓度分别为５ 、１０ 、 １５ 、２０ 、２５ ，并补充磷酸缓冲液，冻干后结果 如图２所示． 图２乳糖对保加利亚乳杆菌冻千的影响 从图２可以看出，保加利亚乳杆菌存活率和菌 粉活菌数随着乳糖浓度的变化而变化，当乳糖浓度 达到２Ｏ 时，菌体存活率达到最高值３５．６ ；当乳 糖浓度２５％时，菌粉活菌数达到最大值为０．９８３× １０”ｃｆｕ／ｇ． ２．３ 脱脂乳粉对保加利亚乳杆菌冻干效果的影响 保加利亚乳杆菌经活化后，培养离心获得菌 泥，再加人脱脂乳粉，使脱脂乳粉浓度分别为５ 、 １０ 、１５％、２Ｏ 、２５ ，并补充磷酸缓冲液，冻干后 结果如图３所示． 从图３可以看出，随着脱脂乳粉浓度的变化， 保加利亚乳杆菌存活率和活菌数随之变化，当脱脂 乳粉浓度达到２５％时，菌体存活率达到最大值６４． ４ ；当脱脂乳粉浓度２Ｏ 时，菌粉活菌数达最大 值１．６８×１０“ｃｆｕ／ｇ． 儡 ＼ ＝ ０ 巴 ＼ 墟 脱脂乳粉／％ 图３脱脂乳粉对保加利亚 乳杆菌冻干的影响 ２．４抗坏血酸钠对保加利亚乳杆菌冻千效果的影 响 保加利亚乳杆菌经活化后，培养离心获得菌 泥，加入抗坏血酸钠，设置抗坏血酸钠浓度分别为 １．５ 、３．０ 、４．５ 、６．０ 、７．５ ，并补充磷酸缓 冲液，使添加物总量与菌泥等重，冻干后结果如图 ４所示． 奄 ＼ ＝ ７－ ０ 巴 ＼ 坦 蜒 抗坏血酸钠／％ 图４抗坏血酸钠对保加利亚 乳杆菌冻干的影响 从图４中可以看出，当抗坏血酸钠浓度达到 ４．５ 时，保加利亚乳杆菌的存活率和活菌数均达 到最大值８４．７ 和０．５１×１０”ｃｆｕ／ｇ，因此，４．５ 的抗坏血酸钠浓度在保加利亚乳杆菌冻干过程中， 保护效果最好． ２．５ 最佳冻千保护剂的确定 在单因素的基础上，采用四因素三水平试验设 计，对蔗糖（Ａ）、乳糖（Ｂ）、脱脂乳粉（Ｃ）和抗坏血 酸钠（Ｄ）４个因素进行考察，分析筛选出影响较大 的因素及最佳冻干保护剂配方，各种保护剂水平设 计见表１，其响应值Ｙ为保加利亚乳杆菌存活率， ・ ９２ ・ 陕西科技大学学报 试验设计和结果见表１ 第３１卷 Ｙ 为保加利亚乳杆菌菌粉活菌数（×１０“ｃｆｕ／ｇ）． 表１正交试验设计及结果 由表１极差Ｒ、Ｒ 分析可知，４种保护剂对菌 探讨［Ｊ］．中国乳品工业，２００２，３０（５）ｔ ６６—６７． 种存活率及活菌数影响的主次因素是一致的，由大 到小顺序为Ａ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｂ，即蔗糖对存活率和活菌 １－３］蒲丽丽，刘 宁，张英华，等．乳酸菌冻干保护及及保护机 理的研究进展ＥＪ］．现代食品工业，２００５，２１（１）：１ ４７—１４８． ［４３张英华，霍贵成，郭钨．乳酸菌冷冻干燥保护剂的筛选及 数影响最大，其次是脱脂乳粉、抗坏血酸钠、乳糖． 根据极差分析，存活率及活菌数最高组的最佳 组合为Ａ Ｂ ｃ Ｄ。，因为这个组合不在已做的９次 试验中，所以又做了Ａ Ｂ。Ｃ Ｄ。进行了验证．发现 加速储存稳定性试验［Ｊ］．中国乳品Ｉ＝：业，２００７，３５（２）：８ １０． ［５］卢行安．乳酸菌冷冻干燥工艺的研究进展．中国微生态学 杂志，２００１，１３（１）：５８—６１． 保加利亚乳杆菌的存活率为９４ ，菌粉的活菌数 为１．９２６×１０“ｃｆｕ／ｇ，均高于表１中的存活率和菌 粉活菌数，所以最佳组合为Ａ Ｂ Ｃ Ｄ。，即最佳冻 干保护剂配方为：３０ 蔗糖＋２Ｏ 脱脂乳＋４．０ 抗坏血酸钠＋２Ｏ 乳糖． ３ 结论 ［６］徐成勇，郭本恒，吴 昊，等．酸奶发酵剂和乳酸菌生物技 术育种［Ｊ］．中国生物工程杂志，２００４，２４（７）：５５ ５９． ［７］Ｅ．ｃｏｓｔａ，Ｊ．ｕｓａｌ１．Ｎ．ｔｅｉｘｉｄｏ，Ｎ．Ｇａｒｃｉａ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｏ— ｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ，ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ ａｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａ ｔｉｏｎ ｏｎ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｔｓ ｓｔｒａｉｎ ＣＰＡ一２ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔＯ ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉ— ｏｌｏｇｙ，２０００，８９（５）：７９３ ８００． ［８］陈 合，李串娜，舒国伟．Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ法筛选保加利 亚乳杆菌发酵培养基氮源［Ｊ］．陕西科技大学学报，２０１２， 保加利亚乳杆菌的最佳保护剂配方为：３Ｏ 蔗 糖＋２０ 脱脂乳粉＋４．０ 抗坏血酸钠＋２０ 乳 糖．该复配保护剂能使保加利亚乳杆菌在真空冷冻 干燥中的存活率达到９４ ，菌粉的活菌数达１．９２６ ×１０“ｃｆｕ／ｇ． ３ｏ（６）：７１—７４． ［９］熊泽，仇敏，邵伟，等．瑞士乳杆菌冻干发酵剂制备 中保护剂的选择＿Ｊ］．冷饮与速冻食品工业，２００６，１ ２（３）： ２Ｏ一２４． ［１ｏ］袁亚宏，岳田利，高振鹏，等．冻干高活力乳酸菌粉保护剂 的研究［Ｊ］．西北农林科技大学学报，２００３，３ｌ（Ｂ１０）：８２ ８４． 参考文献 ［１］黄良昌，吕晓玲，邢晓慧．酸奶发酵剂的研究进展口］．广州 食品工业科技，２００１，６７（３）：４３—４９． ［１１］Ｔａｄａｎｏｒｉ Ｓ，Ｔａｋｅｈｉｋｏ Ｇ．Ｙｏｓｈｉｙａｓｕ Ａ．Ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｃｅ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｇｒｏｗｉｎｇ ｉｎ ａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｅｈａ— ｌｏｓｅ ａｎｄ ｗａｔｅｒ［Ｊ］．Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ，２００２，２４０（１—２）： ２１ ８—２２９ ［２３山丽杰．浓缩型乳酸菌发酵剂制备中几个技术关键问题的
