(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111825718 A(43)申请公布日 2020.10.27
(21)申请号 202010709048.5(22)申请日 2020.07.21
(71)申请人 湘潭大学
地址 411105 湖南省湘潭市雨湖区羊牯塘
街道湘潭大学化学学院(72)发明人 李春艳 王文新 (51)Int.Cl.
C07F 9/6558(2006.01)C09K 11/06(2006.01)C09B 57/00(2006.01)G01N 21/359(2014.01)G01N 21/(2006.01)
权利要求书1页 说明书5页 附图5页
(54)发明名称
基于喹啉-氧杂蒽的碱性磷酸酶荧光探针的制备和应用(57)摘要
本发明涉及了一种碱性磷酸酶(ALP)近红外荧光探针的制备和应用，该探针的结构式为：
细胞内ALP含量的检测。
本发明提供了以喹啉‑
氧杂蒽染料、三氯氧磷等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种具有良好的水溶性、近红外发射的碱性磷酸酶荧光探针；首先，该荧光探针对ALP表现出较好的灵敏度，线性范围为0.05‑1.0U/mL，检测限为0.017U/mL；其次，该荧光探针对ALP表现出很高的选择性，不受其他各种离子、活性氧、生物硫醇以及氨基酸和酶的影响；并且，该荧光探针与ALP作用迅速，响应时间在10min以内；此外，该荧光探针还可应用于活
CN 111825718 ACN 111825718 A
权 利 要 求 书
1/1页
1.一种碱性磷酸酶近红外荧光探针，即QX-P，其结构如下：
2.根据权利要求1所述的一种碱性磷酸酶近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：
在N2保护下，将0.5当量的QX-OH，2.0～3.0当量的三氯氧磷，2.0～3.0当量的吡啶分别加入到25mL圆底烧瓶中，然后加入5～8mL的CH2Cl2将其溶解。反应在室温下搅拌4小时后，将所得混合物倒入冰中，并继续搅拌过夜。反应完成后，减压除去溶剂，所得粗产物用展开剂CH2Cl2/CH3OH＝2∶1进行柱层析纯化，得到深蓝色固体产物QX-P，即为所述的荧光探针。
3.根据权利要求1所述的一种碱性磷酸酶近红外荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针应用于活细胞内碱性磷酸酶含量的检测。
2
CN 111825718 A
说 明 书
1/5页
基于喹啉-氧杂蒽的碱性磷酸酶荧光探针的制备和应用
技术领域
[0001]本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及基于喹啉-氧杂蒽染料的碱性磷酸酶荧光探针的制备和应用。
背景技术
[0002]碱性磷酸酶(ALP)作为一种能够将蛋白质和非蛋白质底物去磷酸化的水解酶，广泛存在于哺乳动物的肝脏、肾脏、肠道、骨骼和胎盘在内的许多组织中(K.Ooi,K.Shiraki,Y.Morishita,J.Clin.Lab.Anal.2007,21,133；J.N.Fernandez,A.B.Kidney,Vet.Clin.Pathol.2007,36,223-233.)。ALP作为目前公认的生物标志物，参与许多重要的生理和病理过程(J.E.Coleman.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.1992,21,441-483；J.Stebbing,L.C.Lit,H.Zhang,R.S.Darrington,O.Melaiu,B.Rudraraju,G.Giamas,Oncogene.2014,33,939-953.)。同时，ALP的活性与细胞的分化和生存能力有关，而且已经证实ALP水平异常与许多疾病的发生和发展密切相关，例如：乳腺癌，前列腺癌，心脏病，骨病，糖尿病等(R.H.Christenson,Clin.Biochem.1997,30,573-593；M.Syakalima,M.Takiguchi,J.Yasuda,Y.Mortal,A.Hashimoto,Vet.Q.1998,20,18-22；P.H.Lange,J.L.Millan,T.Stigbrand,R.L.Vessella,E.Ruoslahti,W.H.Fishman,Cancer.Res.1982,42,3244-3247；A.
C.Hellberg,F.D.
