维普资讯 http://www.cqvip.com 实验方法 茶萄酸分析方法研究进展 李勤黄建安龚雨顺陈岱卉李娟刘仲华★ (湖南农业大学茶学教育部重点实验室 长沙410128) 摘要:茶氨酸是茶叶中特征成分,研究表明其对人体有着十分重要的生理 功能,故对茶氨酸的分析定量显得十分重要。本文综述了近年来国内外在茶氨酸 分析方面的研究进展。 关键词:茶氨酸;分析方法;研究进展 茶氨酸(Theanine,N一乙基一 一L_谷氨酰胺)是茶树中 一薄层色谱是一种微量分析的分离过程,它将样品点以玻 璃板、铝、塑料等片材为载体的多孔吸附剂薄层的固定相上, 利用特定的流动相在展开室中将混合物中的各组分推移到不 同距离处从而达到分离各不同组分的目的。1986年Feldheim.W 等人以硅胶铺板、活化、点样,展开剂为正丁醇:冰醋酸:水=5:1: 种特殊而在一般植物中罕见的氨基酸。它是1950年由日本酒 户弥二郎从玉露茶新梢中所发现的,并命名为茶氨酸。 口 研究表明茶氨酸的含量与茶叶品质和等级呈正相关(r= 0.787—0.876)并把它作为评价绿茶的重要标志。茶氨酸具有 降压安神、缓解生理及心理紧张、抗肿瘤以及拮抗咖啡碱引 起的神经系统兴奋等重要生理功能【 ]。故快速和精确测定 茶氨酸的含量具有十分重要的意义。 2,展开后用0.2%茚三酮显色的薄层色谱对20个不同质量、不 同来源的红茶样中茶氨酸进行了分析鉴定Il 。 3分光光度法 自茶氨酸发现以来,已经出现碱式碳酸铜沉淀法、非水 滴定法、薄层色谱法、纸色谱法、分光光度法、高效液相色 谱法、毛细管电泳等多种分析方法。现详细归纳如下: 1碳酸锅沉淀法和非水滴定法 茶氨酸的水解产物乙胺的氯代衍生物能氧化碘化钾而析 出碘,在加入淀粉后,溶液颜色即可达到最深,10min内吸光 度稳定,因此可以用紫外检测进行分析定量茶氨酸。2005年 高小红等以热水萃取茶氨酸,加浓盐酸水解为乙胺,利用上 述特性建立了分光光度测定茶叶中茶氨酸含量的新方法Il 。 其氯代衍生物最大吸收波长为570nm,茶氨酸浓度在1.6—10 .因茶氨酸与碱式碳酸铜生成淡紫色柱状铜盐,过去常据 此用碱式碳酸铜沉淀法分离检测茶氨酸l8]。也有采用非水滴 定法分析茶氨酸的含量,以冰醋酸为介质,结晶紫为指示剂, 用0.1mol・L- 高氯酸标准溶液至蓝绿色终点并做空白滴定,根 据高氯酸标准溶液消耗计算茶氨酸含量[9 3。 另外,由于纯品茶氨酸熔点非常稳定,亦可通过测定熔 点值判别制品是否为茶氨酸,并确定制品的纯度Il 。以上方 法仅能测定茶氨酸纯品或较纯品,对于成分复杂样品中的茶 0mg・L- 范围内与吸光度呈线性关系,检出限为3x10-7g・mL- 。 此方法分析结果准确、操作比较简单、可排除茶叶中其它氨 基酸的干扰,直接测定茶叶样品中的茶氨酸获得了满意的结 果。 4氯基酸自动分析仪法 氨基酸自动分析仪原理是利用阳离子交换树脂柱分离, 氨酸含量的分析则不适用。 2纸色灌和薄屡色灌法 柱后茚三酮衍生,紫外分光或荧光检测。日立835—50型氨基 酸仪可以将茶叶中的茶氨酸自行分离检测出来,1989年李布 青等采用该分析仪,在保证茶叶中茶氨酸分离度足够高的前 提下,通过增加柱温(70%)、提高缓冲液流速(0.7m1.min ) 等方法对仪器标准分析方法进行改良,测定茶叶样品中茶氨 酸含量,该方法能准确测定茶氨酸含量,具有快速、精确等 纸色谱法是以滤纸作为支持剂,用一定的溶剂系统(流 动相)使样品各组分展开的色谱方法。