高效液相色谱法分析和制备黄芪中的黄芪甲苷含量
张文敬;张倩;张涛;穆祥;胡格
【摘 要】[目的]本试验利用高效液相色谱法分析和制备黄芪水煎液中的黄芪甲苷并通过质谱对收集到的组分进行鉴定.[方法]分析型色谱条件为色谱柱为EcliPseXDB-C18 (150 mm×4.6 mm,5 μm)柱,流动相为乙腈-水,梯度洗脱,柱温25℃,流速0.8 mL/min,检测波长254 nm,进样量20μL.制备型色谱条件为色谱柱为Hypersil C18(20 mm×300 mm,10μm)柱,流速10 mL/min,进样量2 mL,其他同分析型色谱.质谱分析法为电喷雾离子化(electrospray ionization,ESI)源,源电压3.5 kV,正、负离子检测,鞘气(N2)流速80a.u.,辅助气(N2)流速15 a.u.,碰撞气体为氦气,毛细管温度350℃,毛细管电压±5V.采用全离子扫描方式,扫描范围50～2 000 m/z.[结果]经分析型色谱得标准曲线回归方程为A=0.1717 C+0.4657,r=0.9996,在0.01～0.2 mg/mL范围内线性关系良好.制备型色谱方法得到的峰型较好,峰间隔适当,能够将相邻组分分离.收集保留时间为26 min的组分,经分析型色谱和ESI-MSn鉴定该组分为黄芪皂甙Ⅳ (astragaloside Ⅳ),即黄芪甲苷,且纯度可达95％.[结论]该方法精密度高、稳定性可靠、重现性好、加样回收率高,收集到的成分准确,纯度高,适用于黄芪中黄芪甲苷的分析和制备. 【期刊名称】《北京农学院学报》 【年(卷),期】2016(031)003 【总页数】6页(P80-85)
【关键词】黄芪;黄芪甲苷;高效液相色谱法 【作 者】张文敬;张倩;张涛;穆祥;胡格
【作者单位】北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室,102206北京;北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室,102206北京;北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室,102206北京;北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室,102206北京;北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室,102206北京 【正文语种】中 文 【中图分类】R284.1
中药黄芪(Radix Astragali)是豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄芪的干燥根，味甘性微温，具有益气固表，补气养血，利水消肿，脱毒，敛疮生肌等功效[1]。研究表明，黄芪具有增强免疫力、促进机体cAMP代谢、改善心功能、降压、保肝、调节血糖、抗菌及抑制病毒等多种药理作用。
黄芪作为传统中药，在中药的配伍及保健品中使用非常频繁，由此生产的中草药及保健食品非常丰富。黄芪的化学成分复杂，主要含皂苷类、黄酮类、多糖类以及氨基酸类等[2,3]。黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一，也是黄芪总苷的主要成分[4]，其结构式如图1所示。黄芪总皂苷的含量是以黄芪甲苷为标准品测定。迄今为止，有关测定黄芪甲苷的方法有薄层扫描法、比色法等，其中薄层扫描法已载入药典[1]。在实际试验中发现，上述分析制备方法预处理步骤较多，受试验软硬件的影响大，重现性差。本试验建立适合于测定黄芪水煎液中黄芪甲苷含量的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)。该方法精密度高、稳定性强、重现性好。 1.1 仪器和试剂
分析型HPLC(Waters2695高效液相色谱系统，Waters2998 二极管阵列检测器，
Empower工作站)，制备型HPLC(Varian Prep Model 215型泵，Alltech uvis 200型检测器)，四极杆质谱仪(G1956B)。
乙腈、甲醇为色谱纯(购自德国Merck公司)，甲酸、冰醋酸为分析纯(购自北京化工厂)，膜荚黄芪(购自北京同仁堂药店)，黄芪甲苷对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号0781-200311)。 1.2 方 法
1.2.1 色谱条件 分析型色谱条件：色谱柱，EcliPseXDB-C18：(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相，乙睛(A)-水(D)梯度洗脱：0 min(5% A)、5 min(10% A)、20 min(30% A)、30 min (40% A)、43 min(40% A)、60 min(100% A)、65 min(100% A)；柱温，25 ℃；流速，0.8 mL/min；检测波长，254 nm，进样量20 μL。制备型色谱条件：Hypersil C18柱(20 mm×300 mm，10 μm)；流动相，乙睛(A)-水(D)，梯度洗脱，同分析型色谱条件；流速，10 mL/min；检测波长，254 nm；进样量2 mL。