Nat.Rev.Cancer.2006,6,307-320；
K.Ooi,K.Shiraki,Y.Morishita,T.Nobori,J.Clin.Lab.Anal.2007,21,133-139.)。因此，开发一种方便可靠的实时检测生物体中ALP活性的方法显得非常重要。[0003]ALP的传统检测方法包括电化学法、比色法和色谱法，这些方法通常不仅需要复杂的操作，而且无法实现体内检测。荧光方法因其具有操作简便、灵敏度高、选择性好、实时和无创性等诸多优点而备受关注(G.Deng,S.Li,Z.Sun,W.Li,L.Zhou,J.Zhang,P.Gong,L.Cai,Theranostics.2018,8,4116-4128；G.Hong,S.Diao,J Chang,A.L.Antaris,C.Chen,B.Zhang,S.Zhao,D.N.Atochin,P.L.Huang,K.I.Andreasson,C.J.Kuo,H.Dai,Nat.Photonics.2014,8,723-730)。到目前为止，已经开发了一些检测ALP的荧光探针，用于实时监测细胞或者活体内的ALP活性(X.F.Hou,Q.X.Yu,F.Zeng,H.J.Ye,S.J.Wu,J.Mater.Chem.B.2015,3,1042-1048；J.Liang,R.T.K.Kwok,H.Shi,B.Z.Tang,B.Liu,ACS Appl.Mater.Interfaces.2013,5,8784-87；H.Zhang,C.Xu,J.Liu,X.Li,L.Guo,X.Li,Chem.Commun.2015,51,7031-7034；X.Gu,G.Zhang,Z.Wang,W.Liu,L.Xiao,D.Zhang,Analyst.2013,138,2427-2431.)。但是，由于这些探针发射波长短，没有达到近红外范围。使得探针容易受到自身背景荧光的干扰，从而阻碍了它们在生物系统中的应用。因此，设计一种具有近红外发射的荧光探针是至关重要的。[0004]喹啉-氧杂蒽作为一种新型的荧光染料，具有水溶性好、灵敏度高等优点。特别是，由于其染料具有近红外发射，因此具有较深的组织穿透深度，不易受到生物自体荧光的干扰，对生物成像更有利。研究发现，利用喹啉衍生物的荧光探针已经成功应用于检测了一些目标物，如：亚硫酸盐、Zn2+等(L.Tan,W.Y.Lin,S.S.Zhu,L.Yuan,K.B.Zheng,
3
CN 111825718 A
说 明 书
2/5页
Org.Biomol.Chem.2014,12,4637-43；Z.Q.Mao,L.Hu,X.H.Dong,C.Zhong,B.F.Liu,Z.H.Liu,Anal.Chem.2014,86,6548-6554.)。但是，到现在为止，还没有基于喹啉-氧杂蒽染料作为荧光探针来检测ALP。因此，设计和合成一种基于喹啉-氧杂蒽染料的荧光探针来检测ALP是非常有必要的。
发明内容
[0005]根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种基于苯喹啉-氧杂蒽染料的碱性磷酸酶近红外荧光探针。[0006]本发明的技术方案是，一种碱性磷酸酶近红外荧光探针，其结构式如下：
[0007]
一种碱性磷酸酶近红外荧光探针的制备方法。步骤如下：[0009]在N2保护下，将0.5当量的QX-OH，2.0～3.0当量的三氯氧磷，2.0～3.0当量的吡啶分别加入到25mL圆底烧瓶中，然后加入5～8mL的CH2Cl2将其溶解。反应在室温下搅拌4小时后，将所得混合物倒入冰中并继续搅拌过夜。反应完成后，减压除去溶剂，所得粗产物用展开剂CH2Cl2/CH3OH＝2∶1进行柱层析纯化，得到深蓝色固体产物QX-P，即为所述的荧光探针。[0010]本发明的有益效果是，一种基于喹啉-氧杂蒽染料的碱性磷酸酶近红外荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究该探针的荧光光谱性质。探针本身在770nm处没有明显的近红外发射峰；当探针中加入ALP后，在770nm处出现了明显的近红外发射峰。并且随着ALP浓度的增大，探针的近红外荧光强度不断增强。当加入1.0U/mL的ALP时，荧光强度大约增强6倍，因此可以很好的检测ALP。该探针的检测范围从0.05U/mL到1.0U/mL，检测限为0.017U/mL，这说明该探针可以高灵敏的检测ALP。接着，研究了探针的紫外吸收光谱。在没有加入ALP时，探针在568nm处有吸收带；加入ALP后，568nm处的吸收峰逐渐降低，在717nm附近出现新的吸收峰。然后，研究探针的选择性，考察了探针与各种金属离子(Na+,Ca2+,Mg2+)和阴离子(Cl-,Br-,OH-)，活性氧(ClO-,O2-,H2O2)，生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)，氨基酸(Tyr,Pro,Phe,Lue)，生物酶(AChE,GGT,PDE,trypsin)以及检测物(ALP)的荧光响应情况。