一株产木聚糖酶菌固体发酵条件的优化

一株产木聚糖酶菌固体发酵条件的优化

吾尔恩·阿合别尔迪

1,2

，张 云，刘东波

11*

（1.东北师范大学 生命科学学院微生物实验室，吉林 长春 130024；

2.伊犁师范学院 化学与生物科学学院， 伊宁 835000）

摘 要：采用单因素试验设计对黑曲霉发酵产木聚糖酶的条件进行了研究，并探讨了黑曲霉发酵的产酶模式. 以麸皮和玉米芯质量比7︰3混合后作为碳源，含0.15%的硫酸铵为无机氮源，物料与水分的比为1︰1.5，培养温度28～30℃，培养基起始pH值为4.8，接种量为4%（107个/mL），外加吐温-20±0.05%，发酵时间为72h，用10倍培养基的自来水，40℃摇床浸提1h，木聚糖酶活可达650.45U，为木聚糖酶固体发酵的工业化生产和应用提供参考.

关键词：黑曲霉；固体发酵；木聚糖酶

中图分类号：Q93 文献标识码：A 文章编号：1673—999X（2011）01—0040—05

构成绿色植物细胞壁主要成分的纤维素，被认

[1]

为是世界上最丰富的可再生资源. 如何对其进行充分利用，对缓解全球能源危机、食品和饲料资源紧张以及环境污染有着重大意义. 自然界当中能分解纤维素的生物主要为真菌类及部分细菌，以木霉、曲霉、青霉的能力最为突出[2,3]. 木聚糖是一类重要的半纤维素，木聚糖酶是一类重要的半纤维素酶，木聚糖酶（1,4-β-D-xylan xylanohydrolase）以内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4-木糖苷键. 微生物所产生的木聚糖水解酶可降解木聚糖为寡聚木糖、木糖和少量其他单糖. 由于绝大部分纤维素类、半纤维素类物质是在固体状态下被微生物降解的，所以，从固态发酵研究纤维素的降解更具有代表性. 本文对具有较高产酶能力的黑曲霉SB-02固体发酵条件进行了优化探索.

酵培养基：取新鲜麸皮10g加入到250mL三角瓶中，再加入10mL蒸馏水，搅拌均匀，高压灭菌后待用.

2 实验方法

2.1 孢子悬液的制备

用适量无菌水将菌株新鲜斜面菌种的孢子冲洗下来，并用玻璃珠打散摇匀，制成浓度为107 个/mL的孢子悬液. 2.2 培养条件

固体发酵培养基灭菌后接入1mL孢子悬液，搅拌均匀，28℃恒温培养72h，保持一定的湿度.

[4]

2.3 固体发酵酶液的制备

将培养后的固体曲霉加入10倍的生理盐水，置40℃摇床，120r/min震荡培养1h，尼龙纱布过滤后，12000r/min，4℃离心20min除去孢子，经适当稀释后测定酶活.

2.4 木聚糖酶活力测定

将制成的孢子悬液按5%的接种量接种于液体发酵培养基中，28℃，120r/min摇床培养72h，四层纱布过滤，4℃，12000r/min离心15min，取上清

，

液，适当稀释后初步测定木聚糖酶的酶活力[56]. 2.5 不同氮源对产酶的影响

1 实验材料

1.1 菌种

黑曲霉SB-02是东北师范大学生命科学学院微生物教研室保存菌种. 1.2 培养基

斜面种子培养基；PDA培养基；三角瓶固体发

收稿日期：2010—07—13

作者简介：吾尔恩・阿合别尔迪（1979—），男，在读硕士研究生，研究方向：微生物学；*通讯作者：刘东波.

第1期 吾尔恩・阿合别尔迪等：一株产木聚糖酶菌固体发酵条件的优化 41 分别用单一有机和无机氮源进行产酶实验，有机氮源为0.2%牛肉膏，0.2%蛋白胨，0.4%酵母粉；无机氮源为0.15% (NH4)2SO4，0.25%NaNO3，0.1%NH4NO3，0.15%NH4Cl（以含氮元素量为准），28℃培养72h后，浸提发酵酶液，适当稀释后测定酶活.

