工业微生物菌种的选育

⼯业微⽣物菌种的选育第三节 ⼯业微⽣物菌种的选育　　⽤发酵法⽣产产品，⾸先要有⼀个良好的菌种。因此必须进⾏菌种选育⼯作。菌种选育⼯作⼤幅度提⾼了微⽣物发酵的产量，促进了微⽣物发酵⼯业的迅速发展。通过菌种选育，抗⽣素、氨基酸、维⽣素、药⽤酶等产物的发酵产量提⾼了⼏⼗倍、⼏百倍、甚⾄⼏千倍。菌种选育在提⾼产品质量、增加品种、改善⼯艺条件和⽣产菌的遗传学研究等⽅⾯也发挥重⼤作⽤。菌种选育的⽬的是改良菌种的特性，使其符合⼯业⽣产的要求。 　　菌种选育包括经验育种和定向育种，其中经验育种⼜分⾃然选育和诱变育种。在⽣产过程中，不经过⼈⼯诱变处理，根据菌种的⾃发突变（亦称⾃然突变）⽽进⾏菌种筛选的过程，叫做⾃然选育。由于野⽣菌株⽣产能⼒低，往往不能满⾜⼯业上的需要。因为在正常⽣理条件下，微⽣物依靠其代谢调节系统，趋向于快速⽣长和繁殖。但是，发酵⼯业⽣产，需要培养微⽣物使之积累⼤量的代谢产物。为此，采⽤种种措施来打破菌的正常代谢，对代谢流进⾏调节控制，从⽽⼤量积累我们所需要的代谢产物。例如青霉素的原始⽣产菌种产⽣黄⾊⾊素，使成品带黄⾊，经过菌种选育，⽣产菌不再分泌黄⾊⾊素；⼟霉素产⽣菌在培养过程中产⽣⼤量泡沫，经诱变处理后改变了遗传特性，发酵泡沫减少，可节省⼤量消泡剂并增加培养液的装量；红霉素等品种发酵遇有噬菌体侵袭时，发酵产量⼤幅度下降，甚⾄被迫停产，菌种经诱变处理获得抗噬菌体的特性，就可保证发酵⽣产的正常进⾏。 ⾃然选育　　⾃然选育包括从⾃然界分离获得菌株和根据菌种的⾃发突变进⾏筛选⽽获得菌种。 ⒈ 从⾃然界分离获得菌株 　　从⾃然界分离新菌种⼀般包括以下⼏个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。 　　⑴ 采样　采样地点的确定要根据筛选的⽬的、微⽣物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进⾏综合、具体地分析来决定。如果预先不了解某种⽣产菌的具体来源，⼀般可从⼟壤中分离。采样的⽅法多是在选好地点后，⽤⼩铲去除表⼟，取离地⾯5～15 cm处的⼟壤⼏⼗克，盛⼊预先消毒好的⽜⽪纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备考查。⼀般⼟壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌的孢⼦忍耐不良环境的能⼒较强，不太容易死亡。但是，由于采样后的环境条件与天然条件有着不同程度的差异，⼀般应尽快分离。对于酵母类或霉菌类微⽣物，由于它们对碳⽔化合物的需要量⽐较多，⼀般⼜喜欢偏酸性环境，所以酵母类、霉菌类在植物花朵、⽠果种⼦及腐殖质含量⾼的⼟壤等上⾯⽐较多。 　　⑵ 增殖培养　收集到的样品，如含⽬标菌株较多，可直接进⾏分离。如果样品含⽬标菌种很少，就要设法增加该菌的数量，进⾏增殖(富集)培养。所谓增殖培养就是给混合菌群提供⼀些有利于所需菌株⽣长或不利于其它菌型⽣长的条件，以促使⽬标菌株⼤量繁殖，从⽽有利于分离它们。例如筛选纤维素酶产⽣菌时，以纤维素作为唯⼀碳源进⾏增殖培养，使得不能分解纤维素的菌不能⽣长；筛选脂肪酶产⽣菌时，以植物油作为唯⼀碳源进⾏增殖培养，能更快更准确地将脂肪酶产⽣菌分离出来。除碳源外，微⽣物对氮源、维⽣素及⾦属离⼦的要求也是不同的，适当地控制这些营养条件对提⾼分离效果是有好处的。另外，控制增殖培养基的pH值，有利于排除不需要的、对酸碱敏感的微⽣物；添加⼀些专⼀性的抑制剂，可提⾼分离效率，例如在分离放线菌时，可先在⼟壤样品悬液中加10％的酚液数滴，以抑制霉菌和细菌的⽣长；适当控制增殖培养的温度，也是提⾼分离效率的⼀条好途径。 　　⑶ 纯种分离　通过增殖培养还不能得到微⽣物的纯种，因为⽣产菌在⾃然条件下通常是与各种菌混杂在⼀起的，所以有必要进⾏分离纯化，才能获得纯种。纯种分离⽅法常选⽤单菌落分离法。把菌种制备成单孢⼦或单细胞悬浮液，经过适当的稀释后，在琼脂平板上进⾏划线分离。划线法是将含菌样品在固体培养基表⾯作有规则的划线(有扇形划线法、⽅格划线法及平⾏划线法等)，菌样经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。也可以采⽤稀释法，该法是通过不断地稀释，使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取⼀定量注⼊平板，使每⼀微⽣物都远离其他微⽣物⽽单独⽣长成为菌落，从⽽得到纯种。划线法简单且较快，稀释法在培养基上分离的菌落单⼀均匀，获得纯种的概率⼤，特别适宜于分离具有蔓延性的微⽣物。采⽤单菌落分离法有时会夹杂⼀些由两个或多个孢⼦所⽣长的菌落，另外不同孢⼦的芽管间发⽣吻合，也可形成异核菌落。要克服这些缺点，就要特别重视单孢⼦悬浮液的制备⽅法。为使单孢⼦悬浮液有良好的分散度，⼒求去除菌丝断⽚或粘接在⼀起的成串的孢⼦，可采⽤如下⽅法制备单孢⼦悬浮液：① 对于细菌，因其在固体斜⾯培养基上常粘在⼀起，故要求转种到新鲜⾁汤液体中进⾏培养，以取得分散且⽣长活跃的菌体；② 对放线菌和霉菌的孢⼦，采⽤玻璃珠或⽯英砂振荡打散孢⼦后，⽤滤纸或棉花过滤；对某些黏性⼤的孢⼦，常加⼊0.05％的分散剂(如吐温80，Tween 80)以获得分散的单个孢⼦。 为了提⾼筛选⼯作效率，在纯种分离时，培养条件对筛选结果影响也很⼤，可通过控制营养成分、调节培养基pH值、添加抑制剂、改变培养温度和通⽓条件及热处理等来提⾼筛选效率。平板分离后挑选单个菌落进⾏⽣产能⼒测定，从中选出优良的菌株。 　　⑷ ⽣产性能的测定　由于纯种分离后，得到的菌株数量⾮常⼤，如果对每⼀菌株都作全⾯或精确的性能测定，⼯作量⼗分巨⼤，⽽且是不必要的。⼀般采⽤两步法，即初筛和复筛，经过多次重复筛选，直到获得1～3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和⽣产试验，进⽽作为育种的出发菌株。这种直接从⾃然界分离得到的菌株称为野⽣型菌株，以区别于⽤⼈⼯育种⽅法得到的变异菌株（亦称突变株）。 ⒉ 从⾃发突变体中获得菌株 　　⼀般微⽣物可遗传的特性发⽣变化称为变异，⼜称突变，是微⽣物产⽣变种的根源，同时也是育种的基础。⾃然突变是指在⾃然条件下出现的基因变化。⽬前，发酵⼯业中使⽤的⽣产菌种，⼏乎都是经过⼈⼯诱变处理后获得的突变株。这些突变株是以⼤量⽣成某种代谢产物(发酵产物)为⽬的筛选出来的，因⽽它们属于代谢调节失控的菌株。微⽣物的代谢调节系统趋向于最有效地利⽤环境中的营养物质，优先进⾏⽣长和繁殖，⽽⽣产菌种常常是打破了原有的代谢调节系统的突变株，因此常常表现出⽣活⼒⽐野⽣菌株弱的特点。此外，⽣产菌种是经⼈⼯诱变处理⽽筛选获得的突变株，遗传特性往往不够稳定，容易继续发⽣变异，使得⽣产菌株呈现出⾃然变异的特性，如果不及时进⾏⾃然选育，通常会导致菌种性能变化，使发酵产量降低，但也有变异使菌种获得优良性能的情况。 　　⾃发突变的频率较低，因此⾃然选育筛选出来的菌种，不能满⾜育种⼯作的需要，不完全符合⼯业⽣产的要求，如产量低、副产物多、⽣长周期长等。因⽽不能仅停留在“选”种上，还要进⾏“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以⼤⼤提⾼菌种的突变频率，扩⼤变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株，这种⽅法就称为诱变育种。诱变育种的程序　　诱变育种和其他⽅法相⽐较，⼈⼯诱变能提⾼突变频率和扩⼤变异谱，具有速度快、⽅法简便等优点，是当前菌种选育的⼀种主要⽅法，在⽣产中使⽤得⼗分普遍。但是诱发突变随机性⼤，因此诱发突变必须与⼤规模的筛选⼯作相配合才能收到良好的效果。如果筛选⽅法得当，也有可能定向地获得好的变异株。 　　诱变育种的主要环节是：① 以合适的诱变剂处理⼤量⽽均匀分散的微⽣物细胞悬浮液(细胞或孢⼦)，以引起绝⼤多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率⼤幅度提⾼；② ⽤合适的⽅法淘汰负变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的⽬的。诱变育种的程序如图4-1所⽰。 图4-1　诱变育种的程序 　　⒈ 出发菌株的选择 　　⼯业上⽤来进⾏诱变处理的菌株，称为出发菌株(parent strain)。在许多情况下，微⽣物的遗传物质具有抗诱变性，这类遗传性质稳定的菌株⽤来⽣产是有益的，但作为诱变育种材料是不适宜的。出发菌株通常有三种：① 从⾃然界分离得到的野⽣型菌株；② 通过⽣产选育，即由⾃发突变经筛选得到的⾼产菌株；③ 已经诱变过的菌株，这类菌株作为出发菌株较为复杂。⼀般认为诱变获得⾼产菌株，再诱变易产⽣负突变，再度提⾼产量⽐较困难。采⽤连续诱变的⽅法，在每次诱变之后选出3～5株较好的菌株继续诱变，如果遇到⾼产菌株再诱变进⼀步提⾼产量效果不佳时，可以先⾏杂交，再作为诱变的出发菌株，这样有可能收到⽐较好的效果。 　　⒉ 菌悬液的制备

