・１１３８・ 医学研究生学报２０１３年１１月第２６卷第１１期Ｊ Ｍｅｄ Ｐｏｓｔｇｒａ，Ｖｏｌ ２６ ． ！ ｆＩｌ ｅｒ 论 著 （基础研究） 念珠菌优势抗体检测方法的建立及临床诊断价值 评估 马春芳，陆静芬，孔倩倩，韩丹丹，廖红，李芳秋 【摘要】 目的侵袭性念珠菌病（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ，ＩＣ）是免疫功能损伤或低下患者常见的感染和死亡原因，近年来检 测Ｉｃ患者血清中特异性抗体的血清学诊断方法成为研究热点。本文旨在建立检测念珠菌烯醇化酶（Ｅｎｏｌａｓｅ，Ｅｎｏ）、果糖二磷 酸醛羧酶（ｆｒｕｃｔｏｓｅ—ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ，Ｆｂａ１）特异性抗体的ＥＬＩＳＡ方法，评估其在Ｉｃ早期诊断中的应用价值。 方法利 用基因重组技术获得的Ｅｎｏ、Ｆｂａｌ重组蛋白作为包被抗原，建立测定人血清相应抗体的ＥＬＩＳＡ，并对方法的敏感性、特异性进 行考查。 结果建立了检测Ｉｃ患者血清抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ抗体的ＥＬＩＳＡ，ｃｕｔ—ｏｆ值分别为吸光度（Ａ）值０．３７０和０．６１０。 ＥＬＩＳＡ结果显示，Ｉｃ患者血清中的抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ抗体水平明显高于健康对照和非Ｉｃ患者对照（Ｐ＜０．００１）。抗Ｅｎｏ和抗 Ｆｂａｌ对诊断ＩＣ的敏感性和特异性分别为７２．３％（７３／１０１）和９８％（１９６／２００），８７．１％（８８／１０１）和９６％（１９２／２００），联合检测可 提高敏感性至９１．Ｏ％。且与细菌感染及其他真菌感染患者（如曲霉病）无交叉反应。ＩＣ患者中４０．６％（４１／１０１）可以在 培 养阳性前检测到抗Ｅｎｏ、４９．５％（５０／１０１）可以在血培养阳性前检测到抗Ｆｂａｌ。 结论 建立了检测抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ抗体的 ＥＬＩＳＡ法，检测念珠菌菌丝相分泌蛋白ＩｇＧ抗体特异性和灵敏度良好，在念珠菌感染诊断中具有潜在临床应用价值。 ［关键词】念珠菌；烯醇化酶；果糖二磷酸醛羧酶；抗体；ＥＬＩＳＡ 【中图分类号】 Ｒ３９２．１１ 【文献标志码】 Ａ 【文章编号】 １００８—８１９９（２０１３）１１－１１３８－０４ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｏｍｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ＭＡ Ｃｈｕｎ—ｆａｎｇ，ＬＵ Ｊｉｎｇ—ｆｅｎ，ＫＯＮＧ Ｑｉａｎ—ｑｉａｎ，ＨＡＮ Ｄａｎ－ｄａｎ，ＬＩＡＯ Ｈｏｎｇ，ＬＩ Ｆａｎｇ—ｑｉｕ （ＪＰ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＮａｎｉｆｎｇ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｒｅｇｉｏｎ，ＰＬＡ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００２，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ（ＩＣ）ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｉｌｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏ— ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｒｅｃｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＩＣ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎ ＥＬＩＳＡ—ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｅｎｏｌａｓｅ（Ｅｎｏ）ａｎｄ ｆｒｕｃｔｏｓｅ—ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ（Ｆｂａ１），ａｎｄ ａｓ— ｓｅｓｓ ｉｔｓ ｖａｌＨｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＩＣ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｎｏ ａｎｄ Ｆｂａｌ ａｓ ｃｏａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ．ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎ ＥＬＩＳＡ— ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｎｔｉ－Ｅｎｏ ａｎｄ ａｎｔｉ－Ｆｂａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒａ ｏｆ ＩＣ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｔｈｅｎ ｗｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｉｓ ａｓｓａｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｃｕｔ．ｏｆｆ ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ａｎｔｉ—Ｅｎｏ ａｎｄ ａｎｔｉ—Ｆｂａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｔ ｂｙ ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔ— ｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅｓ（ＲＯＣ）ｗｉｔｈ Ａ＝０．３７０ ｆｏｒ ａｎｔｉ—Ｅｎｏ ａｎｄ Ａ＝０．６１０ ｆｏｒ ａｎｔｉ．Ｆｂａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｗ ＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅ ｍｅｄｉａｎ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ—Ｅｎｏ ａｎｄ ａｎｔｉ—Ｆｂａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｌｆｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｔｈｅ ＩＣ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｈａｎ ｉｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉ— ｖｉｄｕａｌｓ（Ｐ＜０．（）ｏ１）．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ７２．３％ａｎｄ ９８％ｆｏｒ ａｎｔｉ—Ｅｎｏ ａｎｄ ８７．１％ａｎｄ ９６％ｆｏｒ ａｎｔｉ— Ｆｂａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ．Ｅｎｏ ａｎｄ ａｎｔｉ．Ｆｂａｌ ｒａｉｓｅｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ９１％．Ｌｉｔｔｌｅ ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｒ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｓｔｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ ｉｎ ４０．６％（ａｎｔｉ—Ｅｎｏ）ａｎｄ ４９．５％（ａｎｔｉ— Ｆｂａ１）ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｅｆｏｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｌｏｏｄ ｃｕｈｕｒｅｓ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ａｎ ＥＬＩＳＡ．ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｎ０ ａｎｄ Ｆｂａｌ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＩＣ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ Ｃａｎｄｉｄａ ｌａｂｉｃａｎｓ；Ｅｎｏｌａｓｅ；Ｆｒｕｃｔｏｓｅ—ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＥＬＩＳＡ 基金项目：江苏省科技支撑计划一社会发展项目（ＢＥ２００９６７３）；南京军区 医学科技创新重点课题（１０Ｚ０２７） 作者单位：２１０００２南京，南京军区南京总医院临床检验医学研 ０引 言 究所［马春芳（医学硕士研究生）、陆静芬、孔倩倩、韩丹 丹、廖红、李芳秋］ 通讯作者：李芳秋，Ｅ—ｍａｉｌ：ｎｊｌｉｆｑ＠１６３．ｃｏｎ 广谱抗生素和免疫抑制剂的广泛应用，器官、骨 髓移植和导管留置操作的普遍性，使医院内侵袭性真 菌感染的发病率呈明显增多趋势 卜 ，其中以Ｉｃ 医学研究生学报２０１３年１１月第２６卷第１１期Ｊ Ｍｅｄ Ｐｏｓｔｚ，ｒａ。Ｖｏ１．２６，Ｎｏ．１１。Ｎｏｖｅｍｂｅｒ．２０１３ ・１１３９・ 最常见 』，因其缺乏特异性的症状和体征，且传统的 检查方法敏感性低，使Ｉｃ早期诊断困难，预后较差。 血培养作为Ｉｃ诊断的金标准，假阴性率高达５０％，且 需３～５ ｄ才能得到结果 ；新的非培养非侵人性诊断 方法如Ｇ试验［检测真菌细胞壁（１－３）．Ｂ．Ｄ．葡聚糖］ 使诊断水平得到提高，但仍不够理想＿５ Ｊ。因此需要发 展新的诊断指标以用于ＩＣ的血清学诊断。 念珠菌Ｅｎｏ和Ｆｂａｌ是菌丝相表达的免疫优势抗 原，菌丝体细胞质内含量丰富，只有侵袭性感染时才 会大量释放人血，并刺激机体产生抗体，检测患者血 清中抗Ｅｎｏ及抗Ｆｂａｌ可以区分侵袭性感染和单纯的 定植，为Ｉｃ的诊断尤其是早期诊断提供有力的依据。 在用基因工程技术获得重组蛋白的基础上 一 ，我们 建立了ＥＬＩＳＡ方法，检测Ｉｃ患者血清抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ 抗体水平，初步评估其对Ｉｃ的早期诊断价值。 １材料与方法 １．１重组抗原Ｅｎｏ和Ｆｂａ１的制备按照文献［６—７］ 的方法制备。用ＴＡＬＯＮ金属亲和层析柱重组蛋白， ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析纯化效果，Ｂｒａｄｆｏｒｄ法进行蛋白质定量。 １．２患者及血清样本收集 ＩＣ诊断标准依据《重 症患者侵袭性真菌感染诊断与治疗指南》 。收集 ２００９年８月至２０１１年１２月南京市多家医院，根据 血培养结果临床确诊为Ｉｃ的１０１例患者。每间隔 数日收集血清，选取自血培养阳性前１周至患者出 院为止的血清１０１５份。对照血清采集自健康体检 者２００例，念珠菌定植者（仅痰培养阳性）５０例，细 菌血症８４例，确诊及临床诊断为烟曲霉感染者４０ 例。所有血清均保存于一８０℃备用。 １．３ ＥＬＩＳＡ以重组白念珠菌Ｅｎｏ、Ｆｂａｌ为包被抗 原，用间接ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ类特异抗体。用方阵 滴定法选择最佳反应条件。抗原用ｐＨ９．６，０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ 稀释，以１００ ｉｒｇ／孔包被聚苯乙烯反应 板，４ ｃＣ过夜。次日ＰＢＳ－Ｔ（含０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０的 ＰＢＳ）洗３次，每孔加封闭液（含５．０ ｇ／Ｌ ＢＳＡ、 ０．２ ｇ／Ｌ ＮａＮ３的包被液）１００ ｌ，３７ ｏＣ １ ｈ。用ＰＢＳ—Ｔ 洗５次，每次３ｍｉｎ；将待测血清用含１％小牛血清的 ＰＢＳ作１：５００稀释，加入微孔反应板１００ ｌ／孔，各稀 释度均设复孔，３７℃温育４５ ｒａｉｎ；同上洗涤；加入 ＨＲＰ标记羊抗人ＩｇＣ抗体（１：１００００稀释），每孔１００ ，３７℃４５ ｍｉｎ；同上洗涤；加入底物液ＴＭＢ—Ｈ２０２ 显色，３７℃１５ ｒａｉｎ，加终止液，于酶联仪（Ｂｉｏ—Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ ６８０型）上测４５０ ｎｍ波长吸光度（Ａ）。 １．４统计学分析采用ＳＰＳＳ １８．０统计软件处理， 计数资料以例数和百分率表示，组间率的比较采用 ）（ 检验，Ｐ≤０．０５为差异有统计学意义。绘制ＲＯＣ 曲线，用曲线下面积（ＡＵＣ）评估抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ作 为诊断标志的效能。 ２结 果 ２．１ ＥＬＩＳＡ方法的建立 ２．１．１ ＥＬＩＳＡ临界值确定 测定１０１例ＩＣ患者血 清和３７４例对照组血清（１：５００稀释），用所得数据制 作ＲＯＣ曲线。当Ａ＝０．３７０时，抗Ｅｎｏ特异性为 ９８％，敏感性最高为７２．３％；Ａ＝０．６１０时，抗Ｆｂａｌ特 异性为９６％，敏感性最高为８７．１％，因此，分别选择 ０．３７０和０．６１０作为抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ的ｃｕｔ．ｏｆｆ值。 ＳＡ检出 的强阳性ＩＣ患者血清进行阻断实验。稀释后的待 测血清中加入终浓度为２．５ Ｉ．Ｌｇ／ｍｌ的重组抗原， ３７ ｑＣ温育１ ｈ，再进行ＥＬＩＳＡ测定，抗Ｅｎｏ的４值从 １．４１０降低到０．０９９，降低９３．Ｏ％，抗Ｆｂａｌ的Ａ值可 降低８５．３％，提示检测结果对抗原具有特异性。 抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ测定结果１０１例ＩＣ患者的 中，７３例（７２．３％）检出抗Ｅｎｏ抗体，其Ａ值的中位 数为０．６８２（２５％～７５％范围为０．５２２～０．８４９）；而 健康对照和非Ｉｃ患者血清的 值的中位数分别为 Ｆｂａｌ抗体，其Ａ值的中位数为１．１５６（２５％～７５％ 范围为０．９３０～１．３２２）；而健康对照和非Ｉｃ患者血 清的 值的中位数分别为０．３１６（０．２３５～０．４１０， Ｐ＜０．００１）和０．３１７（０．１８９～０．４８８，Ｐ＜０．００１），见 图ｌ。各类念珠菌感染者抗体测定阳性率见表１。 定植者阳性率与ＩＣ患者比较，Ｐ＜０．Ｏ１。白念珠菌 与非白念珠菌感染的ＩＣ患者抗Ｅｎｏ抗体阳性率分 别为８４．０％（２１／２５）和６８．４％（５２／７６）（ｘ ＝２．２８， Ｐ＞０．０５），白念珠菌与非白念珠菌感染的ＩＣ患者 抗Ｆｂａｌ抗体阳性率分别为９２．０％（２３／２５）、８５．５％ （６５／７６）（ｘ ＝１．２８，Ｐ＞０．０５）。此外，比起单一检 测抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ抗体，联合检测这２种抗体可将 敏感性提高至９１．０％，特异性为９０．６％，阳性预测 值为７２．２％，阴性预测值为９７．１％，与单项检测指 标相比，敏感性和阴性预测值更高。见表２。 ２．３患者免疫状态对抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ抗体测定的 影响测定不同免疫状态ＩＣ患者血清中的抗Ｅｎｏ、 抗Ｆｂａｌ抗体水平，结果显示，免疫功能正常（非粒 细胞缺乏）的ＩＣ患者抗Ｅｎｏ阳性率是７６．７％，抗 Ｆｂａｌ阳性率为９２．２％，而粒细胞减少的ＩＣ患者抗 Ｅｎｏ阳性率为３６．４％，抗Ｆｂａｌ阳性率为４５．５％，差 异有统计学意义（７６．７％ ３６．４％，Ｐ＝０．００５； ９２．２％ ４５．５％，Ｐ＜０．００１）。证明粒细胞减少严重 影响抗体检出率，见表３。 ２．１．２ ＥＬＩＳＡ方法特异性考核 选择ＥＬＩ２．２０．１８８（０．１５６～０．２７７，Ｐ＜０．００１）和０．２８２（０．１７５— ０．３６８，Ｐ＜０．００１）；８８例Ｉｃ患者（８７．１％）检出抗 医 究生学报２０１３年１１月第２６卷第１１期Ｊ Ｍｅｄ Ｐｏｓｔｇｒａ，Ｖｏ１．２６，Ｎｏ．１１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ。２０１３ ・ｌ１４１・ ３讨 论 Ｅｎｏ和Ｆｂａｌ在白念珠菌菌丝体胞浆内含量丰 富，只有侵袭性感染时才大量释放入血并刺激机体 产生抗体。这２种蛋白已被鉴定为ＩＣ患者和动物 模型中的白念珠菌主要免疫优势抗原 Ｊ。为进一 步研究Ｅｎｏ、Ｆｂａｌ对Ｉｃ的诊断价值，在前期的实验 中，我们克隆表达了这２种重组蛋白。纯化的重组 Ｅｎｏ、Ｆｂａｌ蛋白可与Ｉｃ患者血清特异性结合，而与 健康对照血清无反应，说明这２种重组蛋白与Ｉｃ患 者血清有较好的免疫反应性 Ｊ。 在此基础之上，我们建立了间接ＥＬＩＳＡ法，来 检测血清中的抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ水平。对方法学考查 及试用于临床患者检测结果证明，该方法的敏感性 及特异性均可满足临床实验室要求。以念珠菌血培 养作为金标准，各类念珠菌Ｉｃ患者抗Ｅｎｏ抗体检测 的总阳性率为７２．３％（７３／１０１），抗Ｆｂａｌ抗体检测 的总阳性率为８７．１％（８８／１０１），联合检测可将敏感 性提高至９１．Ｏ％。