结构层

甘油三酯和胆固醇在大鼠分布成脂蛋白成分的基因决定因素

主要的脂蛋白类的血浆分布及其细分为特定的分数对动脉粥样硬化的发病机制起到了至关重要的作用，也是冠状动脉疾病的重要预测指标。我们的目标是在重组近交系大鼠组固定的PXO以确定甘油三酯和胆固醇分布成脂蛋白成分和脂蛋白颗粒大小基因组决定因素，其中代谢综合征模型大鼠的等位基因（SHR和PD的近交系）与布朗挪威鼠株在一起分离。 15 PXO成年雄性大鼠株（N=8-13/株）和两个祖株SHR-LX（N=13）和BXH2/幼兽组（n =18）进行为期一周的高糖饮食喂养。我们利用704个多态的微标记对20脂蛋白成分和脂蛋白颗粒的主要类大小进行甘油三酯和胆固醇（C）浓度的关联分析（TG），全基因组意思通过每特质2000排列被验证。随后在硅片聚焦鉴定数量性状位点，使用超过20000个单核苷酸多态性的地图完成。在大部分的表型，我们确定品系（如VLDL-TG5.6〜66.7毫克/分升）之间的实质性梯度。我们已经确定了14个位点（包含1到65个基因）对大鼠染色体3，4，7，8，11和12显示出提示或显著关联到一个或一个以上的研究特点。除LDL-TG和肥胖指数， PXO株携带SHR等位基因显示链接的特质是显著的并有更高价值的。胆固醇浓度在大，中，非常小的LDL颗粒显著相关单个基因的部分单倍型块跨越，低密度脂蛋白受体相关蛋白1B（LRP1B）。使用全基因组关联，我们已经在大鼠品系的重组自交系面板确定了甘油三酸酯和胆固醇分布脂蛋白成分的新的遗传决定因素。

简介

胆固醇总浓度的利用率（C）和三酰甘油（TG）与高胆固醇和低密度脂蛋白颗粒（HDL和LDL，分别）已经是心血管风险评估的重要支柱[1]。但是，最近的证据有所削弱这些比较粗的措施的突出地位[2-4]。新的数据从研究中不断涌现，结合先进的分型技术使平均测量粒径 [5,6]，评估C和甘油三酯浓度下降到特定的脂蛋白亚成分[7-9]或全面脂质组途径 [10] 与遗传，后生的[11]全基因组一起分析。最近的几项研究确定了在不同的品系组基因多态性对脂蛋白直径的变化 [6,12]或脂蛋白亚组分的分布格局[13-16]。由于整个脂蛋白谱的TG和C的含量基本上由遗传因素和环境的影响而影响，包括饮食[17-19]和药物[20-22]，哺乳动物模型已被成功地用于他们的基因决定子的详细分析的复杂性的减少[23,24]。早在1996年，该专业的相关性研究脂蛋白亚组分于30重组自交系进行，来自于华夏BXH株自发性高血压大鼠（SHR）和同类系的棕色挪威（BN-60）的大鼠品系[25]。给动物饲喂含5％的橄榄油，2％胆固醇四个星期，并以后的关联分析把HDL2-C和磷脂链接使用534微卫星位点鉴定大鼠染色体4，19 和20 [25]。HXB/ BXH套，BXH2其中的一个，与8号染色体的同类株SHR.Lx[26,27]一起担任作为PXO重组近交系面板的祖株。最近通过Gibson等审查，饮食与蔗糖含量高诱导血脂异常是公认的（胰岛素抵抗）[28]。我们和其他人已经建立了特定的三者之间的灵敏度差异，高糖饮食有助于促进HXB/ BXH和PXO重组近交系的基因组库。而自发高血压大鼠SHR/ OlaIpcv[29]和polydactylous鼠PD/幼兽[30,31]是相当敏感对高脂血症和HSD对糖尿病的影响，这一方面布朗挪威（BN）株较少响应 [32,33]。此外，所有的PXO株携带源于PD/幼兽的8号染色体区域，这在SHR和BN的基因组背景下显示响应于HSD-诱导的高脂血症 [33,34]。在目前的研究中，我们进行的脂蛋白颗粒大小全基因组关联，C和TG的详细分布到20个不同的脂蛋白级分和在整个PXO集进行形态学测量， 其次是在硅片优先使用候选变种超过20,000个单核苷酸多态性的密集地图对SHR和BN大鼠品系提供全基因组序列。

