色素上皮衍生因子的分段克隆表达对人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖的影响

色素上皮衍生因子的分段克隆表达对人皮肤鳞状

细胞癌细胞增殖的影响

张志彬，彭胜男，刘藕根，张颖鹏，李春明，彭亚婷，张淑兰

［摘要］目的

有关色素上皮衍生因子（PEDF）短肽对人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖的研究鲜有报道。文中旨在获得

方法

采用PCR扩增PEDF1、

PEDF蛋白的分段克隆表达，并观察对人皮肤鳞状细胞癌细胞系（SCL-1）细胞增殖的影响。

PEDF2和PEDF3目的基因，将回收的片段用NheI/HindⅢ酶切，插入至pET28a（+）载体。连接产物转化入大肠埃希菌BL21并PEDF1、PEDF2和PEDF3肽段对SCL-1细胞增殖影响。

结果

诱导表达，并把融合蛋白的进行分离、纯化。采用CCK-8方法检测24h、48h及72h，不同浓度100、400、800和1000nmol/LPEDF2和PEDF3融合蛋白，相对分子质量约为18000、17000和13000。24h时，800nmol/L、1000nmol/L浓度PEDF3SCL-1细

成功构建PEDF1、PEDF2和PEDF3的原核表达载体，PEDF1、

胞增殖[(0.61±0.03)、(0.78±0.07)]较0nmol/LPEDF3(1.00±0.00)明显降低（P<0.05）;48h时，400、800、1000nmol/L浓度PEDF3SCL-1细胞增殖呈现显著抑制，并呈剂量依赖性（P<0.05）;72h时，800、1000nmol/L浓度PEDF3SCL-1细胞增殖[(0.53±0.05)、(0.51±0.05)]较400、0nmol/L[(0.60±0.05)、(1.00±0.00)]显著降低（P<0.05）。抑制了SCL-1细胞增殖，为进一步筛选PEDF活性功能短肽提供了基础。

［中图分类号］R739.5

［文献标志码］A

结论

成功分段克隆表达PEDF融合蛋白，PEDF3

人皮肤鳞状细胞癌；分段克隆；细胞增殖［关键词］色素上皮衍生因子；

（2019）10-1014-05［文章编号］1008-8199

［DOI］10.16571/j.cnki.1008-8199.2019.10.002

SegmentedcloningandexpressionofthepigmentepitheliumderivedfactoranditseffectontheproliferationofhumanSCL-1cellsZHANGZhi-bin1，PENGSheng-nan2，LIUOu-gen1，ZHANGYing-peng1，LIChun-ming1，PENGYa-ting1，（1.DepartmentofDermatology，theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，Nanchang330006，Jiangxi，China；2.ScienceandTechnologyCollegeofJiangxiTraditionalChineseMedicineUniversity，Nanchang330004，Jiangxi，China）ZHANGShu-lan1

［Abstract］ObjectiveStudiesarerarelyreportedontheeffectofshortpeptidesofthepigmentepitheliumderivedfactor

Methods

Thetargetgenes

（PEDF）ontheproliferationofhumancutaneoussquamous（SCL-1）cells.Thepurposeofthisstudyistoinvestigatesegmentedclon‑ingandexpressionofthePEDFproteinandobserveitseffectontheproliferationofhumanSCL-1cells.

ofPEDF1，PEDF2andPEDF3wereamplifiedbyPCRandtherecov‑eredfragmentssubjectedtodoubledigestionofNheⅠandHindⅢandinsertedintothepET28a（+）plasmid.Theproductwastrans‑formedintohumanEcoliBL21andinducedtoexpress，followedbyisolationandpurificationofthefusionprotein.CCK-8assaywasused

基金项目：国家自然科学基金(81960569)；江西省教育厅

科学技术研究项目（GJJ170090）

作者单位：330006南昌，南昌大学第二附属医院皮肤科

[张志彬（医学硕士研究生）、刘藕根、张颖鹏、李药大学科技学院（彭胜男）

通信作者：李春明，E-mail：chunminglinc@yahoo.com

春明、彭亚婷、张淑兰]；330004南昌，江西中医

todetecttheproliferationoftheSCL-1cellswithPEDF1，PEDF2hours.