2.6 不同碳源对产酶的影响

将麸皮、玉米芯、玉米秸秆、气爆秸秆用小型粉碎机粉碎，过20目筛，分别作为唯一碳源进行固态发酵. 以麸皮和玉米芯7︰3的比例混合作为混合碳源研究其对产酶的影响，同时研究麸皮和玉米芯的不同配比对产酶的影响. 在250mL三角瓶中装10g固态培养基，28℃恒温培养箱培养72h，制备固体发酵酶液，适当稀释后测定酶活. 2.7 不同起始pH值对产酶的影响

用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液将培养基初始pH分别调成2.8，3.8，4.8，5.8，6.8，7.8，研究6个不同起始pH对菌株产酶的影响. 2.8 不同培养时间对产酶的影响

将新制备的孢子悬液（107个/mL），以10%的接种量接入灭菌后的基础固态发酵培养基中，28℃恒温培养，从第24h开始，每隔12h取一次样，连续取9次，浸提固体发酵液，适当稀释后测定酶活. 2.9 不同培养温度对产酶的影响

将接种后的培养基分别置于24℃，26℃，28℃，30℃，32℃，34℃，36℃恒温培养72h，浸提固体发酵液，适当稀释后测定酶活. 2.10 无机盐对产酶的影响

在固态基础发酵培养中分别添加0.5％的NaCl，K2HPO4，MgSO4，CaCl2，(NH4)2SO4 五种无机盐，接种后置于28℃恒温培养箱，培养72h，浸提后测定酶活.

2.11 葡萄糖添加量对产酶的影响

在固态基础发酵培养基中分别添加不同量的葡萄糖（0.3g，0.6g，1g，1.3g，1.5g），研究葡萄糖的添加量对产酶的影响. 2.12 起始水分对产酶的影响

在10g新鲜麸皮中分别加入5mL，10mL，15mL，20mL，25mL的自来水，10％接种量接种后于28℃恒温培养箱，培养72h，浸提后测定酶活. 2.13 不同的接种量对产酶的影响

在10g固态基础发酵培养基（250mL三角瓶）中，分别按0.5mL，1mL，2mL，4mL，6mL接种量接种，置于28℃恒温培养箱，培养72h，浸提后

测定酶活.

2.14 不同浸提剂对浸提效果的影响

分别用100mL的蒸馏水，自来水，生理盐水，pH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液加入培养72h的固态发酵培养基中，置40℃摇床，120r/min震荡培养1h，尼龙纱布过滤后，12000r/min，4℃离心20min除去孢子，经适当稀释后测定酶活，研究四种不同浸提剂对木聚糖酶浸提效果的影响.

2.15 表面活性剂吐温-20对产酶的影响

向固态基础发酵基中分别添加0.05%，0.1%，0.15%的吐温-20试剂，发酵72h后，过滤浸提发酵液，适当稀释后测定酶活.

3 结果与分析

3.1 不同培养条件对产酶的影响 3.1.1 不同碳源对产酶的影响

实验结果表明（见图1），用气爆玉米秸秆作为唯一碳源时，测得的木聚糖酶酶活最高，用玉米皮作为唯一碳源时，黑曲霉不生长. 气爆秸秆的结构疏松，有利于菌体生长和对底物木聚糖的摄取. 在麸皮和玉米芯以不同比例的混合碳源中，混合比例为7︰3时，木聚糖酶的酶活达到最高，因此选用麸皮和玉米芯7︰3混合后作为碳源进行产酶实验（见表1）. 麸皮中富含多糖、蛋白质、维生素和矿物质等常用的培养基成分，它既是碳源又是氮源，还含有某些对微生物生长和产酶起促进作用的因子. 但麸皮过多，培养基粘性增大，不利于透气，影响生产规模和产量；而玉米芯含有丰富的木聚糖，又能增加培养基孔隙，但玉米芯过多，菌丝生

～

长慢，酶活低[710].

200150酶活力(U) 麸皮气爆秸秆 玉米芯 玉米秸秆10050012碳源 3 4 图 1 不同碳源对产酶的影响

3.1.2 不同氮源对产酶的影响

在基础发酵培养基中添加0.15%的硫酸铵时酶活最高，其次是0.15%的氯化铵，两者差异不大. 铵盐作为氮源较易被微生物吸收利用，虽然使用无机氮源时，生长不如有机氮源旺盛，但酶活力较高，

42 伊犁师范学院学报（自然科学版） 2011年 因此应选用硫酸铵作为发酵培养基的最佳氮源（见表2）.

3.1.3 不同起始pH值对产酶的影响

pH通过影响细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率. 由图2可以看出，黑曲霉耐酸性比较强，最适pH值在4.8～5.0. 3.1.4 最佳产酶时间的确定

当培养时间为72h时，黑曲霉处于生长稳定期，酶活力最高，因此最佳产酶时间为72h（见图3）.

3.1.5 不同培养温度对产酶的影响

由图4可以看出，温度明显影响酶的产量. 24℃下，菌体生长缓慢，产酶量较少，而过高温度，菌体虽然生长较快，但容易衰老，再加上快速分解代谢产生的热量使中后期培养料温度进一步升高，产酶量下降，适合产酶的最佳温度为30℃. 3.1.6 葡萄糖的添加量对产酶的影响

在基础培养基中添加葡萄糖对产酶有抑制作用，用量越大，抑制作用越强（见图5）.