材料和方法

所有实验均与动物捷克共和国保在协议进行（1997分之311），这是遵守欧洲共同体理事会提出的建议用于实验动物的使用第86/609 / ECC和均被医学查尔斯大学第一个学院的伦理委员会批准。 大鼠品系

成年（4个月）的15 PXO株雄性大鼠（PXO1/幼童，大鼠基因组数据库（RGD）编号2307138，N=11; PXO2/幼童，RGD编号2307356，N=11; PXO3-1/幼童，RGD编号2307355，N =10; PXO3-2/幼童，RGD编号2307116，N=9; PXO4/幼童，RGD编号2307135，N=9; PXO5-1/幼童，RGD编号2307128，N =11; PXO5-2/幼童，RGD编号2307117，N=10; PXO6-1/幼童，RGD编号2307137，N=10; PXO6-2/幼童，RGD编号2307125，N = 8; PXO6-3/幼童，RGD编号2307130，N=10; PXO7-1/幼童，RGD编号2307119，N=8; PXO8-1/幼童，RGD编号2307122，N =10; PXO8-2/幼童，RGD编号2307131，N=13; PXO9/幼童，RGD编号2307118，N=9; PXO10/幼童，RGD编号2307132，N =12））以及祖株SHR-LX（RGD序列号61106，N =13）和BXH2/幼童（BXH2以下简称RGD编号2307121，N =18）被用于在当前的研究中。以上所有菌株最初提取和保持，自从在动物设施生物学研究所和医学遗传学，拳系的医药，布拉格查尔斯大学[27]。 实验协议

动物被保持在温度和湿度的控制下在12小时/ 12小时光照 - 黑暗周期的条件。在任何时候，动物都可以免费获得食物和水。在4个月的年龄，雄性大鼠15 PXO株组（n =8-13/应变）和祖细胞株SHR-LX（N=13）和BXH2组（n =18）喂食高糖饮食（HSD，蛋白质（19.6 CAL％），脂肪（10.4 CAL％），碳水化合物（蔗糖，70 CAL％）和微量营养素的均衡水平）1周。从禁食过夜后抽取尾静脉血样。如以前[9,22]中使用高效液相色谱（HPLC）确定，甘油三酯（TG）和胆固醇（C）的浓度在20脂蛋白成分和脂蛋白的主要类别的大小颗粒。然后，处死大鼠对心脏，肝脏，肾脏，肾上腺，附睾及腹膜后脂肪垫的重量进行了测定。所有测量的详细结果列于提供表S1-S6。 基因鉴定

鼠基因组DNA，从尾的切口分离使用改良的苯酚提取法的样品。多态微卫星位点进行PCR使用条件扩增对于每个标记物进行了优化。对PCR产物进行分离聚丙烯酰胺（7-10％）或琼脂糖（2-4％）的凝胶，通过染色使用Syngene的G-BOX溴化乙锭和可视化。我们扫描超过1000个微卫星标记多态性为二祖菌株之间。接着，我们选择了标记多态性分型的祖菌株之间所有15 PXO重组近交系。共有704微卫星标记被用于关联分析。一旦的QTL鉴定，我们在硅片确定的程度使用20,000单核苷酸地图单倍型区段多态性，已通过星级最近提供财团（http://www.snp-star.eu/）[35]。 协会并在硅片分析