Results

andPEDF3at100，400，800and1000nmol/Lat24，48and72

TheprokaryoticexpressionvectorsofPEDF1，

医学研究生学报2019年10月第32卷第10期JMedPostgra，Vol.32，No.10，2019·1015·

PEDF2andPEDF3weresuccessfullyconstructed，andtheirfusionproteinsprepared，withthemolecularweightof18000，17000and13000，respectively.TheproliferationoftheSCL-1cellswassignificantlydecreasedinthe800and1000nmol/LPEDF3groupscomparedwiththatinthe0nmol/LPEDF3groupat24hours（0.16±0.03and0.78±0.07vs1.00±0.00，P<0.05），inhibitedina

concentration-dependentmannerinthe400，800and1000nmol/LPEDF3groupsat48hours（P<0.05），markedlylowerinthe800and1000nmol/LPEDF3groupsat72hours（0.53±0.05and0.51±0.05）thanintheinthe400and0nmol/LPEDF3groups（0.60±0.05and1.00±0.00）（P<0.05）.ConclusionofPEDF.

PEDF3inhibitedtheproliferationofSCL-1cells，whichhaspavedthegroundforfurtherscreeningofactivefunctionalshortpeptides

［Keywords］pigmentepitheliumderivedfactor；humancutaneoussquamouscellcarcinoma；segmentalcloning；cellproliferation

ThePEDFfusionproteinsweresuccessfullysegmentallyclonedandexpressedand

0引言

CAGAGGTGCCACAAAGC-3'。PEDF2（161-300氨GGGACCAGGCCCAGAG-3'，下AAAGCTTTTAGTCATGAATGAAC

游

皮肤鳞状细胞癌是皮肤常见恶性肿瘤，发病率逐年上升。色素上皮衍生因子（pigmentepitheliumderivedfactor，PEDF）是一种强效的内源性抗肿瘤蛋白，由418个氨基酸组成。近年来发现PEDF短肽具有与全长的PEDF蛋白同样的抗肿瘤作用，更容易被载体携带且引起的不良反应更少。然而有关报道。本研究旨在通过分段克隆表达PEDF融合蛋neoussquamouscellcarcinomacellline，SCL‑1）的抑制结果，为短肽筛选提供基础。11.1

材料与方法材料

质粒抽提试剂盒和RNA提取试剂盒购

PEDF短肽对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖的研究鲜有白，观察其对人皮肤鳞状细胞癌细胞系（humancuta‑

基酸）的引物，上游5'-TTCATGCTAGCTCATAT‑

TCGGAGGTG-

5'-TCTA‑

3'。PEDF3（301-418氨基酸）的引物，上游5'-GGGGTCCAG-3'。1.2.2

TTCATGCTAGCATAGACCGAGAACTGAAGACCGT‑GC-3'，下游是5'-TCTAAAAGCTTTTAGGGGCCCCT‑

PEDF1、PEDF2和PEDF3的基因扩增

选

用人皮下脂肪组织抽取物提取总RNA组织。总RNA提取参照Trizol试剂盒说明书操作。取2µg总RNA，采用20µL逆转录体系（4µL5×逆转录酶缓

冲液、0.5µgOligo（dT）50mmol/LdNTP混合液、18、200UMMLV逆转录酶、20URNA酶抑制剂和DEPC水），42℃60min逆转录为cDNA。PCR反应采用mmol/LdNTP混合液、50mmol/LKCL、10mmol/Lmin，1循环；96℃70s，57℃70s，72℃80s，35个循环；72℃延伸7min。1.2.3

PEDF1、PEDF2和PEDF3分别连接到pET28a（+）载

目的基因的克隆和鉴定

自北京天根生化科技有限公司，PCR试剂、性内切酶NheI、HindⅢ购自日本TaKaRa公司，反转录试剂盒和T4DNA连接酶购自美国Fermentas公司，DNA凝胶回收试剂盒购自美国Axygen公司，SDS-购自上海碧云天生物技术有限公司，30%Acryl‑amide/Bissolution、甘氨酸购自美国Bio-Rad公司，考马斯亮蓝R250购自国药集团化学试剂有限公司，高亲和力的Ni-NTA树脂（HighAffinityNi-NTAResin）购自美国GenSript公司，透析袋购自Biosharp公司，SCL-1细胞株购自深圳中洪博元生物技术有限公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，CCK-8试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所。1.21.2.1