1.2.2 质谱条件 电喷雾离子化(electrospray ionization , ESI)源；源电压3.5 kV；正、负离子检测；鞘气(N2)流速80 a.u.；辅助气(N2)流速15 a.u.；碰撞气体为氦气；毛细管温度350 ℃；毛细管电压±5 V。采用全离子扫描方式，扫描范围50～2 000 m/z。
1.2.3 溶液的配制 对照品溶液制备：精密称取10.03 mg 黄芪甲苷标准品，用色谱纯甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，分别精密吸取0.5、1.5、2.5、5、10 mL 用甲醇稀释并定容于10 mL容量瓶中，用0.22 μm微孔滤膜过滤后进样20 μL，以1.2.1的色谱条件进行测定。以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，取得工作曲线。再进行相关的精密度、稳定性、重现性和加样回收率试验，最后依据回归方程式计算出样品溶液中黄芪甲苷的平均含量。
黄芪水煎液的制备：称取膜荚黄芪50 g加蒸馏水煎煮2次，第1次加10倍量的
水，煎煮1.5 h，16层纱布过滤药渣再加8倍量的蒸馏水煮沸1 h、过滤，合并2次滤液，放冷后加入无水乙醇至乙醇终浓度为75%，密闭置4 ℃冰箱静置24 h后取上清液减压浓缩至稠膏状，回收乙醇，膏液于70 ℃鼓风干燥箱中干燥至恒重得黄芪浸膏。称取适量黄芪浸膏溶于超纯水，混匀制成1.00 g/mL的黄芪溶液，4 ℃保存备用。
2.1 膜荚黄芪中黄芪甲苷含量的测定
2.1.1 系统适用性分析 取供试品溶液，在1.2.1 色谱条件下进样分析，如图2所示， 黄芪水煎液测试品各主要峰与相邻峰分离效果较好，可用于单一成分的分离。
2.1.2 线性关系考察 取配制的对照品溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进样20 μL，在1.2.1 色谱条件下测定。以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线：得到的回归方程为A = 0.171 7 C+0.465 7， r = 0.9996 ，在0.01～0.20 mg/mL范 围内线性关系良好。
2.1.3 HPLC精密度试验 取黄芪甲苷对照品溶液，制备供试品溶液，在1 d 之内连续进行HPLC测定6次，每次进样体积为10 μL，采集其色谱图，考查色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，峰面积RSD为1.13% (n=6)，符合指纹图谱技术要求(RSD均在3以内)，表明仪器具有良好的精密度。
2.1.4 HPLC重复性试验 称取同一批黄芪药材6份，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进行HPLC测定，进样体积为10 μL，采集其色谱图，测定相应的峰面积，计算黄芪甲苷平均质量分数为1.35 mg/g ，RSD= 1.26%，样品和仪器的重现性良好(n= 6)。
2.1.5 HPLC稳定性试验 取黄芪甲苷对照品溶液，分别在0，6，12，18，24 h时间间隔内进行HPLC测定，进样体积为10 μL，采集其色谱图，计算黄芪甲苷峰
面积RSD为 2.45%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定(n=6)。
2.1.6 加样回收率试验 取5 g已测定黄芪甲苷含量的生药提取水煎液平均分成10份，取6份，再分别准确加入1.447 mg/mL的黄芪甲苷对照品溶液0.50 mL，按1.2.1 色谱条件测定，结果见表1(n=6)。
2.1.7 样品含量的测定 依1.2.1 色谱条件，取样品溶液同法进行试验，测出峰面积，依回归方程计算样品溶液中黄芪甲苷的平均含量。黄芪中黄芪甲苷测定平均值为0.425 mg/mL，平均含量为0.053%。 2.2 膜荚黄芪中黄芪甲苷的制备收集
如2.1.7检测所示，本试验所选批次的黄芪中黄芪甲苷的含量为0.053%，符合2010版药典标准中黄芪甲苷的含量不得少于0.030%的要求，可用于后续试验中黄芪甲苷的制备收集。
如2.1.7检测所示，在分析系统下，优选出最佳色谱条件，然后转换到制备系统，将对应条件放大并做适当调整后，自动进样开始制备，收集黄芪甲苷。根据制备色谱的条件进行操作，进样量为2 mL，流速为10 mL/min。从图3中可以看到，峰型较好，峰间间隔适当，能够将相互组分分离，说明选用的制备色谱条件是合适的。收集图3中组分①～④，利用分析型色谱与黄芪甲苷对照品比对。因上述分析型色谱条件为梯度流动相，耗时较长，浪费试剂，给环境造成不必要的污染，故此步利用《中国药典》(2010年版)高效液相色谱法的耗时较短的等度流动相。即对照品溶液的流动相为乙腈∶水(32∶68)；流速：1.00 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：270 nm。检测器参数：漂移管温度：105 ℃；气体流速：2.80 L/min。经对比发现，峰①，即保留时间为26 min的组分与黄芪甲苷对照品在同一条件下保留时间一致(图4、5)。 2.3 膜荚黄芪的ESI-MSn分析