该协会分析采用MapManagerQTX进行v0.30[36]。全基因组显着性测定通过置换的方式在MapManagerQTX实施v0.30（每2000性状排列）。为了识别人类基因组的同线的，以所识别的QTL区域，我们已经利用虚拟地图比较软件工具（http://www.animalgenome.org/VCmap/）。然后，我们都重叠这些地区的显著位点的基因组位置报道在人类全基因组关联研究（萃取从发布全基因组关联研究的目录，请访问：http://www.genome.gov/gwastudies/[37]）相关表型（按字母顺序排列：载脂蛋白水平;生化措施（脂质相关的）;心血管疾病风险因素;胆固醇;胆固醇和甘油三酯;胆固醇，总;高密度脂蛋白胆固醇 - 甘油三酯（HDLC-TG）;高密度脂蛋白胆固醇;高甘油三酯血症; LDL（被氧化）;低密度脂蛋白胆固醇;脂质代谢表型;脂性状;代谢综合征（二元特征）;代谢性状（脂质相关的）;磷脂水平（血浆）;数量性状（脂质相关的）;鞘脂水平;甘油三酯;甘油三酯，血压（TGBP）。 统计分析

所有统计分析均使用STATISTICA10执行锆石。不成对的学生t-检验进行比较二祖菌株的代谢和形态特征。当在比较形态学和生物化学变量整个PXO集，单因素方差分析，用菌株作为用于主要因素其次是事后Tukey的诚实的意义差异检验的特定对变量进行比较。空假设被拒绝时磷，0.05。

结果

祖细胞的形态信息和PXO集这两个祖株表现出显著差异两者形态和整体血脂（表1）。SHR-LX大鼠重的69％，显示可比量的内脏脂肪，然而，多于两倍的每腹膜后脂肪 100g体重相比HXB2。内PXO重组自交系面板，体重之间的分布祖细胞的值，而脂肪沉积相对权重显示的一样，其他器官侵变化（图1）权重（表S1）。 祖细胞的血脂和PXO集

全碳的浓度在SHR-LX略高相比BXH2，而总甘油三酯未之间的不同祖细胞（表1）。然而，C的详细评估和TG分配到20脂蛋白部分透露了一个相当不利的轮廓在SHR-LX大鼠（表S5和S6）。相较于BXH2，SHR-LX增加了甘油三酯水平，下在极低密度脂蛋白分数和最显著胆固醇富集非常小的LDL颗粒（图2）。除了非常大并非常小的高密度脂蛋白HDL-C含量在SHR-LX下降。在评估整个PXO面板的血脂，我们观察中C和TG浓度大幅梯度主要的脂蛋白类（图3，表S2和S3），特别是在VLDL（13倍和整个12倍梯度，PXO株C和TG分别）。结合有限内应力变化，这些措施这一建议的实际影响甘油三酯和C的分布等位基因的分离，使所研究的性状适合于在遗传解剖PXO面板。 全基因组关联

我们扫描了1000个微卫星标记多态性为SHR-LX和BXH2，随后我们之间在所有PXO重组基因型704多态性标记近交系，均匀地覆盖常染色体和X染色体（除染色体2和13，其是SHR起源于两个亲株）。用相同的相邻标记块分离模式被折叠成最终应变分布图案（SDP）。完整的SDP是用于关联分析形态和脂质相关性状。使用间隔测绘，我们已经确定了9个位点显示或暗示13学特性（3形态和10显著协会脂质相关的基因座，总结于表2）。除了协会在染色体3为肥胖指数和LDL-TG信号和12，PXO株携带SHR-LX（即SHR）的等位基因显示链接性状显著更高的价值，如LDL-C（21.260.4主场迎战12.560.4毫克/分升PXO菌株的基因SHR与BXH2（BN）等位基因在D3Rat50-D3Got19块（表2）。 在硅片分析