　　采⽤⽣理状态⼀致(⽤选择法或诱导法使微⽣物同步⽣长)的单细胞或孢⼦进⾏诱变处理，这样不但能均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象的发⽣。处理前细胞尽可能达到同步⽣长状态，细胞悬液经玻璃珠振荡打散，并⽤脱脂棉或滤纸过滤，以达到单细胞状态。

⼀般处理细菌的营养细胞，采⽤⽣长旺盛的对数期，其变异率较⾼且重现性好。霉菌的菌株⼀般是多核的，因此对霉菌都⽤孢⼦悬浮液进⾏诱变，对放线菌⼀般也如此。但孢⼦⽣理活性处于休眠状态，诱变时不及营养细胞好，因此最好采⽤刚刚成熟时的孢⼦，其变异率⾼。或在处理前将孢⼦培养数⼩时，使其脱离静⽌状态，则诱变率也会增加。

　　⼀般处理真菌的孢⼦或酵母时，其菌悬液的浓度⼤约为106个／mL，细菌和放线菌的孢⼦的浓度⼤约为108个／mL。 　　⒊ 前培养

　　诱变处理前，将细胞在添加嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养20～60 min，再进⾏诱变处理，则变异率可⼤幅度提⾼。 　　⒋ 诱变

　　能诱发基因突变并使突变率提⾼到超过⾃然突变⽔平的物理化学因⼦都称为诱变剂。可分为物理诱变剂和化学诱变剂两⼤类。 　　⒌ 变异菌株的分离和筛选

　　通过诱变处理，在微⽣物群体中出现各种突变型的个体，但其中多数是负突变体。为在短时间内获得好的效果，应采⽤效率较⾼的筛选⽅案或筛选⽅法。实际⼯作中，⼀般分初筛和复筛两阶段进⾏，前者以量为主，后者以质为主。诱变育种⽅案设计

　　诱变育种⼀般采⽤物理、化学诱变因素使微⽣物DNA的碱基排列发⽣变化，以使排列错误DNA模板形成异常的遗传信息，造成某些蛋⽩结构变异，⽽使细胞功能发⽣改变。诱变育种不仅可以提⾼菌株的⽣产能⼒，⽽且还可以改进产品的质量，扩⼤品种，简化⼯艺。在科学实验和⽣产上都得到了⼴泛应⽤。⽬前应⽤于⼯业化的⽣产菌⼏乎毫⽆例外地都是经过诱变的改良菌种。

　　按照⽣产的要求，根据⽣物的遗传和变异的理论，⽤⼈⼯的⽅法造成菌种变异，再经过筛选，⽽达到菌种选育的⽬的。即就是通过诱变改善菌种的特性，获得优良菌株。

诱变育种⽅案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变⾼产基因的表现。这些环节是相互联系，缺⼀不可的。在诱变育种的早期阶段，⼯作⼀般是顺利的，⾼产突变株不断涌现。但经过长期诱变得到的⾼产突变株，再进⼀步提⾼时，进展逐渐变慢，困难也越来越多。因此，应在早期周密地设计⼀个选育⼯作⽅案。

　　诱发突变有可能出现多种多样变异性突变株。除了⾼产性状外，还要考虑其他有利性状。例如，⽣长速度快、产孢⼦多；消除某些⾊素或⽆益组分；能有效利⽤廉价发酵原材料；改善发酵⼯艺中某些缺陷(如泡沫过多、对温度波动敏感、菌丝量太多、⾃溶早、过滤困难等)。但是所定的筛选⽬标不可太多，要充分估计⼈⼒、物⼒和测试能⼒等，要考虑实现这些⽬标的可能性。要选出⼀个达到⼀定产量的⾼产菌株，往往要筛选数千个左右的突变株，经历多次诱变和筛选，才能达到⽬的。 　　㈠ 突变的诱发

　　诱变剂所造成的DNA分⼦的某⼀位置的结构改变称为前突变。例如紫外线照射形成的胸腺嘧啶⼆聚体就是⼀种前突变。前突变可以通过影响DNA复制⽽成为真正的突变，也可以经过修复重新回到原有的结构，即不发⽣突变。许多环境因素可以影响突变的诱发过程，从⽽影响突变率。以下将讨论从诱变剂进⼊细胞到突变型出现的整个过程以及影响这⼀过程的⼀些因素。 　　⒈ 诱变剂接触DNA分⼦

　　诱变剂要进⼊细胞才能诱发突变，因此细胞对诱变剂的透性将影响诱变结果。诱变剂在接触DNA之前要经过细胞质，细胞质的某些组分和某些酶可和诱变剂相互作⽤⽽影响诱变效果。 　　突变的诱发还和基因所处的状态有关，⽽基因的状态⼜和培养条件有关。在培养基中加⼊诱导剂使基因处于转录状态，可能有利于诱变剂的作⽤。据认为在转录时，DNA双链解开更有利于诱变作⽤。