高效液相色谱制备出来的物质经过ESI-MSn的分析之后显示离子峰
807[M+Na]+、各色谱峰的一级质谱图和二级质谱图见图6，表明该物质的分 子量为784；该物质经测定熔点为295～296 ℃，易溶于甲醇，Lieberman-Burchard反应阳性，Molish反应阳性，根据质谱解析结果及与对照品的色谱结果对比分析得知该成分与黄芪甲苷的保留时间一致，峰型一致[5]，可鉴定为黄芪皂甙IV(astragaloside IV)，即黄芪甲苷，经过HPLC面积归一化定量法测定纯度可达95%。
目前有关黄芪主要有效成分的分析和制备的色谱方法主要为醇提方法，水提方法的相关报道较少。水提法作为中国传统的提取方法与现代的醇提方法肯定有所不同，罗新玉[6]等采用正交试验法对黄芪有效成分的提取工艺进行研究，结果采用水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，加水量分别为药材量的10倍和8倍的提取工艺既科学又合理。为了较好分析和制备中药黄芪中的黄芪甲苷，本试验选取以水为提取溶剂的水提黄芪样品中黄芪甲苷的制备方法。与醇提法比较，水提法不仅节约大量乙醇和能源，不需要昂贵的乙醇回收设备，不仅降低生产成本，也降低回收乙醇带来的危险，而且提取物(或中间体)纯度高、损失小。另外，黄芪中尚含有多糖等水溶性有效成分，采用水提更能保证提取物的纯度和质量。在中药口服液制剂的生产过程中，大部分采用水煎醇沉法去除杂质，研究表明水提醇沉的方法可以有效去除提取液中的多糖成分，而其他的一些有效成分不会有明显损失[6]。 目前常见的测定黄芪中黄芪甲苷含量的方法有薄层-比色法、薄层-扫描法、HPLC-UV检测法和HPLC-ELSD检测法。薄层-比色法利用合适展开剂对黄芪提取物进行薄层色谱分离纯化得到黄芪甲苷，再用香草醛-硫酸或香草醛-高氯酸发色体系进行比色，以分光光度计进行测定；薄层-扫描法先采用薄层色谱分离纯化得到黄芪甲苷，之后在特定波长下进行扫描测定，与薄层-比色法相比试验步骤少，而精密度高，但实际操作中存在展开时的温度、展开剂的蒸气饱和度和极性等色谱条件很难维持恒定，常出现分离效果不佳、拖尾等情况，从而影响方法的准确性及结果的
重现性；HPLC-UV检测法多用于黄芪制剂和药材中黄芪甲苷的测定。该法兼具分离和分析功能，与薄层色谱法相比分离效率更高，测定结果更准确。流动相多为甲醇-水或乙腈-水，色谱柱多采用C18柱，检测的波长为203 nm左右；而HPLC-ELSD检测法弥补了HPLC-UV检测对黄芪甲苷的紫外吸收弱、灵敏度不高的缺点，通用型质量检测器为蒸发光散射检测器，对无紫外吸收的皂苷类化合物灵敏度高，结果完整可靠[7,8]。考虑到HPLC-UV检测法应用的普遍性，本试验选择HPLC-UV检测法作为测定黄芪甲苷含量的方法，经过面积归一化定量测定，得到的黄芪甲苷含量符合国家药典的规定，说明水提方法黄芪甲苷的含量未受影响。同时考虑到梯度洗脱耗时较长，使用有机溶剂较多，为降低试验成本及不必要的环境污染，采用《中华人民共和国药典》2010年版中成熟的等度流动相，HPLC-ELSD检测法比对收集到的组分与对照品。本试验充分考虑各种高效液相色谱技术的优缺点及实验室现有条件，取长补短的设计试验方法，既能准确收集黄芪甲苷组分，又能有效节省时间及试剂。
在现代提取分离方法中，HPLC具有功能多、分辨率高等优点，与其他分离制备方法相比，液相色谱法是目前技术条件最成熟、应用范围最广的一种。制备型HPLC是一种使用大流量、高压液体输送系统在高分辨率、高载量、大内径分离柱上进行的对样品高纯度提取分离的液相色谱制备方法。制备型HPLC装置主要由进样系统、色谱柱、输液泵、馏分收集器、数据采集与处理系统和检测器等装置组成。采用该方法提取分离的产品在分离效率、纯度和回收率等方面远高于传统的制备方法，因此在生物技术、植物和合成化学、药品和医药学领域得到广泛应用[9,10]。李军[11]等采用制备型HPLC法对曲克芦丁原料进行分离纯化得到纯度高于99%的曲克芦丁对照品。陈晓辉[12]等利用制备型HPLC对野菊花的黄酮类化学成分进行分离纯化得到纯度均为99%以上的6个化学品。本试验采用梯度洗脱方法制备分离得到纯度可达95%的黄芪甲苷，同时节省时间和试剂。与其他方法相比，该方法
存在分辨力高、应用范围广，且操作简便、样品处理量大，具有常规化学分析方法不可比拟的优越性和应用前景。
电喷雾质谱(ESI-MS)是一种可得到每个色谱峰的紫外光谱图、保留时间、相对分子质量和特征碎片等信息的软电离质谱技术，与质谱联用可弥补常规紫外检测对某些紫外吸收弱的化合物不够灵敏、提供分子结构信息较少等缺陷[13]。本试验通过HPLC/ESI-MSn联用法，对膜荚黄芪水煎液提取物进行定性对比分析，为建立中药黄芪的指纹图谱提供试验基础，并对黄芪主要成分的质谱裂解规律进行总结，为快速、准确分析黄芪化学成分提供了又一种手段。由于时间关系和试验成本，本试验只制备一种成分，更多的成分制备分析将在以后的工作中继续进行。
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