为了缩小的所识别的基因组范围个QTL，我们检索祖细胞和PXO的SNP基因型 菌株为使用SNPlotyper所识别的相关联的区域工具（http://snplotyper.mcw.edu/，表2）[35]。在某些情况下，我们能够显著减少特定的范围单倍型块（例如VLDL-C QTL的染色体从4 8.7 MB到只有1.1 MB只含有4个基因，即86％），在其他情况下，通过微卫星提供的信息几乎是相同的，由单核苷酸多态性（如LDL-C的QTL染色体3缩短了350 KB，即通过8％）。在接下来的步骤中，我们利用由大鼠基因组所提供的变体可视化资源数据库（http://rgd.mcw.edu/rgdweb/front/select.html），以确定SHR和国阵的基因组之间的高度保守的变体内的狭窄捕获的基因之间的序列[38]的QTL作为进一步研究有针对性的潜在候选人。这些基因表现的主要候选人，鉴别的QTL。在同时，我们搜索的拷贝数存在变种不同的SHR大鼠的基因组阵内的QTL[39]。胆固醇检测的相关性最强的信号在总LDL含量和对大鼠非常小LDL颗粒染色体3，其中21个蛋白质编码基因中的相关联段，7显示之间的非同义变体SHR和BN等位基因：无名指和CCCH型域2（Rc3h2）中，G蛋白偶联型受体21（GPR21），RAB GTP酶激活蛋白1（Rabgap1，有内另一变型该基因的59-非翻译区），屑同源物2果蝇（CRB2），类似于顺式高尔基体基质蛋白GM130（LOC690458），Golgin亚科成员1（Golga1）和40秒核糖体蛋白S17类似（LOC100362666）。四内含子

变化是在精子细胞的核周RNA结合发现蛋白（Strbp）。

3号染色体上一个显着位点与胆固醇浓度在大，中，非常小的LDL颗粒。该全基因组块跨越约2 MBP用一个重叠基因，低密度脂蛋白受体相关蛋白1B（LRP1B）。而没有突变推定改变一个氨基酸被发现比较这两个祖先的序列时，有0.20内含子的差异，分布在相关区域在59 - 和39 - 翻译以及10和五个不同的变种区域（UTR）的这种基因，分别为。内的五个基因3号染色体上的第三位点与胆固醇和三酸甘油酯浓度大LDL颗粒和胆固醇在介质中的LDL具有明显的非同义变体SHR：假定蛋白LOC680314，tetratricopeptid重复， 锚蛋白重复序列和含有1（Tanc1卷曲螺旋，附加3差异在59-UTR发现），布罗莫毗邻锌 指结构域，2B（Baz2b，在该基因的59-UTR存在9其他多态性），淋巴细胞抗原75（Ly75）和磷脂酶A2受体1（PLA2R1）。

确定染色体上4显示了数量性状位点协会胆固醇脂蛋白的总浓度以及在大中极低密度脂蛋白颗粒。跨越刚刚超过1MBP，它包含两个基因与在预测的氨基酸的变化SHR中，蛋白质酪氨酸磷酸酶，受体型，Z多肽1（Ptprz1）和氨基己二酸 - 半醛合成酶（奥斯）。10多个内含子的变种被发现在钙+ - 依赖分泌活化剂2（Cadps2）基因。

7号染色体的两个关联命中一个网站;一与形态特征的肝脏和肾脏的重量有关包括5个基因与SHR与国阵之间的差别株[卷曲家族受体6（Fzd6，1代名词和2在SHR）的非同义变异，dendrocyte表示7跨膜蛋白（Dcstamp，1个非同义变异和4在内含子单核苷酸多态性），调节突触膜的胞吐2（Rims2，9个SNP位点内含子），被发现非同义变异也二氢嘧啶（Dpys）和锌指蛋白，光纤陀螺家族成员2（Zfpm2）]。这个地区实际上有重叠先前发现盐装肾脏肿块Dahl盐敏感大鼠[40]。含有非同义变异显着的基因在第二基因座内的SHR和BN的等位基因与高密度脂蛋白胆固醇粒子的大小7号染色体分别为跨膜蛋白71（Tmem71），thymoglobulin（Tg）和WNT1可诱导的信号转导途径蛋白1（WISP1）。 对于肥胖指数成员中唯一显著协会位于8号染色体虽然SDP的相关区块覆盖大约8 MBP，只有10个与非同义硅片证据基因变种SHR：肌球蛋白的VC（Myo5c），家庭 序列相似性83，B部件（Fam83b），肾小管间质肾炎抗原（Tinag），凯狮般的家族成员31（Klhl31）肠细胞（MAK-K）激酶（伊克），胶原蛋白12型，α1（COL12A1），γ亚基样（Sec61，LOC100363239），细丝à相互作用蛋白1（Filip1），SUMO1/ sentrin特定肽 6（SENP6）和interphotoreceptor基质蛋白聚糖1（Impg1）。分外在目前的研究的情况下，它是国阵等位基因驱动增加肥胖。之前我们已经在PD识别这个阵位点的类似效果/幼童点¯x国阵交叉[30]，肠系膜脂肪量的QTL中发现的大冢龙埃文斯德岛脂肪（OLETF）大鼠[41]。 在非常小的胆甾醇浓度的显著QTL11号染色体上的LDL颗粒包含8个基因（满分65 存在于相关联的区域）示出遗传变异SHR与国阵之间：甘油二酯激酶伽玛（Dgkg）烯酰基 - 辅酶A，合酶/ 3 - 羟基酰基辅酶A脱氢酶（EHHADH）肝配蛋白B型受体3（Ephb3），阿尔法-1,3 - 甘露糖基（ALG3），三磷酸腺苷结合盒，C亚家族蛋白（CFTR/物料需求计划），成员5（Abcc5），凯狮般的家族成员6（Klhl6），免疫球蛋白λ链的V-VI区SUT状（LOC680311）和septin5（Sept5）。