方法引物设计

从NCBI网站下载PEDF序列

PAGE蛋白上样缓冲液（5×）、苯甲基磺酰氟（PMSF）

25µLPCR体系：10pmoL/µL各对上下游引物、200Tris-HCl、2mmol/LMgCl2、2UTaq酶、cDNA、DEPC

水补足25µL，进行PCR反应。反应程序为：96℃3

将PCR扩增产物

体载体。用NheI/HindⅢ内切酶分别双酶切g/L琼脂糖凝胶电泳后回收酶切产物，用T4连接酶

PEDF1、PEDF2和PEDF3和空质粒pET28a（+），1023℃作用2h；用将连接产物转化入大肠埃希菌进行酶切、测序、PCR鉴定。1.2.4

DH5α，转化后挑取单个菌落进行扩增以提取质粒PEDF1、pET28a-PEDF2和pET28a-PEDF3，转化大肠杆菌表达菌株BL21，挑取单克隆，5mLLB培养基

重组表达载体的表达

载体pET28a-

（NM_002615.5），设计PEDF1（1-160氨基酸）的引物，上游5'-TTCATGCTAGCATGCAGGCCCTGGTGC‑TACTCC-3'，下游5'-TCTAAAAGCTTTTACTTTTC‑

（Kanr）中震荡培养过夜。按1%接种量接种到50mLLB培养基中，A600为0.6时，分别加入终浓度为

·1016·

医学研究生学报2019年10月第32卷第10期JMedPostgra，Vol.32，No.10，20190.1糖苷、0.4（Isopropyl、0.8、1.2、β1.6-D-和Thiogalactoside2mmol/L的异丙基硫代半乳，IPTG），37℃诱导培养3h。分别取出1.0mL菌液，离心收集菌体沉淀用80µLPBS悬浮，再加入5×SDS-PAGE上样缓冲液20µL震荡混匀，100℃水浴煮沸5min。离心后取上清进行12%SDS-PAGE鉴定。1.2.5融合蛋白的制备、分离、纯化、浓度及纯度鉴定

挑取阳性克隆接种到5mLLB培养基经37℃震

荡过夜培养。吸取100µL接种于100mL的LB培养基，37℃振荡培养2h至A600为0.6左右时，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG37℃诱导培养3h。离心后收集菌体，加入32mL的LEbuffer重悬菌体，破碎前加入0.1mol/L的PMSF320µL，置入超声破碎仪中进行破碎。破碎后的菌体离心后分别收集上清和沉淀。收集的沉淀用包涵体洗涤缓冲液洗涤2次后，用包涵体溶解缓冲液重悬，冰浴1h使包涵体溶解，离心后将上清过滤。倒置填料瓶底部混匀柱填料，用移液管转移5mL填料至柱中，室温静置10min子中加入待凝胶与溶液分层后，5倍柱体积的去离子水，让乙醇缓慢流出。向柱将乙醇冲洗干净

后，再用8倍柱体积的LEbuffer平衡柱子，上样。将洗涤、溶解好的包涵体溶液负载上柱，流速为1mL/用min2。用倍柱体积的15倍柱体积的WashbufferLEbuffer洗柱，洗柱，收集流出峰。用收集流穿峰。5倍柱体积的Elutionbuffer洗脱，收集洗脱峰。洗脱后，1次使用3倍柱体积的LEbuffer和5倍柱体积的去离子水，洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡柱子。蛋白纯化收集的洗脱液装入透析袋中，放在2L的refoldingbuffer中于4℃重折叠72h，样品于透析缓冲液中4℃透析24h，期间换液2次。采用度，BCA具体操作过程见参考文献法测定蛋白浓度，考马斯亮蓝染色测定蛋白纯

［1］。1.2.6

CCK⁃8法检测不同浓度PEDF1、PEDF2和

PEDF3SCL对数生长期

胎牛血清的-1细胞用胰蛋白酶对SCL⁃1细胞DMEM培养基，/增EDTA殖的以消化后重悬于含影响

5×10410%96/mL密度种植于铺满孔底部孔板，每孔60%~70%100µL。放置于孵箱中，弃培养基，然后用24PBSh后，冲洗细胞

2次。实验设置调零组、空白对照组、实验组。以添加100µL无血清DMEM/0.5%BSA的无细胞孔作为调零孔。以添加100µL无血清DMEM/0.5%BSA的有细胞孔作为空白对照组。实验组加入100µL含有不同浓度100、400、800和1000nmol/LPEDF1、

