维普资讯 http://www.cqvip.com 嗜肺军团菌毒力基因、致病性 及实验诊断研究进展 广州医学院医学检验中心 胡朝晖 综述摘要朱庆义审校 嗜肺军团菌是引起军团菌肺炎的重要病原体，关于军团菌感染的致病机制目前尚不十分清楚。 近来研究发现，军团菌的致病性与其毒力因子和铁代谢等相关。本文对嗜肺军团菌的毒力因子及其作用、致 病机制和实验室诊断方法研究进展作一综述。 军团菌是兼性胞内寄生菌，普遍存在于天然淡 水和人工水域环境（自来水、热水淋浴器、空调、 和溶解巨噬细胞。嗜肺军团菌在血红素（ｈｅｍｅ）利用 过程中含有一个特殊的基因座ｒｃｐ基因，编码蛋白 冷却塔水等）中或在原生动物（阿米巴）胞内寄居，是 引起军团病的重要病原体Ｅ 。目前已知军团菌有 ４２种６４个血清型 ，能引起人类疾病的约有２０种， 常见的有嗜肺军团菌、麦氏军团菌、长滩军团菌、博 氏军团菌、菲氏军团菌、杜氏军团菌等，其中嗜肺军 团菌是引起人流行性、散发性和医院内获得性肺炎 的重要病原菌 Ｊ。嗜肺军团菌有１５个血清型，其中 １型在人军团菌获得性肺炎中最常见 ４ Ｊ。关于军团 菌感染的致病机制尚不十分清楚。近年来的研究发 与沙门菌肠炎血清变种鼠伤寒的ｐａｇＰ基因类似，具 有抗阳离子抗生素肽（ＣＡＭＰｓ）的作用，是促进细菌 在细胞内感染和毒力所必需 Ｊ。嗜肺军团菌有２个 转座子插人基因ＩｓｐＫ、ａｒｏＢ以及ｃｙｃＫ、ｔｒａＡ基因座。 ｉｓｐＫ基因位在Ⅱ型分泌系统编码部分，是嗜肺军团 菌的主要分泌蛋白（Ｍｓｐ）分泌的一种３８×１０３ Ｚｎ一 金属蛋白酶，具有酪蛋白溶解和溶血活性；ａｒｏＢ基因 编码有一个有关芳香族氨基酸生物合成的代谢酶， 类似荧光假单胞菌细胞色素Ｃ的生源蛋白ＣｙｃＫ （ｃｃｍＦ基因），在厌氧呼吸和氮的生物合成以及亚铁 血红素组成成分脱辅基细胞色素共价连接中起重要 现，军团菌的致病性与其毒力因子和铁代谢等密切 相关Ｅ５，６］。 一、毒力因子及其作用 作用。嗜肺军团菌ａｒｏＢ基因，通过芳香族氨基酸途 径能导致细菌毒力减弱，是由于细菌不能获得芳香 根据嗜肺军团菌ＤＮＡ序列分析，军团菌变种 ＮＵ２１６Ｒ转座子插人位置有２个基因操纵子ｉｒａＡＢ， 第１开放阅读框架（ＯＲＦ）ｉｒａＡ编码２７２个氨基酸蛋 白，类似转甲基酶序列；第２ ＯＲＦ ｉｒａＢ编码５０１个氨 基酸蛋白，类似原核生物和真核生物的２一，３．肽运载 蛋白。ｉｒａＡＢ基因座大多限于嗜肺军团菌和其他致 病性军团菌中。ｉｒａＡ与嗜肺军团菌的毒力有关，是 细胞内感染所必需；而ｉｒａＢ基因编码推定为肽运载 蛋白，可以促进铁的摄取。铁是嗜肺军团菌毒力和 细胞内生长所必需 ６，７ Ｊ。嗜肺军团菌产生各种毒力 因子，包括外膜孔蛋白，巨噬细胞感染增强蛋白（又 称ｍｉｐ蛋白），Ⅱ型、Ⅳ型分泌系统，Ⅳ型菌毛蛋白 （ｐｉｌｉ），鞭毛，过氧化氢酶．过氧化物酶，以及众多的 族氨基酸和合适的生态环境。嗜肺军团菌变种的其 他５种毒力基因：ｄ０ｔＢ、ｄｏｔＦ／ｉｃｍＧ、ｄｏｔ０／ｉｃｍＢ、ｉｃｍＸ 和ｐｒｏＡ，这些毒力基因负责非巨噬细胞相关毒力， 可用信号标记技术测定肺部病原体 Ｊ。 二、毒力因子与致病机制 军团菌在单核一吞噬细胞的吞噬体内繁殖而不 被多核白细胞杀死，其致病性与其产生的毒力以及 铁的摄取和利用有关。军团菌产生的两种因子能抑 制吞噬细胞的活性：其一是军团菌的细胞毒素阻碍 中性粒细胞氧化代谢；其二是菌细胞中所含的磷酸 脂酶阻碍刺激中性粒细胞超氧化物阴离子产物，使 中性粒细胞内第２信使编排陷于混乱。细胞毒素和 磷酸脂酶是促进军团菌侵袭细胞或在细胞内生存和 繁殖的两种毒力因子Ｅ５ Ｊ。