1981年阮宇成等运用 纸上色谱法简易定量茶氨酸,采用圆型纸谱水平纸层析法, 点样完毕后,用浓氨水薰滤纸上的样点5min再进行两次层析 (层析剂:正丁醇:冰醋酸:水=4:1:1),然后采用0.5%茚三酮显 色后将茶氨酸斑点剪下(一般离原点4cm位置,R瞄为0.62— 0.65),用60%乙醇洗脱,测定光密度并依据茶氨酸标准曲线 计算茶氨酸含量Il 。随后,邵宛芳等在此基础上将分析过程 根据基层茶叶单位的需要,进行适当简化运用于真假茶鉴别, 取得良好的效果[1 。 特点 ]。 5高效液相色灌法 大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性,标准折射探 测仪对氨基酸检测也无足够的灵敏度,为提高分离检测的灵 敏度和分离特性,通常将其衍生后用紫外检测或荧光检测分析 茶氨酸。1984年美国Waters公司首先推出氨基酸自动分析系统 2007 ̄g 4期 维普资讯 http://www.cqvip.com 实验方法 及技术,采用异氰酸苯酯(PITC)作为衍生剂,柱前衍生,反 相色谱分离的原理,用紫外检测进行氨基酸的分析 。随 后,惠普公司也推出了HPAmino Quant氨基酸分析系统及技 术,采用邻苯二甲醛(OPA)和氯甲酸芴甲酯(FMOC)为衍 生剂,即可用紫外又可用荧光进行检测“ 。1996年我国学者 郭升平对用高效液相色谱法测定茶叶中茶氨酸进行了详细的 研究。其采用WatersM344高效液相色谱仪,以PITC为柱前衍 生剂,反相C。。柱,梯度洗脱,M990--极管阵列检测器,在 UV243nm处检测。其后,2005年朱松等也建立了一种OPA柱 前自动衍生一紫外检测茶氨酸的方法,选用Hypersil ODS C。。 色谱柱,洗脱液为醋酸钠和甲醇混合液进行梯度洗脱,在 UV338nm处检测,测定了茶汁中茶氨酸含量ll 。 1985年MacDonald等人报道,氨基酸类物质与C0。 有配合 作用,能够抑制C0。 催化鲁米诺(Lumino1)与过氧化氢 (H O )的化学发光反应,并建立了氨基酸类标准物质的化学 发光分析方法[18]0 2002年周光明等对茶氨酸抑制催化鲁米诺 (Lumino1)与过氧化氢(H 02)化学发光反应的条件进行了优 化:Co。 的质量浓度为21.Lg・L~,鲁米诺浓度为0.25mmol・L~, H O 浓度为0.5mmol・L 并对茶叶中茶氨酸进行检测 。同 年,DingY等人以阴离子色谱仪联用化学发光检测器对绿茶中 茶氨酸进行了检测_加]。化学发光检测法具有流动相简单易 得、分离不需梯度洗脱、分析时间短等优点。 由于经过衍生的检测方法测定茶氨酸,试样衍生操作繁 琐,干扰因素较多,近年来许多学者尝试建立不需衍生直接 测定茶氨酸的方法。2003年朱小兰等采用高效液相色谱法以 C 。色谱柱、0.05%(体积分数)三氟乙酸水溶液为流动相、检 测波长为203nm,建立了未衍生的高效液相色谱法测定茶叶 中茶氨酸的方法,该方法使用电喷雾离子质谱对分离物质进 行定性 。2006年唐仕荣等以ZorbaxSB--AQ色谱柱,乙腈 :0.1%磷酸溶液=5:95(体积比)为流动相建立了未衍生高 效液相色谱法快速测定茶叶及绿茶提取物中茶氨酸含量的方 法 ]。同年,施倩等人以0.05%三氟乙酸和50%乙腈为流动 相,应用HPLC建立了茶叶中未衍生L一茶氨酸的分析方法,并 对六大茶类中的茶氨酸进行了检测 ]。 