总甘油三酯浓度的在鞋底协会低密度脂蛋白定位于染色体12与5个基因序列显示 导致氨基酸的改变SHR与国阵之间的变种：sprouty同源物3，果蝇（Spry3），核糖体蛋白L31样4（Rpl31l4，用一个额外的内含子SNP），类似于家庭与序列相似性55，成员C（RGD15217），犁鼻器2受体63（Vom2r63）和methylphosphate封顶酶（Mepce）。此外，独特SHR等位基因鉴定锌手指KRAB和扫描域1（Zkscan1，2单核苷酸多态性在59-UTR，2个SNP位点的内含子），ARFGAP与FG重复2（Agfg2，4个SNPs在59-UTR），基质抗原3（Stag3，2个内含子单核苷酸多态性）和细胞色素P450家族3，亚家族A，多肽9（Cyp3a9，1个单核苷酸多态性在内含子）。该区域还没有被连接到甘油三酯水平在大

鼠的研究，但一些胆固醇个QTL映射到这个区域[42,43]。

讨论

本研究是基因组的第一扫描中的一个胆固醇和甘油三酯的详细分布决定因素成在大鼠脂蛋白馏分。该重组PXO自交系组代表一个基因的固定系统分离SHR的等位基因，即代谢综合征的高血压模型;的polydactylous大鼠PD/幼童中，8号染色体的部分有限代谢综合征的模型没有高血压[44]正常血压和血脂正常棕色挪威（BN/幼童）株[27]。 PXO和原始HXB的研究BXH重组近交系面板已多次提供重要分析上市人类复杂的基因组结构