　　⒉ DNA损伤的修复

　　DNA损伤的修复和基因突变有着密切的关系。已发现微⽣物有五种修复DNA损伤⽅式，它们是：光复活作⽤、切补修复、重组修复、SOS修复系统、DNA多聚酶的校正作⽤。

图4-2　三种DNA修复作⽤ 　　⑴ 光复活作⽤　⼈们发现某些经紫外线照射过的放线菌孢⼦，如果在可见光下培养时，存活数明显⼤于在⿊暗中培养的同⼀样品。经研究证明这是有⼀种为可见光所激活的酶在起作⽤。这种酶能和经紫外线照射过的DNA在⿊暗中结合，形成的复合物置于可见光下，酶和DNA解离，解离下来的DNA分⼦中不再存在原来的胸腺嘧啶⼆聚体。见图4-2(a)。 　　⑵ 切补修复　切补修复是在四种酶的协同作⽤下进⾏DNA损伤修复，这四种酶都不需要可见光的激活。⾸先在胸腺嘧啶⼆聚体5’端，在核酸内切酶的作⽤下造成单链断裂；其次在核酸外切酶的作⽤下切除胸腺嘧啶⼆聚体；然后在DNA多聚酶Ⅰ、Ⅲ的作⽤下进⾏修补合成；最后在DNA连接酶的作⽤下形成⼀个完整的双链结构。见图4-2 (b)。 　　⑶ 重组修复　重组修复必须在DNA进⾏复制的情况下进⾏，所以⼜称为复制后修复。重组修复是在不切除胸腺嘧啶⼆聚体的情况下进⾏修复作⽤。以带有⼆聚体的单链为模板合成互补单链，可是在每⼀个⼆聚体附近留下⼀个空隙。⼀般认为通过染⾊体交换，空隙部位就不再⾯对着⼆聚体，⽽是⾯对着正常的单链，在这种情况下，DNA多聚酶和连接酶就能把空隙部位修复好。见图4-2 (c)。 　　⑷ SOS修复系统　这是⼀种能够造成误差修复的“呼救信号”修复系统。当DNA受到诱变剂损伤⽽阻断DNA复制过程时，DNA损伤相当于⼀个呼救信号，促使细胞中的有关酶系解除阻遏，⽽进⾏DNA的修复。在修复过程中，DNA多聚酶在⽆模板的情况下进⾏DNA的修复合成，并将合成的DNA⽚段插⼊受损DNA的空隙处。SOS修复系统的修复作⽤容易导致基因突变，⼤多数经诱变所获得的突变来源于此修复系统的作⽤。 　　⑸ DNA多聚酶的校正作⽤　除了上述种种修复作⽤以外，细胞还具有对复制过程中出现差错加以校正的功能。⼤肠杆菌中DNA的复制依赖于三种DNA多聚酶(多聚酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的作⽤，这三种酶除了对于多核苷酸的多聚作⽤以外，还具有3’到5’核酸外切酶的作⽤。⼀般认为依靠DNA多聚酶的这⼀作⽤，能在复制过程中随时切除不正常的核苷酸。如果DNA多聚酶发⽣突变⽽使其核酸外切酶活性减弱，那么，它切除不正常核苷酸的能⼒减弱，菌体的突变率相应地提⾼，成为增变突变型。DNA多聚酶为DNA修复作⽤所必需，所以增变突变型对于诱变剂的作⽤格外敏感。 　　⒊ 从前突变到突变 　　前突变形成后，细胞中⼏种修复系统就会对它施加作⽤。从对突变诱发的影响看，修复系统可以分为校正差错和引起差错这两类。⼀般认为光复活作⽤、切补修复和DNA多聚酶校正作⽤这三种修复作⽤具有校正差错的性质⽽不利于突变的诱发，⽽重组修复和SOS修复系统这两种修复作⽤具有引起差错的性质⽽有利于突变的发⽣。 　　可以认为，⼀切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由前突变到突变这⼀过程。例如，咖啡碱能抑制切补修复系统，因⽽增强诱变作⽤；氯霉素能抑制细菌的蛋⽩质合成，从⽽抑制了依赖于蛋⽩质合成的SOS修复系统和重组修复，降低诱变率。相反地，⼀切有利于蛋⽩质合成的因素都有利于提⾼突变率。 　　与突变有关的⼀些酶的激活剂或抑制剂也会影响突变率。Ba2+对DNA多聚酶的3’核酸外切酶活性有抑制作⽤，从⽽可提⾼突变率。 　　从上述可以看出，诱变前后的处理可影响诱变的效果。其原因主要有两⽅⾯：⼀是通过影响与DNA修复作⽤有关的酶活性⽽影响诱变的效果；⼆是通过使诱变的⽬的基因处于活化状态(复制或转录状态)，使之更容易被诱变剂所作⽤，从⽽影响⽬的基因的突变率。 　　⒋ 从突变到突变表型 　　突变基因的出现并不等于突变表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型迟延。表型迟延有两种原因：分离性迟延和⽣理性迟延。 　　⑴ 分离性迟延　分离性迟延实际上是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态(野⽣型的基因和突变型的基因并存于同⼀细胞中)，突变型基因由于属于隐性基因⽽暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态(⼀细胞中只有突变型基因，没有野⽣型基因)时，其性状才得以表达。 　　⼤肠杆菌在对数⽣长期含有2～4个核质体，当其中⼀个核发⽣突变时，这个细胞变成异核体。如果突变表型表现为某个基因所控制的产物的丧失，那么这⼀突变在异核体内就是隐性的。因为其他的核继续⽣产该基因控制的产物。需要经历1～2个世代，通过细胞⽽出现同⼀细胞的所有核中都带有这⼀突变基因时，突变表型才出现。 　　⑵ ⽣理性迟延　突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不⼀定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某⼀程度后才能表现出来。⽽这些原有基因产物的浓度降低到能改变表型的临界⽔平以前，细胞已经多次，经过了好⼏个世代。例如某个产酶基因发⽣了突变，可是细胞中原有的酶仍在起作⽤，细胞所表现的仍是野⽣型表型。只有通过细胞，原有的酶已经⾜够稀释或失去活性时，才出现突变型的表型。⽣理性迟延最明显的例⼦是噬菌体抗性突变的表达。⽤诱变剂处理噬菌体敏感菌，将存活菌体⽴即分离在含噬菌体的培养基上，其抗性菌株不⽴即出现。⽽将存活菌先在不含噬菌体的培养基中繁殖⼏代后，再分离后接到含有噬菌体的培养基中，则可得到⼤量抗性菌。有些诱发突变要经历⼗⼏个世代才能表达。敏感菌对某⼀些噬菌体敏感是因为其细胞表⾯具有该噬菌体的受体，抗性菌因不产⽣该受体⽽对噬菌体具有抗性。但是基因发⽣了抗性突变⽽细胞表⾯具有受体的细胞仍会受到噬菌体的感染，抗性突变的表型必须等到经过多次细胞分离，细胞表⾯不再存在有受体时才能表现出来。 　　㈡ 诱变剂的种类及选择 　　⒈ 诱变剂 　　物理诱变剂主要为各种射线，如紫外线、X射线、α射线、β射线、γ射线和超声波等，其中以紫外线应⽤最⼴，紫外光谱作⽤光谱正好与细胞内的核酸的吸收光谱相⼀致，因此在紫外光的作⽤下能使DNA链断裂、DNA分⼦内和分⼦间发⽣交联形成嘧啶⼆聚体，从⽽导致菌体的遗传性状发⽣改变。 　　化学诱变剂的种类较多，常⽤的有甲基磺酸⼄酯(EMS)、亚硝基胍、亚、氮芥等。它们作⽤于微⽣物细胞后，能够特异地与某些基团起作⽤，即引起物质的原发损伤和细胞代谢⽅式的改变，失去亲株原有的特性，并建⽴起新的表型。所谓“表型”是指某⼀⽣物个体能够观察到的特殊性状。所谓“基因型（遗传型）”是指某⼀⽣物个体所含有的全部遗传因⼦（即基因组）所携带的遗传信息。 　　诱变剂亚硝基胍和甲基磺酸⼄酯虽然诱变效果好，但由于多数引起碱基对转换，得到的变异株回变率⾼。电离辐射、紫外线和吖啶类等诱变剂，能引起缺失、阅读密码组移动等巨⼤损伤，则不易产⽣回复突变。诱变处理剂量的选择是⼀个⽐较复杂的问题，⼀般正突变较多出现在偏低剂量中，⽽负突变则较多地出现于偏⾼剂量中。对于经过多次诱变⽽提⾼了产量的菌株，在较⾼剂量负突变率更⾼。因此，⽬前处理量已从以前采⽤的死亡率90％～99％减低为死亡率70％～80％。各种化学诱变剂常⽤的剂量和处理时间如表4-1。 表4-1　各种化学诱变剂常⽤的剂量、处理时间 　　诱变剂的选择主要是根据已经成功的经验，诱变作⽤不但决定于诱变剂，还与菌种的种类和出发菌株的遗传背景有关。⼀般对遗传上不稳定的菌株，可采⽤温和的诱变剂，或采⽤已见效果的诱变剂；对于遗传上较稳定的菌株则采⽤强烈的、不常⽤的、诱变谱⼴的诱变剂。要重视出发菌株的诱变系谱，不应常采⽤同⼀种诱变剂反复处理，以防⽌诱变效应饱和；但也不要频频变换诱变剂，以避免造成菌种的遗传背景复杂，不利于⾼产菌株的稳定。 　　选择诱变剂时，还应该考虑诱变剂本⾝的特点。例如紫外线主要作⽤于DNA分⼦的嘧啶碱基，⽽亚则主要作⽤于DNA分⼦的嘌呤碱基。紫外线和亚复合使⽤，突变谱宽，诱变效果好。 　　⒉ 影响诱变效果的因素 　　除了出发菌株的遗传特性和诱变剂会影响诱变效果之外，菌种的⽣理状态、被处理菌株的预培养和后培养条件以及诱变处理时的外界条件等都会影响诱变效果。 菌种的⽣理状态与诱变效果有密切关系，例如有的碱基类似物、亚硝基胍(NTG)等只对中的DNA有效，对静⽌的或休眠的孢⼦或细胞⽆效；⽽另外⼀些诱变剂，如紫外线、亚、烷化剂、电离辐射等能直接与DNA起反应，因此对静⽌的细胞也有诱变效应，但是对中的细胞更有效。因此，放线菌、真菌的孢⼦诱变前经培养稍加萌发可以提⾼诱变率。 诱变处理前后的培养条件对诱变效果有明显的影响。可在培养基中添加某些物质(如核酸碱基、咖啡因、氨基酸、氯化锂、重⾦属离⼦等等)来影响细胞对DNA损伤的修复作⽤，使之出现更多的差错，⽽达到提⾼诱变率的⽬的。例如菌种在紫外线处理前，在富有核酸碱基的培养基中培养，能增加其对紫外线的敏感性。相反，如果菌种在进⾏紫外线处理以前，培养于含有氯霉素(或缺乏⾊氨酸)的培养基中，则会降低突变率。紫外线诱变处理后，将孢⼦液分离于富有氨基酸的培养基中，则有利于菌种发⽣突变。 　　诱变率还受到其他外界条件，例如温度、氧⽓、pH值、可见光等的影响。 　　㈢ 出发菌株的选择 　　突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的⽣理状态以及诱变处理时环境条件的影响。出发菌株的选择是诱变育种⼯作成败的关键。出发菌株的性能，如菌种的系谱、菌种的形态、⽣理、传代、保存等特性，对诱变效果影响很⼤。挑选出发菌株应考虑如下⼏点。 　　① 选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体（表型相同，基因型不同）的影响。从宏观上讲，就是要选择发酵产量稳定、波动范围⼩的菌株为出发菌株。如果出发菌株遗传性不纯，可以⽤⾃然分离或⽤缓和的诱变剂进⾏处理，取得纯种作为出发菌株。这样虽然要花⼀些时间，但效果更好。 　　② 选择出发菌株，不仅是选产量⾼的，还应该考虑其他因素。如产孢⼦早⽽多，⾊素多或少，⽣长速度快等有利于合成发酵产物的性状。特别重要的是选择的出发菌株应当具有我们所需要的代谢特性。例如，适合补料⼯艺的⾼产菌株是从糖、氮代谢速度较快的出发菌株得来的。⽤⽣活⼒旺盛⽽发酵产量⼜不很低的形态回复突变株作为出发菌株，常可收到好的效果。 　　③ 选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株，不但可以提⾼变异频率，⽽且⾼产突变株的出现率也⼤。⽣产中经过长期选育的菌株，有时会对诱变剂不敏感。在此情况下，应设法改变菌株的遗传型，以提⾼菌株对诱变剂的敏感性。杂交、诱发抗性突变和采⽤⼤剂量的诱变剂处理均能改变菌株的遗传性⽽提⾼菌株对诱变剂的敏感性。 　　㈣ 筛选的⽅法 　　⒈ 制定筛选⽅案 图4-3　诱变筛选的典型流程 　　⽅案设计的中⼼内容是确定诱变筛选流程，流程⽰意如图4-3。整个流程可按诱变和筛选两部分说明如下。 　　由出发菌种开始，制出新鲜孢⼦悬浮液(或细菌悬浮液)作诱变处理，然后以⼀定稀释度涂布平⽫，⾄平⽫上长出单菌落为⽌的各步骤为诱变过程。出发菌种的斜⾯⾮常重要。其培养⼯艺最好是经过试验已知的最佳培养基和培养条件。要选取对诱变剂最敏感的斜⾯种龄，要求孢⼦数适中⽽新鲜。在平⽫内倾⼊10 mL左右的培养基，凝固后，加⼊⼀定量经诱变处理的孢⼦液，⽤涂布器涂匀后进⾏单菌落分离培养。