嗜肺军团菌Ⅱ型蛋白分泌 的ｐｉｌＤ因子，是一种前菌毛蛋白肽酶，可促进细菌 对人体的感染；Ⅳ型分泌系统、小孔形成毒素、Ⅳ型 ２５ ｄｏｔ、ｉｃｍ、ｅｒｒｄ、ｍｉｌ、ｐｍｉ基因座Ｅ ６ｌ。嗜肺军团菌的ｋａｔＢ 过氧化氢酶一过氧化物酶基因编码与大肠埃希菌（简 称大肠杆菌）的ｋａｔＧ过氧化氢酶一过氧化物酶相类 似，在细菌对数生长期起抗过氧化氢作用，延缓感染 维普资讯 http://www.cqvip.com 菌毛、鞭毛和其他众多的毒力因子促进了嗜肺军团 菌的毒力Ⅲｊ。此外，嗜肺军团菌被巨噬细胞摄取 后，吸附在Ｃ３ｂｉ表面，然后与靶细胞ＣＲ３受体结合。 胞内菌进人宿主细胞需要侵袭素启动细胞内吞作 用，然后侵袭素与整合素分子结合，诱发吞噬机制。 被吞噬菌在宿主细胞溶酶体内生存和繁殖，经６～８ ｈ的迟缓期和１８ ｈ的对数生长期，滤泡中的溶酶体 相关膜蛋白（ＬＡＭＰ一１）和组织蛋白酶Ｄ抑制了吞噬 体内滤泡的酸化作用和成熟。细菌在溶酶体内大量 繁殖，直至巨噬细胞溶解，子代成批释放，再侵人新 的巨噬细胞ｕ 。嗜肺军团菌侵人人肺部，通过主要 外膜蛋白（ＭＯＭＰ）、补体Ｃ３ｂ和ｉＣ３ｂ以及其他相应 受体的中介作用进人肺泡巨噬细胞。在吞噬细胞中 含有军团菌的吞噬体和溶酶体的融合被阻止，细菌 在巨噬细胞内生存和繁殖。在嗜肺军团菌的各种毒 力因子中，脂多糖（ＬＰＳ）是重要的免疫显性抗原和 血清分型的基础。由于嗜肺军团菌ＬＰＳ异常的化学 结构，可以适合各种环境的变化。嗜肺军团菌ＬＰＳ 不同于其他革兰阴性杆菌，它的脂质Ａ部分是由长 链脂肪酸组成，可能是弱内毒素分子。Ｏ特异性链 是由ａ一（２＿４）互连５一乙脒一７一乙酰氨一８—０一乙酰基３，５， ７，９—４脱氧一Ｉ厂甘油一Ｄ一半乳糖一军团氨酸同聚体组成。 这种与众不同的糖分子完全缺乏游离ＯＨ基团，因 此非常疏水。此外，军团氨酸的异构体假定是ＬＰＳ— Ｏ链的末端糖，使嗜肺军团菌持有疏水细胞表面，可 支持细菌在气溶胶中的浓度，以便粘附到宿主细胞 上。嗜肺军团菌的毒力因子、鞭毛和菌毛的表达，有 助于细菌对宿主细胞的粘附，某些基因如ｍｉｐ、ｄｏｔ、 ｉｃｍ等可增强细菌在宿主细胞内生存和繁殖［ Ｊ。嗜 肺军团菌的毒力和致病性与铁代谢有关，在低铁化 学合成培养基（ＣＤＭ）中需氧生长时，能分泌一种非 蛋白质而具有高度亲和力的铁螯合物，后者能与铬 天青Ｓ染料（ＣＡＳ）产生反应。嗜肺军团菌的铁载体 同类活性只有在ＣＤＭ培养基或缓冲酵母浸液中，接 种高浓度细菌培养过夜，在对数生长期或早期才能 获得。嗜肺军团菌的ＣＡＳ反应物耐受煮沸和蛋白 酶处理，不是一种典型的邻苯二酚和羟胺军团菌铁 载体，可能是一种新的结构，是嗜肺军团菌铁载体军 团菌素。铁是嗜肺军团菌细胞外繁殖、细胞内感染 和毒力要求的关键。已知其蛋白编码与羟胺合成酶 非常类似，嗜肺军团菌铁调节基因是嗜肺军团菌合 成的铁载体。此基因使嗜肺军团菌在细胞内生长受 阻，但不影响细胞外生长，推定铁载体的功能只在宿 主细胞内。关于军团菌素的产生受特殊方式调节， ２６ 多数军团菌在细菌开始生长的对数期和较早期，而 不是在后期获得军团菌素。军团菌分泌的ＧＡＳ反 应物是军团菌素，军团菌素的发现证实军团菌像其 他许多细菌一样，铁的同化作用有多种机制。铁载 体的产生受铁的作用等多种因素的影响。军团菌利 用血色素同化作用、铁负载肽、细胞质和外周质还原 酶、运铁蛋白降解酶、含铁色素和ＡＢＣ运载蛋白产 生铁载体。铁载体对于嗜肺军团菌的毒性具有重要 意义［１３ｊ。 三、实验室诊断 嗜肺军团菌是引起流行性、散发性和医院内获 得性肺炎的重要病原体。