6︰4 255.885

3︰7 230.635

2︰8 198.431

1︰9 180.231

表 1 麸皮和玉米芯的比例对产酶的影响

麸皮︰玉米芯 酶活力U

9︰1 260.319

8︰2 271.445

7︰3 286.743

表 2 不同氮源对产酶的影响

氮源 酶活力U 氯化铵 铵 钠 硫酸铵 酵母粉 蛋白胨 牛肉膏 227.911 219.382 200.284 231.81 211.224 202.138 213.634 450400酶活力(U)350300250200150100500012243860728496108120132培养时间（h)

图 2 起始pH值对产酶的影响 图 3 培养时间对产酶的影响

图 4 不同培养温度对产酶的影响 图 5 葡萄糖的添加对产酶的影响

3.1.7 起始水分对产酶的影响

水分的高低会影响到基质的透气性和菌丝生长状况，也会影响到代谢活动和目的产物的合成. 高于最佳水分含量，将使麸皮的多孔性降低，微粒结构改变，氧气输送量减少；而低于最佳水分含量将导致固态底物中营养物质的可溶性下降，而微生物也得不到足够的水分进行生长产酶[11]. 由实验结果可以看出，当固体料的质量与添加水分的体积比

第1期 吾尔恩・阿合别尔迪等：一株产木聚糖酶菌固体发酵条件的优化 43 为1︰1.5时酶活最高，黑曲霉的生长也最旺盛. 因此发酵培养基的料水之比选用1︰1.5（见图6）. 3.1.8 接种量对产酶的影响

由实验结果可以看出，当培养基的接种量为4%，即每10g麸皮中接0.4mL（107 个/mL）孢子液，发酵产生的酶活最高（见图7）. 3.1.9 不同浸提剂对酶浸提效果的影响

由图8可以看出，在四种不同的浸提剂中，自来水的浸提效果最好，其次是生理盐水，蒸馏水和醋酸-醋酸钠的效果最差. 由于自来水获取方便，成本低，并且浸提效果最好，因此发酵产生的酶用自来水来浸提.

3.1.10 吐温-20对产酶的影响

250200酶活力（U)150100500051015培养基初始水分20253吐温-20是一种非离子型表面活性剂，可以增加细胞的通透性，增加产酶量，考虑到生产成本和产量，我们选用0.05%的添加量（见表3）. 3.2 固体发酵的产酶过程

在上述实验基础上，采用合适的营养和培养条件进行产酶实验. 每隔12h取样，测定木聚糖酶的酶活力，得到培养时间与酶活力关系曲线，培养24h左右，物料表面可见零星白色菌丝，此时酶活较低；36h时，物料表面布满白色菌丝，之后菌丝分化产生分生孢子，颜色逐渐加深，由浅黄、墨绿到黑褐色. 在72h时，全部物料变为黑褐色，此时酶活力达到最高值650.45U.

700600500酶活力(U)400300200100001234567接种量(%)

350340330320310300290280270自来水 蒸馏水 生理盐水 缓冲液 图6 培养基初始水分对产酶的影响 图7 不同的接种量对产酶的影响

表3 吐温-20对产酶的影响

图 8 不同的浸提剂对酶浸提效果的影响

处理方法 酶活力（U）

空白

0.05% 0.1%0.15%403.8

356. 435.87 438.6

4 结论

对黑曲霉SB-02菌株进行固态发酵培养条件的

研究，结果表明：以麸皮和玉米芯质量比7︰3混合后作为碳源，以0.15%的硫酸铵为无机氮源，物料与水分的比为1︰1.5；培养温度28～30℃；培养基起始pH值为4.8，接种量为4%（107个/mL），外加吐温-20±0.05%，发酵时间为72h，用10倍培养基的自来水，40℃摇床浸提1h，得到的木聚糖酶

活最高，为650.45U. 参考文献：

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Study on Optimum Conditions of Aspergillus Niger SB-02 Solid State Fermentation to Produce Xylanase

Oren Akhberdy1,2, ZHANG Yun1, LIU Dong-bo1

(1. School of Life Sciences, Northeast Normal University, Changchun, Jilin 130024, China; 2. College of Chemistry & Biological Sciences, Yili Normal University, Yining, Xinjiang 835000, China)

Abstract: Fermentation condition for Aspergillus niger to produce xylanase was determined by single factor experiment, and enzyme-producing model was studied. Set the bran and corn-cob mass ratio 7:3 as a mixture carbon source; the inorganic nitrogen source is ammonium sulfate (0.15%)，the ratio of the materials and the water is 1:1.5, the appropriate culture temperature is range form 28 to 30 centigrade，the initial pH is 4.8, the appropriate inoculation is 4% (107/mL), the content of Tween-20 is 0.05%，the liquid fermentation time is 72 hours，10 times the medium of water，40 centigrade extracted for 1 hour, the xylanase is up to 650.45 U. This paper provides some theoretical bases for the industrial production and application of xylanase.

Key words: Aspergillus Niger; solid state fermentation; Xylanase