　　筛选过程主要包括传种斜⾯、菌株保藏和筛选⾼产菌株这三项⼯作。长出单菌落后，随机挑选单菌落进⾏⽣产能⼒测定。每⼀被挑选的单菌落传种斜⾯后，再由斜⾯接⼊模拟发酵⼯艺的摇瓶中培养，然后测定其⽣产能⼒。挑选⽣长良好的正常形态的菌落传种斜⾯，还可适当挑选少数形态或⾊素有变异的菌落。经诱变处理，形态严重变异的往往为低产菌株。经筛选挑出⽐对照⽣产能⼒⾼10％以上的菌株，要制成砂⼟管或冷冻管留种保藏。这⼀步⾮常重要，可保证⾼产菌株不会得⽽复失。诱变处理前后孢⼦要计数，以控制处理液的孢⼦数和统计诱变致死率，常⽤于处理的孢⼦液浓度为105～l08个／mL。孢⼦计数采⽤⾎球计数法在显微镜下直接计数。致死率是通过处理前后孢⼦液活菌计数来测定。 　　⒉ 营养缺陷型的筛选⽅法

　　营养缺陷型（auxotroph）是指原菌株由于发⽣基因突变，致使合成途径中某⼀步骤发⽣缺陷，从⽽丧失了合成某些物质的能⼒，必须在培养中外源补加该营养物质才能⽣长的突变型菌株。原养型（prototroph）⼀般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产⽣的菌株，其营养要求在表型上与野⽣型（wild type）相同，如能在基本培养基（MM）上⽣长，但基因型不⼀定相同。

　　营养缺陷型的筛选，⼀般是经诱变后，再经中间培养、淘汰野⽣型、检出营养缺陷型、确定⽣长谱等步骤。中间培养的⽬的是减少以后筛选中再产⽣分离⼦，其培养基是完全培养基（CM）或补充培养基（SM），并且培养过夜。淘汰野⽣型菌株的⽅法有：抗⽣素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。其⽬的在于浓缩缺陷型菌株。当诱变后的缺陷型数量较⼤时，也可省去中间培养和淘汰野⽣型等过程。营养缺陷菌株的检出⽅法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。经过检出确定为营养缺陷型菌株之后，尚需进⼀步确定它的缺陷型是氨基酸、维⽣素，还是嘌呤、嘧啶缺陷型。

　　经过平⽫初筛，确定营养缺陷或其他标记的变异性状后，即可进⾏发酵试验，检查其⽣产性状，经过⽣产性状⽐较，再平⾏试验⽐较，并结合⽣产的其他因素考虑，可确定⽤于⽣产或进⼀步改良诱变的菌株，进⾏保藏或扩⼤试验，直⾄⽤于⽣产等。 　　⒊ 突变株的筛选