结果发现，只有ALP能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。最后，研究了pH值对荧光探针测定ALP的影响，当pH值在7.0到9.0之间时，不影响荧光探针对ALP的测定。此外，该荧光探针响应比较迅速，响应时间在10分钟以内。[0011]一种碱性磷酸酶近红外荧光探针的应用。在对照组细胞中观察不到明显的荧光，当细胞中加入荧光探针后，可以明显地观察到较强的荧光，这说明细胞中的ALP含量较高。而用钒酸钠(Na3VO4)处理抑制细胞内ALP的产生，发现细胞内的荧光明显减弱。这些结果说明荧光探针能检测到细胞内产生的ALP，这为监控人体内和碱性磷酸酶相关病变提供一种可靠的手段。
[0008]
4
CN 111825718 A
说 明 书
3/5页
附图说明
[0012]图1为荧光探针的合成路线。
[0013]图2为荧光探针与不同浓度的ALP作用后的荧光光谱图。[0014]横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度为10μM，ALP的浓度分别为：0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0U/mL。发射波长为770nm，对应的激发波长为717nm。
[0015]图3为荧光探针对不同ALP浓度的荧光线性响应图。[0016]图4为荧光探针与ALP作用后的紫外可见吸收光谱图。[0017]横坐标为波长，纵坐标为吸光度。荧光探针的浓度为10μM，ALP浓度为1.0U/mL。[0018]图5为荧光探针的选择性图。[0019]荧光探针的浓度为10μM，ALP浓度为1.0U/mL，其它分析物浓度均为2eq。[0020]图6为pH对荧光探针的影响图。
[0021]图7为荧光探针与ALP作用后荧光强度随时间变化的关系曲线图。[0022]图8为细胞毒性实验图。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。[0023]图9荧光探针与ALP作用的细胞成像图。
具体实施方式
[0024]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。[0025]实施例1：
[0026]荧光探针的合成[0027]合成路线如图1。在N2保护下，将QX-OH(190mg,0.5mmol)，三氯氧磷(230mg,1.5mmol)，吡啶(119mg,1.5mmol)分别加入到25mL圆底烧瓶中，然后加入6mL的CH2Cl2将其溶解。反应在室温下搅拌4小时后，将所得混合物倒入冰中并继续搅拌过夜。反应完成后，减压除去溶剂，所得粗产物用柱层析纯化(CH2Cl2/CH3OH＝2∶1)，得到深蓝色固体产物QX-P
1
(150mg,产率65％)，即为所述的荧光探针。H NMR(400MHz,DMSO)δ8.66(d,J＝9.4Hz,1H),8.56(t,J＝10.8Hz,2H),8.34(d,J＝9.3Hz,1H),8.22(d,J＝7.7Hz,1H),8.07–7.97(m,1H),7.80–7.75(m,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,1H),7.07(s,1H),6.92(s,1H),6.71–6.66(m,2H),4.93–4.88(m,2H),2.(t,J＝6.2Hz,4H),1.84–1.79(m,2H),1.52(t,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO)δ160.8,156.8,154.3,141.6,138.7,134.6,130.0,129.6,128.6,128.1,127.3,126.2,121.0,118.5,114.3,113.3,112.3,110.8,102.8,45.7,29.1,24.6,20.8,13.7.MS(TOF):462.2.[0028]实施例2：
[0029]荧光探针和ALP溶液配制[0030]探针溶液的制备：称取一定量探针溶解在二甲基亚砜中，配成1×10-4M的备用溶液。将1.0mL探针的备用溶液加入到10mL的容量瓶中，用Tris-HCl缓冲溶液定容后，得到浓度为1.0×10-5mol/L的荧光探针溶液。将ALP分别配制为以下浓度(0,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0U/mL)。[0031]实施例3：
[0032]荧光探针与ALP作用的荧光光谱的测定
5
CN 111825718 A[0033]
说 明 书