虽然样本量尚不够大，但得到的 数据足以提示用ＥＬＩＳＡ测定抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ ＩｇＧ抗 体是Ｉｃ早期、快速病原学诊断的有效方法。 本次实验共收集１０１例ＩＣ患者，其中白念珠菌 感染仅２５例，而非白念珠菌引起的感染７６例。这 可能是由于近年来临床抗真菌治疗中氟康唑的普遍 使用使得白念珠菌比例下降，非白念珠菌感染率增 高¨ 。本研究结果表明，非白念珠菌引起的ＩＣ患 者中６８．４％抗Ｅｎｏ抗体阳性，８５．５％抗Ｆｂａｌ抗体 阳性，与白念珠菌感染的Ｉｃ患者的抗Ｅｎｏ抗体、抗 Ｆｂａｌ抗体阳性率比较，差异无统计学意义（Ｐ＞ ０．０５）。这表明利用重组蛋白Ｅｎｏ、Ｆｂａｌ建立的 ＥＬＩＳＡ法，也可用于非白念珠菌感染引起的Ｉｃ的辅 助诊断，扩大了本法的应用范围。但还有待于进一 步探索和制备型特异性抗原，建立相应的血清学分 型方法，用于念珠菌分型的诊断。 研究证明，对ＩＣ患者进行早期诊断能大大改善 其预后情况。Ｍｏｒｒｅｌｌ等 １ 发现，自首次阳性血培养 的血标本采集后开始计时，１２ ｈ内即给予抗真菌治 疗，患者的死亡率仅为１１．１％；１２ ｈ后才开始抗真 菌治疗，患者的平均死亡率高达３３．１％。本实验发 现，在１０１例Ｉｃ患者中有４０．６％（４１／１０１）的抗Ｅｎｏ 抗体、４９．５％（５０／１０１）的抗Ｆｂａｌ抗体阳性早于血 培养１～７ ｄ（因为是回顾性研究，可收集到血培养阳 性前ｌ一７ｄ的血清），这就有利于ＩＣ患者的早期治 疗，降低Ｉｃ患者的病死率。 此外，我们还分析了患者免疫状态对抗Ｅｎｏ、 抗Ｆｂａｌ抗体测定的影响，研究表明粒细胞减少的Ｉｃ 患者，其抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ抗体的阳性检出率明显低 于免疫功能正常的ＩＣ患者（Ｐ＜０．０５），这可能是因 为这类患者免疫功能严重受损，影响了有效地抗体 应答。粒细胞减少的ＩＣ患者中虽然仅有３６．４％ （４／１１）检测出抗Ｅｎｏ抗体、４５．５％（５／１１）检测出抗 Ｆｂａｌ抗体，但这提示免疫抑制的Ｉｃ患者同样也可 以产生抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ抗体，与Ｃｌａｎｃｙ等 和Ｌａｉｎ 等 ｌ 的研究相一致，进一步证明检测抗Ｅｎｏ、抗 Ｆｂａｌ抗体对Ｉｃ具有潜在的临床诊断价值。 总之，我们建立了检测抗Ｅｎｏ、抗Ｆｂａｌ抗体的 ＥＬＩＳＡ法，评估了该法的敏感性和特异性。结果显 示ＥＬＩＳＡ检测念珠菌菌丝相分泌蛋白ＩｇＧ抗体特异 性和灵敏度良好，在念珠菌感染诊断中具有潜在临 床应用价值。 【参考文献】 ｉｌ Ｇｕｄｌａｕｇｓｓｏｎ Ｏ，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ Ｓ，Ｌｅｅ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ａｔｔｉｒｂｕｔａｂｌｅ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｏｆ ｎｏｓｏｃｏｍｉｌａ ｃａｎｄｉｄｅｍｉａ，ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００３， ３７（９）：１１７２—１１７７． ［２］ 李芳秋．重新认识特异性抗体对侵袭性真菌病的诊断价值 ［Ｊ］．医学研究生学报，２０１２，２５（４）：３３７－３４０． ［３］ 路光军，李珍大，邵海枫，等．１０２例真菌败血症菌种分布和 感染相关因素探讨［Ｊ］．医学研究生学报，２００７，２０（４）： ４４３ ． 『４］ Ａｎａｎｅ Ｓ，Ｋｈａｌｆａｌｌａｈ Ｆ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｃａｎｄｉｄｉａ， ｓｉｓ：ｄｉｆｉｆｃｕｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ［Ｊ］．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ， ２００７，５５（５）：２６２－２７２． ［５］夏永祥，高应东．侵袭性真菌感染的实验室诊断进展［Ｊ］． 临床检验杂志，２００８，２６（５）：３９８－３９９． ［６］ 王仕钦，曹王丽，李芳秋，等．白念珠菌烯醇化酶重组蛋白质 的制备及鉴定［Ｊ］．临床检验杂志，２０１０，２８（５）：３５３￣３５５． ［７］ 陆静芬，李芳秋，史利宁，等．白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶重组蛋 白的制备及鉴定［Ｊ］．