　　诱变处理后的孢⼦传种斜⾯后，进⾏⽣产能⼒测试筛选。为了获得优良菌株，初筛菌株的量要⼤，发酵和测试的条件都可粗放⼀些。例如可以采⽤琼脂块筛选法进⾏初筛，也可以采⽤⼀个菌株进⼀个摇瓶的⽅法进⾏初筛。随着以后⼀次⼀次的复筛，对发酵和测试条件的要求应逐步提⾼，复筛⼀般每个菌株进3～5个摇瓶，如果⽣产能⼒继续保持优异，再重复⼏次复筛。初筛和复筛均需有亲株作对照以⽐较⽣产能⼒是否优良。复筛后，对于有发展前途的优良菌株，可考察其稳定性、菌种特性和最适培养条件等。真正的⾼产菌株，往往需要经过产量提⾼的逐步累积过程，才能变得越来越明显。所以有必要多挑选⼀些出发菌株进⾏多步育种，以确保挑选出⾼产菌株。

　　根据形态变异淘汰低产菌株。突变⼀旦发⽣，突变细胞能够把突变的性状遗传给⼦代。如果诱变处理确实有效的话，在⼀定的培养基上，很容易发现⼀些菌落的性状或⾊泽等和亲代菌株不同，这可作为诱变效果的定性指标。某些菌落形态与⽣产性能有直接的相关性，可采取在平⽫直接筛选。如在灰黄霉素⽣产菌的选育中，菌落暗红⾊变深者，产量就提⾼。但就⽬前的研究，多数变异其菌落外观形态与⽣理的相应关系尚未完全清楚。

　　根据平⽫直接反应挑取⾼产菌株。所谓平⽫直接反应是指每个菌落产⽣的代谢产物与培养基内的指⽰物作⽤后的变⾊圈或透明圈等。因其可表⽰菌株的⽣产活⼒⾼低，所以可以作为初筛的标志，常⽤的有纸⽚培养显⾊法、透明圈法、琼脂⽚法、深度梯度法。菌体细胞经诱变剂处理后，要从⼤量的变异菌株中，把⼀些具有优良性状的突变株挑选出来，这需要有明确的筛选⽬标和筛选⽅法，需要进⾏认真细致的筛选⼯作。育种⼯作中常采⽤随机筛选和理性化筛选这两种筛选⽅法。

　　⑴ 随机筛选　随机筛选即菌种经诱变处理后，进⾏平板分离，随机挑选单菌落，从中筛选⾼产菌株。为了提⾼筛选效率，可采⽤下列⽅法增⼤筛选量。

　　① 摇瓶筛选法。这是⽣产上⼀直使⽤的传统⽅法。即将挑出的单菌落传种斜⾯后，再由斜⾯接⼊模拟发酵⼯艺的摇瓶中培养，然后测定其发酵⽣产能⼒。选育⾼产菌株的⽬的是要在⽣产发酵罐中推⼴应⽤，因此，摇瓶的培养条件要尽可能和发酵⽣产的培养条件相近。但是，实际上摇瓶培养条件很难和发酵罐培养条件相同。摇瓶筛选的优点是培养条件与⽣产培养条件相接近。但⼯作量⼤、时间长、操作复杂。

　　② 琼脂块筛选法。这是⼀种简便、迅速的初筛⽅法。将单菌落连同其⽣长培养基(琼脂块)⽤打孔器取出，培养⼀段时间后，置于鉴定平板以测定其发酵产量。琼脂块筛选法的优点是操作简便、速度快。但是，固体培养条件和液体培养条件之间是有差异的，利⽤此法所取得的初筛结果必须经摇瓶复筛加以验证。

　　③ 筛选⾃动化和筛选⼯具微型化。近年来，在研究筛选⾃动化⽅⾯有很⼤进展，筛选实验实现了⾃动化和半⾃动化，省去了繁琐的劳动，⼤⼤提⾼了筛选效率。筛选⼯具的微型化也是很有意义的，例如将⼀些⼩瓶⼦取代现有的发酵摇瓶，在固定框架中振荡培养，可使操作简便，⼜可加⼤筛选量。