4/5页
图2为荧光探针与ALP作用的荧光光谱，荧光探针的浓度为10μM，ALP的浓度依次为
0,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0U/mL。实验所用激发波长为717nm，发射波长范围为730～900nm。狭缝宽度为10.0nm/10.0nm，所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图2可以看出，加入ALP之前，由于磷酸根的淬灭作用，探针本身几乎没有发射峰；随着ALP的加入，在770nm处发射峰大幅度的增强，并且随着ALP浓度的增大，探针的荧光强度不断增强。图3为探针对不同ALP浓度的线性响应图。荧光强度跟ALP的浓度呈现线性关系，线性范围是0.05U/mL～1.0U/mL，检测限是0.017U/mL。这说明该探针可以高灵敏的检测ALP。
[0034]实施例4：
[0035]荧光探针与ALP作用的紫外可见吸收光谱的测定
[0036]图4为荧光探针与ALP作用后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为10μM，ALP的加入量为1.0U/mL。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。从图4中可以看出，探针本身在568nm处有吸收带；加入ALP之后，568nm处的吸收峰逐渐降低，在717nm附近出现新的强吸收峰。[0037]实施例5：
[0038]荧光探针对ALP测定的选择性
[0039]图5为荧光探针对ALP测定的选择性图。考察在浓度为10μM的荧光探针中加入ALP(1.0U/mL)及各种金属离子(Na+,Ca2+,Mg2+)和阴离子(Cl-,Br-,OH-)，活性氧(ClO-,O2-,H2O2)，生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)，氨基酸(Tyr,Pro,Phe,Lue)，生物酶(AChE,GGT,PDE,trypsin)的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有ALP能引起荧光光谱的明显增强，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对ALP有良好的选择性。[0040]实施例6：
[0041]溶液pH值对荧光探针测定ALP的荧光性质的影响[0042]考察pH值对荧光探针测定ALP的荧光光谱的影响，其结果如图6。我们研究的pH范围为2.0～10.0，荧光探针的浓度为10μM，ALP的浓度为1.0U/mL。从图中可以看出，荧光探针随着pH的变化，荧光强度基本不变，说明pH对探针本身没有很大的影响。然而，加入ALP之后，在pH在7.0～9.0范围内，荧光强度比值显著增强。综上所述，当pH值在7.0到9.0之间时，不影响荧光探针对ALP的测定，是比较合适的pH值范围，这非常有利于该探针用于实际样品中ALP的测定。[0043]实施例7：
[0044]荧光探针与ALP作用的响应时间的测定[0045]我们研究了荧光探针对ALP的响应时间，其结果如图7。从图中可以看出，该探针对ALP的响应时间为10min，这能够满足在实际样品中进行实时监测的要求。从图7我们还可以看出，荧光强度达到最大值后，在之后的时间里，荧光强度不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。[0046]实施例8：
[0047]荧光探针在活细胞中的应用[0048]首先，我们做了细胞毒性试验，如图8所示。当加入0～30μM探针，结肠癌细胞HCT116的存活率在90％以上。这可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的
6
CN 111825718 A
说 明 书
5/5页
ALP。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择结肠癌细胞HCT116进行共聚焦显微成像，结果如图9所示。在对照组细胞中，几乎没有观察到荧光。然后细胞中加入探针，观察到荧光明显增强。当在细胞中加入ALP抑制剂Na3VO4后再加入探针，发现细胞内的荧光几乎消失。这些结果说明该探针可以高灵敏性的检测细胞内的ALP。
7
CN 111825718 A
说 明 书 附 图
1/5页
图1
图2
8
CN 111825718 A
说 明 书 附 图
2/5页
图3
图4
9
CN 111825718 A
说 明 书 附 图
3/5页
图5
图6
10
CN 111825718 A
说 明 书 附 图
4/5页
图7
图8
11
CN 111825718 A
说 明 书 附 图
5/5页
图9
12