PEDF2孵育24和h。最后PEDF31的无血清h每孔加入DMEM/0.5%10µLCCKBSA-8溶液，。继续继续孵育1h，置于分光光密度仪450nm读取吸光度。每种处理因素均设5复孔，重复3次，计算细胞活力比值，结果取平均值。细胞活力比值计算公式如下：

细胞活力比值=实验组/空白组1.3

统计学分析

采用SPSS16.0统计软件进行数

据分析。计量资料以均数±标准差（ˉx±s）进行描述，

组间均值比较采用方差分析，两两组间比较采用LSD法。以P≤0.05为差异有统计学意义。2结

果

2.1构建PEDF1、PEDF2和PEDF3的原核表达载体

构建好的载体pET28a-PEDF1、pET28a-PEDF2

和pET28a-PEDF3通过测序结果显示，3个不同片段序列都符合预期并且都插入到正确位点。与NM_002615.5T序列相比存在2个同义突变，分别为390C>2.2

和963C>TPEDF1。、PEDF2和PEDF3融合蛋白检测

通

过IPTG诱导出融合蛋白的大肠杆菌经超声破碎后，在上清和沉淀中均检测到目的蛋白表达，蛋白相对分子质量大小分别约为18000、17000和13000。其中融合蛋白大部分分布在沉淀中，小部分以可溶形式存在于上清中，最终选择对沉淀中的蛋白进行分离纯化，见图1。

箭头指示条带为目的蛋白

图1融合蛋白的检测

Figure1

DetectionofthePEDF1，PEDF2andPEDF3fu⁃sionproteins

2.3PEDF1、PEDF2和PEDF3融合蛋白的分离纯化

融合蛋白通过分离纯化，得到洗脱后的蛋白相

对分子质量分别为18000、17000和13000，与PEDF1、PEDF2和PEDF3蛋白分子量相符，见图2。

医学研究生学报2019年10月第32卷第10期JMedPostgra，Vol.32，No.10，2019·1017·

图2融合蛋白的分离纯化

a：PEDF1蛋白，b：PEDF2蛋白，c：PEDF3蛋白；1-8为洗脱液收集管编号

Figure2IsolationandpurificationofthePEDF1，PEDF2andPEDF3fusionproteins

2.4PEDF1、PEDF2和PEDF3融合蛋白对SCL-1

24h时，800nmol/L、1000

3讨论

皮肤鳞状细胞癌是起源于表皮或附属器角质

细胞增殖的抑制影响

nmol/L浓度PEDF3SCL-1细胞增殖较0nmol/L

PEDF3明显降低，抑制SCL-1细胞增殖（P<0.05）。48h时，400、800、1000nmol/L浓度PEDF3SCL-1细胞增殖呈现显著抑制，并呈剂量依赖性（P<

形成细胞的一种恶性肿瘤，近年来发病率逐年上升［2］，该皮肤肿瘤具有病因复杂、临床误诊率高、恶性程度大及侵袭性和破坏性强等特点。常用的治疗方法主要为手术治疗，然而由于手术后严重影响美容外观，且不适合于老年体弱以及有手术禁忌证者。因此希望寻找到理想的、高效、非损伤性局部治疗方法。近年来在视网膜和其他一些细胞、组织中发现了一种内源性的强效抗肿瘤蛋白，即PEDF［3-4］，为我们治疗皮肤鳞状细胞癌提供了新的1细胞增殖的影响。

PEDF是一个相对分子质量为50KDa的内源性

0.05）。72h时，800、1000nmol/L浓度PEDF3SCL-见表1。

表1

1细胞增殖较400、0nmol/L显著降低（P<0.05）。

CCK-8方法检测不同浓度PEDF1、PEDF2和PEDF3

ˉ±s）的细胞活力比值（x

Table1

ProliferationoftheSCL-1cellswithPEDF1,PEDF2andPEDF3at100,400,800and1000

思路。因此，本研究将PEDF分段克隆，观察对SCL-

ˉ±s）nmol/Lat24,48and72hours（x

PEDF1PEDF24h1.00±0.000.99±0.010.96±0.030.94±0.040.97±0.041.00±0.000.98±0.040.98±0.040.99±0.020.94±0.031.00±0.000.98±0.030.84±0.04*0.78±0.07*0.95±0.03