　　⑵ 理性化筛选　传统的菌种选育是采⽤随机筛选的⽅法。由于正变异株出现的⼏率⼩，产量提⾼的范围往往在⽣物学波动的范围内，因⽽选出⼀株⾼产菌株需要耗费⼤量的⼈⼒、物

⼒。⽽且，随着发酵产量不断提⾼，⽤随机筛选⽅法获得⾼产菌株的⼏率越来越⼩。近年来，随着遗传学、⽣物化学知识的积累，⼈们对于代谢途径、代谢机制了解得更多，因⽽筛选⽅法逐渐从随机筛选转向理性化筛选。理性化筛选是指运⽤遗传学、⽣物化学的原理，根据产物已知的或可能的⽣物合成途径、代谢机制和产物分⼦结构来进⾏设计和采⽤⼀些筛选⽅法，以打破微⽣物原有的代谢机制，获得能⼤量形成产物的⾼产突变株。微⽣物的代谢产物不同，其筛选⽅法也有所不同。 　　① 初级代谢产物⾼产菌株的筛选。根据代谢的机理，氨基酸、核苷酸、维⽣素等⼩分⼦初级代谢产物的合成途径中普遍存在着反馈阻遏或反馈抑制，这对于⽣产菌本⾝是有意义的，因为可以避免合成过多的代谢物⽽造成能量的浪费。 表4-2　反馈阻遏与反馈抑制的⽐较 　　酶活性的抑制包括竞争性抑制和反馈抑制。反馈抑制是指反应途径中某些中间产物或末端产物对该途径中前⾯反应的影响。凡使反应加速的称为正反馈，凡使反应减速的称为负反馈。酶活性的调节机制可⽤Monod提出的变构酶学说予以说明。 末端产物的反馈抑制普遍存在于合成途径。有两种似上的末端产物的分⽀代谢途径的反馈抑制，作⽤机制较复杂，其调节⽅式见图4-4。 图4-4　反馈抑制模式图 　　(a) 协同反馈抑制　此种抑制作⽤的特点是分⽀途径的⼏种末端产物同时过量时才抑制共同途径中的第⼀个酶活性。如⾕氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)合成天冬氨酸族氨基酸时，天冬氨酸激酶受到赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。 　　(b) 累积反馈抑制　此种抑制作⽤的特点是每⼀种末端产物按⼀定百分率单独抑制共同途径中第⼀个酶活性。各种产物间既⽆协同效应，⼜⽆拮抗作⽤。它们抑制的酶，有的是同功酶(能催化同⼀种⽣化反应，但酶分⼦结构有所不同的⼀组酶)，有的是多功能酶(指结构上仅为⼀种多肽，但却具有两种或两种以上催化活⼒的酶蛋⽩)。如⾕氨酰胺合成酶受到⼋种末端产物的累积反馈抑制。 　　(c) 增效反馈抑制　其特点是代谢途径中任何⼀种末端产物过量时，仅部分抑制共同反应途径中的第⼀个酶活性，但是两个末端产物同时过量时，其抑制作⽤可超过各产物存在的抑制能⼒的总和。此种调节⽅式发现在6-氨基嘌呤核苷酸和6-酮基嘌呤核苷酸⽣物合成途径。两类核苷酸各⾃都能部分地抑制磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶的活性。⽽6-氨基和6-酮基嘌呤核苷酸混合物(GMP+AMP或AMP+IMP)对该酶有强烈地抑制作⽤。 　　(d) 顺序反馈抑制　每个分⽀末端产物抑制分⽀后的第⼀个酶，产⽣部分抑制作⽤。如枯草杆菌合成芳⾹族氨基酸时的反馈抑制作⽤。但是，在⼯业⽣产中，需要⽣产菌产⽣⼤量的氨基酸、核苷酸、维⽣素等产物。因此，需要打破微⽣物原有的反馈调节系统。育种⼯作要达到此⽬的，可从以下两个⽅⾯着⼿。 　　Ⅰ 降低终产物浓度 　　(a) 筛选终产物营养缺陷型　如图4-5所⽰。在图4-5中，假设所需要的发酵产物是C，⽽该⽣物合成途径的终产物是E，则可筛选E的营养缺陷型；如果营养缺陷型是由C→D的代谢被阻断，则可解除终产物E对发酵产物C合成的反馈阻遏或反馈抑制，⽽积累⼤量的发酵产物C。 图4-5　在简单的代谢途径中积累中间产物 图4-6　赖氨酸的⼤量⽣成 　　实例见图4-6。在⾕氨酸棒杆菌的原始菌株中，赖氨酸和苏氨酸协同反馈抑制天冬氨酸激酶，获得了⼀个缺少⾼丝氨酸脱氢酶的突变株。它的⽣长需要苏氨酸和蛋氨酸。如果苏氨酸以⽣长的浓度加⼊时，协同反馈抑制被打破⽽⼤量产⽣赖氨酸，⾕氨酸棒杆菌的双氢吡啶⼆羧酸合成酶对赖氨酸的反馈抑制不敏感。 　　总之，筛选终产物营养缺陷型适合于下⾯三种情况：发酵产物为某⼀直线合成途径的中间产物如图4-5所⽰；发酵产物为某⼀分枝合成途径的中间产物；发酵产物为某⼀分枝合成途径的⼀个终产物时，可筛选该分枝合成途径的另⼀终产物的营养缺陷型，如图4-6所⽰。 　　(b) 筛选细胞膜透性改变的突变株　使之⼤量分泌排出终产物，以降低细胞内终产物浓度，从⽽避免终产物反馈调节。例如，⽤⾕氨酸棒杆菌的⽣物素营养缺陷型(biotin deficiency)进⾏⾕氨酸发酵，⽣物素是合成脂肪酸所必需的，⽽脂肪酸⼜是组成细胞膜类脂的必要成分。该缺陷型在⽣物素处于限量的情况下，不利于脂肪酸的合成，因⽽使细胞膜的渗透性发⽣变化，有利于将⾕氨酸透过细胞膜分泌⾄胞外的发酵液中。如果使⽤油酸缺陷型菌株或者⽢油缺陷型菌株，即使在⽣物素过量的条件下，也可使⾕氨酸在胞外⼤量积累。 　　Ⅱ 筛选抗反馈突变菌株 　　(a) 筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株　分离抗反馈突变株的最常⽤的⽅法是⽤与代谢产物结构类似的化合物(结构类似物)处理微⽣物细胞群体，杀死或抑制绝⼤多数细胞，选出能⼤量产⽣该代谢物的抗反馈突变株。结构类似物⼀⽅⾯具有和代谢物相似的结构，因⽽具有和代谢物相似的反馈调节作⽤，阻碍该代谢物的⽣成；另⼀⽅⾯它不同于代谢物，不具有正常的⽣理功能，对细胞的正常代谢有阻碍作⽤，会抑制菌的⽣长或导致菌的死亡。例如，⼀种氨基酸终产物，在正常的情况下，参与蛋⽩质合成，过量时可抑制或阻遏它⾃⾝的合成酶类。如果这种氨基酸的结构类似物也显⽰这种抑制或阻遏，但却不能⽤于蛋⽩质的合成，那么当⽤这种结构类似物处理菌株时，⼤多数细胞将由于缺少该种氨基酸⽽不能⽣长或者死亡，⽽那些对该结构类似物不敏感的突变株，仍然能够合成该种氨基酸⽽继续⽣长。某些菌株所以能抵抗这种结构类似物，是因为被该氨基酸(或结构类似物)反馈抑制的酶的结构发⽣了改变(抗反馈抑制)，或者被阻遏的酶的⽣成系统发⽣了改变(抗反馈阻遏)。由于突破了原有的反馈调节系统，这些突变株就可产⽣⼤量的该种氨基酸。 　　例如选育L-精氨酸（L-Arg）⾼产菌株，可采⽤筛选结构类似物D-Argr菌株的⽅法（⼀般⽂献中采⽤上标“r”表⽰抗性，“s”表⽰敏感型）。 　　(b) 利⽤回复突变筛选抗反馈突变菌株　经诱变处理出发菌株，先选出对产物敏感的营养缺陷型，再将营养缺陷型进⾏第⼆次诱变处理得到回复突变株。筛选的⽬的不是要获得完全恢复原有状态的回复突变株，⽽是希望经过两次诱发突变，所得的回复突变株有可能改变了产物合成酶的调节部位的氨基酸的顺序，使之不能和产物结合，因⽽不受产物的反馈抑制。例如，⾕氨酸棒杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从⽽提⾼了鸟苷酸的产量。 　　② 次级代谢产物(主要是抗⽣素)⾼产菌株的筛选。次级代谢是某些⽣物为了避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作⽤⽽产⽣的⼀类有利于⽣存的代谢类型。初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制，次级代谢产物的合成同时还受到核外遗传物质——质粒的控制，有⼈将这种代谢产物叫做质粒产物。次级代谢有不同于初级代谢的特点，因此其筛选⽅法也和初级代谢略有不同。次级代谢产物不是菌体⽣长、繁殖所必需的，往往不能简单地采⽤筛选营养缺陷型或结构类似物抗性菌株的⽅法来获得⾼产菌株。 　　次级代谢⼜受到初级代谢的调节，次级代谢和初级代谢有⼀些共同的中间产物，这些中间产物可以进⽽合成初级代谢产物，也可以进⽽合成次级代谢产物，这取决于菌的遗传特性和⽣理状态，这些中间产物叫做分叉中间体。微⽣物的代谢调节系统趋向于平衡地利⽤营养物质，当环境中某些营养物质过剩，⽽某些营养物质缺乏时，菌体不能有效的摄⼊营养，在代谢调节系统作⽤下，菌的⽣长繁殖速率下降，并通过代谢途径的改变将过剩的营养物质转变成与⽣长繁殖⽆关的次级代谢产物。因此，可筛选某些营养缺陷型或初级代谢产物结构类似物抗性菌株以消除初级代谢产物对那些共同中间产物的反馈调节，使之⼤量积累⽽有利于次级代谢产物的合成。⼤多数菌株在被快速利⽤的碳、氮、磷源消耗⾄⼀定程度时才产⽣有活性的次级代谢酶，因此筛选解除分解代谢调节突变株，可以获得⾼产菌。 　　次级代谢产物⾼产菌株的筛选⽅法如下： 　　(a) 利⽤营养缺陷型筛选。