近来的研究发现，嗜肺军 团菌可引起肺外其他器官如心脏、肾脏、肝脏、胃肠 道和中枢神经系统功能障碍等疾病，还可引起窦炎、 蜂窝织炎、胰腺炎、腹膜炎、肾盂肾炎、肝炎和类风湿 关节炎等。关于嗜肺军团菌病的实验室诊断常用的 有细菌培养、直接荧光抗体染色、军团菌尿抗原测定 和ＰＣＲ试验等多种方法ｌｌ ｌｌ 。 １．细菌培养 细菌培养是嗜肺军团菌检测的 金标准。培养军团菌要求特殊培养基，常用的培养 基是含有缓冲碳末酵母浸膏和ａ一酮戊二酸、 一半胱 氨酸以及抗生素的ＢＣＹＥａ和ＢＭＰＡ选择性培养基。 标本预先经酸和加热处理，能提高细菌分离阳性率。 从临床标本中分离嗜肺军团菌，作为军团病的早诊 诊断是最敏感的方法。培养基中铁含量对军团菌毒 力研究具有重要意义ｌ６ Ｊ。近来有用细胞培养和阿米 巴培养检测嗜肺军团菌的报告，Ｓｃｏｌａ等应用 ＥＣＶ３０４和ＨＥＬ细胞株，离心沉淀／Ｉ，－ｆＬ细胞培养法， 从肝和肺脓肿组织中分离出嗜肺军团菌血清工型。 Ｐｏｌｅｓｋｙ等应用阿米巴细胞培养法，进行嗜肺军团菌 变种及其毒力的研究，并从慢性白血病患者中分离 出茴香军团菌（Ｌ．ａｒｄｓａ）ｌｌ ６＿。细菌培养法作为检测 嗜肺军团菌的金标准，对疾病的早期诊断，具有良好 的敏感性和特异性，但需特殊培养基，价格昂贵，并 且要３～５ｄ才能形成小菌落，费时，是其不足之处。 但对嗜肺军团菌生物学特性、毒力、耐药性、基因分 型等方面的研究，具有重要意义。 ２．免疫血清学方法常用酶免疫法（ＥＩＡ）或间 接免疫荧光法（ＩＤＦＡ）检测病人血清中嗜肺军团菌 抗体Ｉ ，具有简便、快速之优点，对疾病的早期诊 断有较大的参考价值，但敏感性较培养法低。采用 单克隆抗体检测病人血清中嗜肺军团菌抗原，能提 高阳性检出率。用ＥＬＩＳＡ检测病人血清中ＩｇＧ总抗 体，可作为嗜肺军团菌疾病的流行病学回顾性调查， 维普资讯 http://www.cqvip.com 且具有重要意义 。 ５．ＤｏＭｉｎｇ．ＩＮ，Ｓａｈａ ＡＫ ａｎｄ Ｇｌｅｗ ＲＨ．ＭＭＢＲ，１９９２； ３．尿抗原检测 检测尿中嗜肺军团菌抗原是 一５６（１）：３２～６０ ６．Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ ＶＫ，Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ ＰＨ，Ｐｏｐｅ ＣＤ，ｅｔ ａ１．Ｉｎ— 种廉价、快速的诊断试马佥Ｌ１５ Ｊ。常用的有放射免疫 法（ＲＩＡ）、ＥＩＡ、直接荧光抗体法（ＤＦＡ）、免疫层析法 ｆｅｅｔ［ｎｌＩｎｕｎ，２０００；６８（３）：１０６９～ｌｏ７９ ７．ＰｏＤｅ ＣＤ，Ｏ Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｗ ａｎｄ Ｃｉａｎｃｉｏｔｔｏ ＮＰ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍ— （ＩＣＡ）等多种方法＿１ 。敏感性达７０％，特异性接近 １００％。如尿液经超滤法浓缩处理，敏感性可提高到 ８０．４％；而且尿中嗜肺军团菌抗原可存在１年，因 此，检测尿中嗜肺军团菌抗原具有简便、快速、特异 之优点，可作为临床常规诊断军团病的一种试验方 法。 ｍｔｌｎ，１９９６；６４（２）：６３６～６３９ ８．Ｒｏｂｅｙ Ｍ．Ｏ Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｗ ａｎｄ Ｃｉａｎｃｉｏｔｔｏ ＮＰ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍ— ｍｔｌｎ，２００ｌ；６８（７）：４２７６～４２８６ ９．Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ ＰＨ，Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ ＭＡＣ，Ｈｉｇａ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｍｉｅｒｏ— ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９；９６（１４）：８１９０～８１９５ １０．Ｓｗａｎｓｏｎ ＭＳ ａｎｄ Ｈ，Ｂｉｎｎｌｅｒ ＢＫ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１． ４．ＰＣＲ检测法 应用分子生物学ＰＣＲ基因诊 断技术，用于检测尿液、支气管肺泡液、血液和痰液 ２０００；５４（１）：５６７～６１３ 等临床标本中的嗜肺军团菌ＤＮＡ基因。特异性较 高，但敏感性不如培养法，因为痰和某些血液标本中 ｌ１．Ｓｔｕ晒ｌｌ－Ｋｏｓｚｙｅｋｉ Ｓ ａｎｄ Ｓｗａｎｓｏｎ ＭＳ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， ２０００；１９２（９）：１２６１～１２７２ １２．Ｌｕｎｅｂｅｒｇ Ｅ，Ｚａｈｒｉｎｇｅｒ Ｕ，Ｋｎｉｒｅｌ ＹＡ。ｅｔ ａ１．Ｊ Ｅｘｐ 存在抑制ＰＣＲ的物质，影响试验的敏感性。近年 来，应用荧光实时ＰＣＲ（ＶＱ—ＰＣＲ）和发光一ＰＣＲ（ＬＴ－ ＰＣＲ），以及ＰＣＲ与ＤＮＡ探针杂交技术相结合 加ｌ， Ｍｅｄ，１９９８；１８８（１）：４９～６０ １３．Ｌｉｌｅｓ ＭＲ．Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ ＶＫ ａｎｄ Ｃｉａｎｃｉｏｔｔｏ ＮＰ．Ｊ Ｂａｅ— 检测各种临床标本中嗜肺军团菌，大大地提高了试 验的敏感性和特异性，可检出２．５～１ ０００ ＣＦＵ／ｍｌ标 本中的军团菌，整个试验可在９０ ｍｉｎ内完成。ＰＣＲ ｔｅｒｉａｌ，２０００；ｌ８２（３）：７４９～７５７ ｌ４．Ｓｚｅｎａｓｉ Ｚ，Ｅｎｄ０ Ｔ，Ｙａｇｉｔａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｏｅｖ Ｈｅｔｉｌ，２００１； １４２（２０）：１０３５～ｌ０４３ １５．Ｓｔｏｕｔ ＪＥ ａｎｄ Ｙｕ Ｖ Ｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９７；３３７ （１０）：６８２～６８７ １６．Ｓｅｏｌａ ＢＬ，Ｍｉｃｈｅｌ Ｇ，Ｒａｏｕｌｔ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏ —技术与探针杂交、ＤＮＡ序列分析相结合，不仅可作 为嗜肺军团菌疾病的临床常规诊断，更重要的是可 用于军团菌毒力基因检测、军团菌新变种鉴定、对军 团菌病发病机制的研究等具有重大的实用价值。 参考 文 献 ｂｉｏｌ，１９９９；３７（３）：７８５～７８７ １７．Ｂａｚｏｖｓｋａ Ｓ，Ｓｐｚｉｅｋｏｖａ Ｍ，Ｋｍｅｔｙ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ［ｎｌＩｎｕｎｏｌ，ｌ９９８；４７（４）：１４１～１４４ １．Ｂｅｌｙｉ Ｙ．Ｉｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９；２（３）：１４５～１５４ ２．