心脏代谢特征[26,45,46]，并曾担任一个平台为“概念验证的'''类型的研究，例如在遗传学 基因组[47]。

在我们的研究显著协会的大部分被发现的在低密度脂蛋白的子类，三血脂浓度它们映射到鼠染色体3的不同区域到目前为止，二大鼠的QTL总胆固醇水平报道重叠的区域，一个是代谢综合征的模式 -只Wistar渥太华Karlsburg W（WOKW）大鼠[48] [49]和第二达尔的S的交叉X读转基因鼠的人胆固醇酯转移蛋白（CETP）[50]。一个单一的基因，孤儿G蛋白偶联受体GPR21脱颖而出越好候选的最显著观察到的关联胆固醇总量和非常小的LDL，虽然没有直接的连接到脂质代谢是目前已知的。该GPR21基因广泛表达[51]，并已被证明具有在协调巨噬细胞促炎的关键功能活性在肥胖诱导的胰岛素抵抗性[52]的范围内。GPR21敲除小鼠显示出具有改善胰岛素灵敏度和更低的肝脏甘油三酯含量时喂高脂饮食[52]。 总之，我们已经确定了三个显著协会的胆固醇浓度在非常小的LDL颗粒。它一直一再证明，小而密的LDL都清楚连接与代谢综合征，2型糖尿病，脂肪肝[53][54]而不利lipidemic轮廓通过极大地影响环境，特别是生活方式，可以识别敏的基因变异可能最终允许早期识别 在冠状动脉疾病的风险提高了个人和相关情况。我们还比较了完整的基因存在于该区域，并确认了协会的任何在随后的特征与结果来自何处的资源库人类全基因组关联研究（HTTP：//www.genome。GOV/ gwastudies/）[37]。我们没有发现任何直接对应关联（见方法）人类的GWAS之间假定变异SHR的基因组中。这并不奇怪，因为在风险增加，而微妙的性质，大多数的SNP赋予确定了这种类型的人体研究。另一方面，在几个基因，包括LRP1B和DGKG变种，相关用胆固醇浓度在非常小的LDL颗粒我们研究中，进行了与身体质量指数和重量的人物相关联研究[55,56]。 LRP1B属于LDL受体家族和其突变通常在人类癌症中[57]中找到。此外，在LRP1B基因多态性，发现相关联与胰岛素抵抗[58]和先兆子痫[59]在人研究。另外，LRP1B被认定为显著构件腹部肥胖的鸡[60]全基因组特征。该鉴定的很窄的重要性，涵盖的QTL单个基因的一部分（LRP1B）是由在硅片数据增强五个非同义变异在不同的存在暗示SHR与QTL的内国阵。由于LRP1B的表达发现相比同源LRP1成比较低（并且由于其定位主要在脑，骨骼肌和甲状腺），有人提出，LRP1B不会发挥重大 在从血浆循环脂蛋白，对的信息交换作用另一方面，结合的含有载脂蛋白E配位体的能力有已被证明[61]。这个大基因的详细研究需要验证的SHR的确定变种的因果关系。

在目前确定的大鼠3号染色体上的第三个区域研究影响胆固醇和甘油三酯浓度低密度脂蛋白藏着三个基因在SHR非同义突变与其他研究的间接证据支持。该变种在BAZB2基因已被证明为总理候选人突然心源性猝死的GWAS meta分析的个体进行与欧洲血统[62]，而LY75被认定为一个素2型糖尿病[63]，并在显著变化表达的SNPLY75表达因异常甲基化被发现在人类扩张性心肌病[]。该PLA2R1充当受体酶分泌型磷脂酶A2，对后者又催化磷脂的水解。该PLA2R1基因已建议作为冠状动脉疾病的科目候选人总胆固醇[65]与正常水平最近的PLA2R缺陷小鼠被证明是容易的心脏 心肌梗塞[66]后破裂。

虽然两个区域相关的在我们的研究中，以胆固醇水平在极低密度脂蛋白和极低密度脂蛋

白小（染色体1,4和11，分别）是尚未与胆固醇在其他老鼠的研究，有展示自己的协会甘油三酯的几份报告浓度WOKW[67]，SHR[68] [69]和Dahl盐敏感大鼠模型[40]。之一的电流的研究是所有常染色体不完全覆盖，如染色体2和13是SHR起源于两个亲株。因此，可能存在基因多态性与血脂性状的影响驻留在两条染色体不能由鉴定我们的关联分析。为此，我们前面已经推导出专用2号染色体的同类菌株和报告的影响在甘油三酯和C分配成脂蛋白成分SHR等位基因[70]。另一个是由一个事实，即所有代表在高糖饮食喂养中进行的测量因此，所确定的关联也可以仅与此相关的特别是营养状况（即'nutrigenetic'的层对血脂的动态遗传结构[30]）。总之，我们结合了独特的大鼠品系面板的详细分型再加古典与在硅片方法来确定新的候选人胆固醇和甘油三酯的遗传因素分布成脂蛋白亚组。的过程中鉴定候选基因和因果的定位克隆的变种实质上简化感谢的可用性全面的基因型数据和完整的基因组序列自发性高血压和棕色挪威大鼠品系。