抗⽣素产⽣菌的营养缺陷型⼤多为低产菌株，但是如果某些次级代谢和初级代谢处于同⼀分枝合成途径时，筛选初级代谢产物的营养缺陷型常可使相应的次级代谢产物增产。例如，芳⾹族氨基酸营养缺陷型可能增产氯霉素，芳⾹族氨基酸和氯霉素的⽣物合成途径中有⼀个共同的中间代谢物莽草酸，当诱变处理使莽草酸→芳⾹族氨基酸的⽣物合成出现遗传性阻碍时，菌体不能够合成芳⾹族氨基酸，从⽽避免了芳⾹族氨基酸对莽草酸⽣物合成的反馈调节，莽草酸得以⼤量合成，进⽽合成⼤量的氯霉素。同样的道理，脂肪酸和制霉菌素、四环素、灰黄霉素有共同的中间代谢物丙⼆酰CoA，脂肪酸营养缺陷型可以增产上述的抗⽣素。类似的例⼦还有头孢菌素产⽣菌的亮氨酸营养缺陷型可增产头孢菌素C，亮氨酸和缬氨酸有共同的中间代谢物α-酮基异戊酸，亮氨酸营养缺陷型使得缬氨酸的⽣成量增加，缬氨酸作为头孢菌素C合成的前体物质，参与头孢菌素C母核的合成，所以亮氨酸营养缺陷型可以提⾼头孢菌素C的发酵产量。⼀般来说，氨基酸营养缺陷不适合⼯业发酵⽣产的要求，将这种氨基酸营养缺陷型和⽣产菌株(或另⼀种营养缺陷型)杂交或者回复突变，可能得到适合于⼯业⽣产的⾼产菌株。因为这样的杂交后代或回复突变株，可能既保留了营养缺陷型的代谢优点(⽣成较多的抗⽣素前体)，⼜便于发酵⽣产的控制(不需要另外补充相应的营养物质)。⽽且，还可能通过杂交或回复突变获得具有和抗⽣素合成有关的基因的部分⼆倍体。 　　筛选渗漏缺陷型是⼀种值得重视的⽅法。所谓渗漏缺陷型(leaky mutant)是遗传性障碍不完全的营养缺陷型。突变使某⼀种酶的活性下降⽽不是完全丧失，所以这种缺陷型能够少量地合成某⼀代谢产物，能在基本培养基上少量地⽣长。由于渗漏缺陷型不会合成过多的终产物，所以不会造成反馈调节⽽影响中间代谢物的积累。⼤多数抗⽣素⾼产菌株的⽣长速率低于野⽣型菌株的⽣长速率，似乎可以认为它们在某种意义上属于渗漏缺陷型，⽣长速率降低可能有利于抗⽣素合成。⼀般⽂献中采⽤上标“-”表⽰营养缺陷型，上标“L”表⽰渗漏缺陷型，例如：Met-+ThrL表⽰甲硫氨酸缺陷和苏氨酸渗漏。 　　根据以上的推理，可设计如下筛选过程：先进⾏摇瓶发酵试验，选出对抗⽣素发酵产量有明显影响的初级代谢产物，据此诱变出相应的营养缺陷型，然后再诱发回复突变或将野⽣型菌株诱变成另⼀营养缺陷型，再与之杂交。如欲筛选渗漏缺陷型，则把营养缺陷型接种在基本培养基上，这上⾯出现的菌落是回复突变株，其中长得特别⼩的菌落可能是渗漏缺陷型。 　　(b) 筛选负变株的回复突变株。选择经过诱变处理后抗⽣素⽣产能⼒明显降低或完全丧失，但其他性状仍近于正常的突变株作为实验材料，进⾏诱变，再挑选⾼产菌株。因为两次诱变都作⽤于和抗⽣素⽣物合成有关的基因上，动摇了抗⽣素合成的遗传基础。⽤此⽅法得到的突变株，其与抗⽣素合成有关的酶受调节的程度，往往低于原出发菌株。此外，从负变株中筛选回复突变株也⽐较容易，因为负变株没有发酵产量或发酵产量很低，便于从中检出有较⾼抗⽣素产量的回复突变株。 　　(c) 筛选去磷酸盐调节突变株。磷酸盐对许多抗⽣素的⽣物合成有抑制作⽤，筛选去磷酸盐调节突变株对于⽣产抗⽣素是很有意义的。因为要提⾼抗⽣素的产量，既要使⽣产菌⽣长到⼀定的量，⼜要使产⽣较多的抗⽣素。这样培养基中必须加⼊⼀定量的磷酸盐，以供菌体⽣长的需要，但菌体⽣长所需要的磷酸盐浓度往往对抗⽣素有抑制作⽤，去磷酸盐调节突变株可消除或减弱这种抑制作⽤以获得⾼产。 　　筛选能在磷酸盐抑制浓度条件下，正常产⽣抗⽣素的突变株的过程：将孢⼦悬浮液诱变处理后，将孢⼦接种于完全培养基上，使突变株得以表达，再把完全培养基上的菌落影印接种于发酵培养基(含正常浓度的磷酸盐、加琼脂)，待菌落长出后，⽤打孔器把长有单个菌落的琼脂块转移到⼀张浸有⾼浓度磷酸盐的滤纸上培养、发酵，然后进⾏⽣物测定。抑菌活⼒(抑菌圈直径／菌落直径)明显⼤于其他菌落的可能就是去磷酸盐调节突变株，从影印平板挑取相应的菌落，摇瓶发酵测定抗⽣素产量。 　　筛选磷酸盐结构类似物(如砷酸盐、钒酸盐)抗性突变株的过程：磷酸盐结构类似物对菌体结构具有毒性，其抗性菌株可能对磷酸盐调节不敏感。例如，钒酸钠是⼀种ATP酶的抑制剂，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)细胞内有两种磷酸盐转运系统：⼀是低亲和⼒的磷酸盐转运系统Ⅰ，⼀是⾼亲和⼒的磷酸盐转运系统Ⅱ。钒酸钠抗性突变株，缺失磷酸盐转运系统Ⅱ，因⽽避免了过多地吸收钒酸钠⽽导致菌的死亡，同时也避免了过多地吸收磷酸盐⽽导致磷酸盐抑制。 　　(d) 筛选去碳源分解代谢调节突变株。能被菌快速利⽤的碳源在被快速分解利⽤时，往往对许多其他代谢途径中的酶(包括许多抗⽣素合成酶和其他的酶)有阻遏或抑制作⽤，成为抗⽣素发酵产量的因素，不利于发酵⽣产⼯艺的控制。筛选去碳源分解代谢调节突变株，对于提⾼抗⽣素发酵产量，简化发酵⽣产⼯艺具有重要意义。抗⽣素⽣产中最常见的碳源分解代谢调节是“葡萄糖效应”，葡萄糖被快速分解代谢所积累的分解代谢产物在抑制抗⽣素合成的同时也抑制其他某些碳、氮源的分解利⽤。因此，可以利⽤这些碳(或氮)源作为惟⼀可供菌利⽤的碳(或氮)源，进⾏抗葡萄糖分解代谢调节突变株的筛选。例如，将菌在含有葡萄糖(阻遏性碳源)和组氨酸为惟⼀氮源的培养基中连续传代后，可选出去葡萄糖分解代谢调节突变株。正常的组氨酸分解酶类是被葡萄糖分解代谢物阻遏的，如果突变株能在这种培养基中⽣长，说明它具有能分解组氨酸⽽获得氮源的酶。这样的结果，可有两种解释：⼀是组氨酸分解酶发⽣了突变，不再受到原有的分解代谢物阻遏；⼆是葡萄糖分解代谢有关的酶发⽣了突变，不再产⽣或积累那么多的分解代谢阻遏物。第⼆种解释符合许多去葡萄糖分解代谢调节突变株的特性，因为同时有许多酶(受分解代谢调节的酶)的⽣成都不再受到葡萄糖分解代谢物阻遏。这种现象也是在抗⽣素育种⼯作中选择这种⽅法筛选去碳源分解代谢调节突变株的依据。 　　葡萄糖的（毒性）结构类似物也可⽤于筛选去碳源分解代谢调节突变株。例如，以半乳糖作为可供菌⽣长利⽤的惟⼀碳源，再于培养基中添加葡萄糖的结构类似物，该结构类似物不能为菌所利⽤，但可抑制菌利⽤半乳糖。所以，在这种培养条件下，只有去葡萄糖分解代谢调节突变株能够利⽤半乳糖进⾏⽣长，原始菌株由于不能利⽤半乳糖⽽不能⽣长。因⽽可选出去碳源分解代谢调节突变株。筛选去碳源分解代谢调节突变株还应注意避免⾛向另⼀个极端，即⽚⾯追求葡萄糖分解代谢速率下降，因为保持合适的葡萄糖分解代谢速率是抗⽣素⾼产的关键。 图4-7　葡萄糖的（毒性）结构类似物 　　此外，筛选淀粉酶活性⾼的突变株，以利于在发酵培养基中增加淀粉类物质作为补充碳源，也可以减弱碳分解代谢调节对抗⽣素⽣产的抑制作⽤。 　　(e) 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株。许多抗⽣素和氨基酸有共同的前体或者有些氨基酸本⾝可以作为某些抗⽣素的前体。因此，氨基酸的代谢和抗⽣素合成有着密切的联系，打破菌的氨基酸代谢的调节，可能导致抗⽣素⾼产。 　　在培养基中加⼊氨基酸结构类似物，氨基酸结构类似物对菌的⽣长有抑制作⽤，因此可以筛选到解除了氨基酸反馈调节的突变株。这些突变株能够在含有氨基酸结构类似物的培养基中⽣长，抗性的机制可能在于⽣成较多的氨基酸，从⽽提⾼抗⽣素前体的量。例如，在青霉素⽣物合成途径中，半胱氨酸和缬氨酸是青霉素母核的前体，筛选抗半胱氨酸结构类似物或抗缬氨酸结构类似物的抗性突变株，可能提⾼半胱氨酸或缬氨酸的⽣成量，进⽽提⾼青霉素产量。⼜如赖氨酸和青霉素有共同的中间代谢产物α-氨基⼰⼆酸，筛选赖氨酸结构类似物抗性突变株，可以解除赖氨酸对α-氨基⼰⼆酸⽣成的反馈调节，使α-氨基⼰⼆酸⽣成量增加⽽促进青霉素合成。 　　筛选氨基酸结构类似物抗性突变株的⽅法：将菌种诱变处理，接种于含抑制浓度的氨基酸结构类似物的培养基中，由于此种培养条件使得正常菌株不能⽣长，⽽抗氨基酸反馈调节的突变株或其他抗性突变株能够⽣长，因此可筛选出氨基酸结构类似物抗性突变株。在实际操作过程中，有许多氨基酸结构类似物并不抑制菌的⽣长，或只有在⾼浓度时才抑制菌的⽣长。因此要选择合适的氨基酸结构类似物⽤于筛选。还有⼀些氨基酸结构类似物仅抑制菌落的⽣长和减少孢⼦的数量，且⾼浓度都不抑制菌落形成和孢⼦形成，在此情况下，正常⼤⼩或正常产孢⼦的菌落被视为抗性菌。还可以⽤加⼊抗代谢抑制剂(如多烯类抗⽣素)⽅法，使细胞膜透性增加⽽提⾼筛选效果。