Ｂｅｎｓｏｎ ＲＦ ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｓ ＢＳ．Ｓｅｍｉｎ Ｒｅｓｐｉｒ Ｉｎｆｅｃｔ， １８．Ｈｅｌｂｉｇ ＪＨ，Ｕｌｄｕｍ ＳＡ，Ｌｕｃｋ ＰＣ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏ— ｂｉｏｌ，２００ｌ；５０（６）：５ｏ９～５ｌ６ １９．Ｒａｎｔａｋｏｋｋｏ—Ｊａｌａｖａ Ｋ ａｎｄ Ｊａｌａｖａ Ｊ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＿ １９９８；１３（２）：９０～９９ ３．Ｃｌｏｕｄ ＪＬ，Ｃａｒｒｏｌｌ ＫＣ，Ｐｉｘｔｏｎ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏ— ２００ｌ；３９（８）：２９０４～２９１０ ｂｉｏｌ，２０００；３８（５）：１７０９～１７１２ ４．Ｂｒｅｉｍａｎ ＲＦ ａｎｄ Ｂｕｔｌｅｒ ＪＣ．Ｓｅｍｉｎ Ｒｅｓｐｉｒ Ｉｎｆｅｃｔ， ２０．Ｈａｙｄｅｎ ＲＴ，Ｕｈｌ ＪＲ，ＱｉａＪ１ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏ —ｂｉｏｌ，２００ｌ；３９（７）：２６１８～２６２６ （２００１年ｌ１月２３ Ｉｔ收稿；２００２年４月１６日修刚） １９９８；１３（２）：８４～８９ （上接第８页） ４．Ｈｏｒｌｉｎｇ Ｊ ａｎｄ Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ Ａ．Ｖｉｅｓｒ Ｒｅｓ，１９９７；４８（１）： ８９～ｌ００ １９９４；６８（５）：３０００～３００６ ８．Ｐａｒｋ ＪＭ，Ｃｈｏ ＳＹ，Ｈｗａｎｇ ＹＫ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏ１． ２０００；６０（２）：１８９～１９９ ９．Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ Ｔ，Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ Ａ，Ｓｏｌｉｙｍａｎｉ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｖｉ— ５．Ｅｎｎｉｓ ＦＡ，Ｃｒｕｚ Ｊ，ＳＰｉｒｏｐｏｕｌｏｕ ＣＦ，ｅｔ ａ１．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． １９９７；２３８（２）：３８０～３９０ ６．Ｅ１ｇｈ Ｆ，Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ Ａ，Ａｌｅｘｅｙｅｒ ＯＡ．Ｊ Ｖｉｍｌ Ｍｅ— ｒｏｌｏｇｙ，１９９９；２６２（２）：３２１～３３２ １０．Ｖａｎ Ｅｐｐｓ ＨＬ，Ｓｅｈｍａｌｊｏｈｎ ＣＳ，Ｅｎｎｉｓ ＦＡ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｖｉｒｏ１．１９９９；７３（７）：５３０１～５３０８ （２０００年ｌＯ月８ Ｅｔ收稿；２０００年ｌ１月２２ Ｅｔ修回） ｔｈｏｄｓ，１９９６；５９（１—２）：１６１～１７２ ７．Ｊｅｎｉｓｏｎ Ｓ，Ｙａｍａｄａ Ｔ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ２７