48h1.00±0.000.98±0.030.95±0.030.94±0.050.93±0.041.00±0.001.01±0.040.93±0.040.97±0.020.93±0.041.00±0.000.61±0.03*#0.79±0.04*0.87±0.06

72h1.00±0.000.95±0.050.95±0.030.92±0.060.94±0.061.00±0.001.00±0.060.98±0.030.97±0.020.94±0.041.00±0.000.77±0.05*0.60±0.05*

可溶性分泌蛋白。PEDF在人体广泛分布，皮肤以外周血中，均可以检测到PEDF的表达［5］。在人体皮肤中，PEDF在表真皮及皮肤附属器均有表达［6］。此

外的组织如脑、脊髓、眼、心脏、血管、肝、骨组织以

0nmol/L

100nmol/L400nmol/L800nmol/LPEDF20nmol/L1000nmol/L100nmol/L400nmol/L800nmol/LPEDF30nmol/L1000nmol/L100nmol/L400nmol/L800nmol/L1000nmol/L外，有研究发现人原代脂肪细胞分泌高浓度的PEDF蛋白，本研究前期从人皮下脂肪组织抽取物提取总RNA组织并扩增出PEDF片断，也从组织学角度证实人皮下脂肪组织表达PEDF［7］。本研究测序结果显示PEDF分段克隆片段序列与NM_002615.5相比存在2个点突变分别为，390C>T和963C>T，但2个点突变都是同义突变故不影响蛋白序列的表达，这与PEDF在不同组织表达存在差异有关。

PEDF具有抗肿瘤作用、神经营养作用、神经保

与0nmol/L比较，*P<0.05；与400nmol/L比较，#P<0.05；与800nmol/L比较，△P<0.05

0.58±0.04*#△

0.53±0.05*#0.51±0.05*#

护作用、抗血管新生和免疫调节等多种生物学功能［8-10］。目前PEDF在抗肿瘤方面的研究成为研究热点，体内和体外实验证实PEDF对前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、胰腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤具有抗

·1018·

医学研究生学报2019年10月第32卷第10期JMedPostgra，Vol.32，No.10，2019肿瘤作用［11-14］。目前发现PEDF短肽同样具有生物学活性，有研究表明PEDF短肽对骨肉瘤、成神经细胞瘤等具有抗肿瘤作用［15-16］。因此，本研究希望筛选出抗皮肤鳞癌的PEDF活性短肽，可以抑制皮肤鳞癌生长。通常多肽合成的长度不宜超过30个氨基酸，否则难以保证准确性，但分段更细难度较大，因此本研究首先将301PEDF分成3段（1-160，161接后表达该重组蛋白并纯化。

-418氨基酸）进行分段克隆，分别和表达载体连-300，在蛋白纯化过程中，本研究洗脱后得到的蛋白分子量分别为PEDF2蛋白成功。为了验证分段克隆和PEDF318分子量相符，000、17000和提示分段克隆13000，与PEDF1PEDF蛋白的功能，

PEDF、本研究还通过CCK-8增殖实验发现，PEDF3呈剂量依赖性抑制皮肤鳞状细胞癌PEDFSCL-1细胞增殖，为了更准确分段克隆-3存在抑制皮肤鳞状细胞癌增殖的功能片段，提示PEDF，我们将在后续实验中将PEDF3分段合成更小的短肽，进一步筛选PEDF活性功能短肽，ern并且对融合蛋白需进一步做West‑［17-18］

，以明确融合表达的蛋白为

目的蛋白。

blot或质谱分析综上所述，本研究成功分段克隆表达PEDF融合蛋白，并发现PEDF3抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖，为功能性PEDF短肽筛选提供基础，有望为皮肤鳞癌治疗提供新的思路。

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（收稿日期：2019‑04‑25；修回日期：2019‑07‑03）

（责任编辑：杨建鑫；英文编辑：罗永合）

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