　　(f) 筛选⼆价⾦属离⼦抗性突变株。加⼊能和产物(抗⽣素)或其中间体结合的⽣长抑制剂(⼆价⾦属离⼦)，抑制剂达到⼀定浓度，抗⽣素低产菌株不能⽣长⽽⾼产菌株能够幸存下来，因⽽可能筛选到⾼产菌株。抗性的机制为形成⼤量产物或中间体和⼆价⾦属离⼦结合以解除⼆价⾦属离⼦对⽣产菌的毒性。但是⽤此⽅法，细胞膜透性降低⽽对⼆价⾦属离⼦具有抗性的菌株也会存留下来，需要进⼀步进⾏摇瓶筛选，通过抗⽣素产量的⽐较去除那些并不⾼产的抗性突变株。

　　采⽤上述⽅法筛选出青霉素和杆菌肽等抗⽣素的⾼产菌株。杆菌肽能和⼆价⾦属离⼦结合，具有输送⼆价⾦属离⼦进出细胞的⽣理功能。选育杆菌肽⾼产菌株时，于培养基中添加适量的硫酸亚铁，在此条件下筛选到的抗性菌株多数表现出⾼产的特性，其可能的抗性机理是：⽣产菌形成⼤量的杆菌肽和⼆价铁离⼦结合，将⼆价铁离⼦送出细胞外，从⽽避免了⼆价铁离⼦对⽣产菌的毒性作⽤。

　　(g) 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株。前体或前体结构类似物对某些抗⽣素产⽣菌的⽣长有抑制作⽤，且可抑制或促进抗⽣素的⽣物合成。筛选对前体或前体结构类似物的抗性突变株，可以消除前体结构类似物对⽣产菌的⽣长及其抗⽣素合成的抑制作⽤，提⾼抗⽣素产量。例如，灰黄霉素发酵使⽤氯化物为前体，筛选抗氯化物的突变株，提⾼了灰黄毒素的产量；以苯氧⼄酸为青霉素前体，选⽤抗苯氧⼄酸突变株，提⾼了青霉素V的发酵产量；以青霉素的前体缬氨酸、α-氨基⼰⼆酸或半胱氨酸、缬氨酸的结构类似物，筛选抗性菌株，提⾼了青霉素的发酵产量。

　　依据前体特性的不同，筛选抗性突变株的增产机理也有所不同。第⼀类前体是产⽣菌不能合成或很少合成的化合物，这⼀类前体通常需要⼈为地添加到发酵培养基中以促进提⾼抗⽣素产量或提⾼抗⽣素某⼀组分的产量。例如青霉素侧链前体苯氧⼄酸、苯⼄酸等，这⼀类前体通常对产⽣菌的⽣长具有毒性作⽤。对这些前体具有抗性的⾼产菌株可以通过⾼活性的酰基转移酶将前体掺⼊青霉素分⼦的侧链中，以合成青霉素，并解除前体对产⽣菌的毒性，使产⽣菌在⾼浓度的毒性前体存在时也能⽣长。筛选这⼀类前体的抗性突变株，应注意避免那些由于细胞膜透性下降使前体吸收减少的低产突变株或那些由于加强了对前体氧化分解的低产突变株。第⼆类前体是产⽣菌能够合成但不能⼤量积累的初级代谢中间产物，发酵⽣产中需要在发酵培养基中补充这⼀类前体以提⾼抗⽣素产量。例如红霉素发酵⽣产中添加丙醇以提⾼发酵产量。这⼀类物质过多会⼲扰产⽣菌的初级代谢⽽抑制菌的⽣长。抗性菌株的增产机理可能在于迅速将丙酸衍⽣物合成为红霉素，从⽽避免丙酸衍⽣物对初级代谢的⼲扰作⽤。第三类前体是初级代谢终产物，这⼀类前体⼀般对⾃⾝的抗⽣素合成有反馈调节作⽤，因⽽难以在细胞内⼤量积累。例如青霉素发酵⽣产中缬氨酸反馈抑制⼄酰羟酸合成酶，从⽽抑制了缬氨酸的合成。筛选缬氨酸结构类似物抗性突变株，可使⼄酰羟酸合成酶对缬氨酸的反馈抑制的敏感性减弱，促使细胞的内源缬氨酸的浓度增加⽽提⾼青霉素产量。

　　(h) 筛选⾃⾝所产的抗⽣素抗性突变株。某些抗⽣素产⽣菌的不同⽣产能⼒的菌株，对其⾃⾝所产的抗⽣素的耐受能⼒不同，⾼产菌株的耐受能⼒⼤于低产菌株。因此，可⽤⾃产的抗⽣素来筛选⾼产菌株。例如有⼈把⾦霉素产⽣菌多次移种到⾦霉素浓度不断提⾼的培养基中去，最后获得⼀株提⾼⽣产能⼒4倍的突变株。此⽅法在抗⽣素⾼产菌株选育中有⼴泛应⽤，青霉素、链霉素、庆⼤霉素等抗⽣素的产⽣菌均有⽤此⽅法来提⾼产量的例⼦。此⽅法还适⽤于进⼀步纯化⾼产菌株。

　　⽤于菌种理性化筛选的还有各种类型的突变株，如组成型突变株、消除⽆益组分的突变株、能有效利⽤廉价碳源或氮源的突变株、细胞形态改变更有利于分离提取⼯艺的突变株、抗噬菌体的突变株等等。这些突变株均有重⼤的经济价值，⽽且这些筛选⽬标虽然不以产量为惟⼀⽬标，但突变株所具有的优良特性却往往能导致产量的提⾼。例如红霉素⽣产中的抗噬菌体菌种，其红霉素产量表现出较⼤的变异范围，得到⽐原种产量⾼的突变株。这可能是由于发⽣了抗噬菌体突变后，动摇了菌种原有的遗传基础，使之更容易获得⾼产突变株。 　　㈤ 突变基因的表现

　　菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特性和菌种的培养条件。突变株的遗传特性改变了，其培养条件也应该作出相应的改变。在菌种选育过程的每个阶段，都需不断改进培养基和培养条件，以鉴别带有新特点的突变株，寻找符合⽣产上某些特殊要求的菌株。⾼产菌株被筛选出来以后，要进⾏最佳发酵条件的研究，使⾼产基因能在⽣产规模上得以表达。例如，诱变处理四环素产⽣菌得到的突变株，在原培养基上与出发菌株相⽐较，发酵单位的提⾼并不明显，但是在原培养基配⽅中增加碳、氮浓度，调整磷的浓度，该菌株就表现出代谢速度快、发酵产量⾼的特性。⽤该菌株进⾏⽣产，并采⽤通氨补料的⼯艺来适应该突变株代谢速度快的特点，使产量有了新的突破。