临床检验杂志，２０１１，２９（５）：３７５－研． ［８］ 中华医学会重症医学分会．重症患者侵袭性真菌感 诊断与 治疗指南［Ｊ］．中华内科杂志，２００７，４６（１１）：９６０ ６６． 『９］Ｐｉｔａｒｅｈ Ａ，Ｓａｎｃｈｅｚ Ｍ，Ｎｏｍｂｅｌａ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｆｒａｃｔｉ￣ｎａ— ｔｉｏｎ ａｎｄ ｔＷＯ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｎｒａｖｅｌｓ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｍｏｒｐｈｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｐｍｔｅｏｍｅ ｌＪ １． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｍｔｅｏｍｉｃｓ．２００２．１（１２）：９６７－９８２． 『１０］ Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＧＭ，Ｅｔｉｚｏｎｄｏ Ｍ，Ａｙａｌａ Ｊ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕ－ ｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｍｏｎｔｅｒｒｅｙ．Ｍｅｘｉｅｏ．ｔｏ ｓｅｖｅｎ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｇｅｎｔｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ３一 ｙｅａｒ（２００４ ｔｏ ２００７）ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｓｔｕｄｙ【Ｊ】．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００８．４６（９）：２９０２－２９０５． 『１ １］ Ｍｏｒｒｅｌｌ Ｍ，Ｆｒａｓｅｒ ＶＪ，Ｋｏｌｌｅｆ ＭＨ．Ｄｅｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｅｍｐｉｉｒｃ ｔｒｅａｔ— ｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａ ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｕｎｔｉｌ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｏｓｐｉｔｌａ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ 『Ｊ］．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００５，４９（９）：３６４０－３６４５． ［１２］Ｃｌａｎｃｙ ＣＪ，Ｎｇｎｙｅｎ ＭＬ，Ｃｈｅｎｇ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｒｅ— ｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｍａｒｋｅｒ８ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ【Ｊ】．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，２００８，４６（５）：１６４７．１６５４． 『１３１ Ｌａｉｎ Ａ，ＭｏｒａｇｕｅｓＭＤ，Ｒｕｉｚ ＪＣ，ｅｔ ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｅｎ— ｚｙｍｅ．１ｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ａｎ— ｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｅｎｏｌａｓｅ ｆｏｒ ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２ｏ０７，１４（３）：３１８－３１９． （收稿日期：２０１３－０１－１１；修回日期：２０１３－０２－１８） （责任编辑：李风华；英文编辑：李晓军）