高效液相色谱一质谱(HPLC—MS)联用技术是选用液 相色谱(LC)与高选择性、高灵敏度的MS结合,对复杂样品 进行实时分析,即使在LC难分离的情况下,只要通过MS 及 MS 对目标化合物进行中性碎片扫描,则可发现并突出混和物 中的目标化合物,显著提高信噪比,因而近年来越来越多的应 用于茶氨酸的分析。2004年,朱小兰等建立了HPLC—DAD— ESI—MS同时测定茶氨酸、绿原酸、生物碱与儿茶素含量的 方法 ]。同年Desai等人亦以高效液相色谱联用大气压离子 质谱测定了6种商品化茶氨酸样品中的茶氨酸对映体 ]。 蒸发光检测器是通用型检测器,可以检测没有紫外吸收 的物质,恒流速的洗脱液进入检测器后被高压气流雾化后进 入蒸发室,流动相及低沸点的组分先蒸发,剩下高沸点组分 魏2007 ̄4期 的小液滴进入散射池,光束穿过散射池时被散射,散射光转 换为电信号通过计算机转化形成色谱图。2005年李银花等选 用高灵敏度、多用途的蒸发光散射检测器(ELSD)来分析茶 叶样品中的茶氨酸,消除了溶剂的干扰及温度变化所引起的 基线漂移,从而建立了未衍生化高效液相色谱一蒸发光散射 检测器(HPLC--ELSD)测定茶叶中茶氨酸的方法。其选用 0.1%--氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸乙腈溶液为流动相,此 方法基线稳定,重现性好,且不需对茶氨酸进行衍生,避免 了操作的复杂性带来的误差f26 3。 相对于其他方法,高效液相色谱法能简便、快速、灵敏 的对茶氨酸进行定性和定量分析。但是,由于其设备十分昂 贵,不适合一般实验室常规分析。 6毛细管电泳法 近年来,随着分析技术及手段的进步,毛细管电泳技术 也应用于茶氨酸分析领域,其原理是利用带电质点在电场作 用下产生定向运动,而混合物中各组分所带电荷性质、电荷 数量以及分子质量又不尽相同,在同一电场的作用下,各组 分泳动的方向和速度不同,因此在一定的时间内各自移动距 离不同,而可以达到分离鉴定的目的。1997年Hideki Horie等 报道采用毛细管区带电泳(CZE)同时测定儿茶素、咖啡碱、 茶氨酸和抗坏血酸的含量。因咖啡碱吸收峰被提取时所用溶 剂干扰,而且抗坏血酸在200nm处吸收峰很小很难精确分析, 为此,1998年他们报道在流动缓冲液中加入十二烷基硫酸钠, 用二极管阵列检测器代替普通uV检测器,很好的解决了以上 问题E27 3。 2000年Aucamp JP等以束胶电动毛细管色谱法(MEKC), 在pH7.0的25mmol・L 磷酸盐、lOOmmol・L—LSDS、6%甲醇缓 冲体系下,分离电压14KV,温度25℃,检测波长20Ommol・L- 下同时分析了儿茶素、茶氨酸、咖啡因及没食子酸、抗坏血 酸[28 3 0 2004年李平等以MEKC方法,用2,4一硝基氟苯为衍生 剂,缓冲液为pH9.8的0.03mol・L- 四硼酸钠缓冲体系,分离电 压28KV,检测波长360nm,建立了茶氨酸的定量方法 。随 后,他们还利用此方法检测了茶氨酸合成酶的活性 。2006 年张峻萍等人建立一种用MEKC技术直接定量茶氨酸的方法, 并对其条件进行了初步研究[31]。其研究表明,在30mmol・L-- 磷酸盐、50mmol・L~SDS、6%甲醇缓冲体系下,分离电压为 22KV,温度为25℃,检测波长为200nm,茶氨酸可以得到很 好的分离,并能与谷氨酸进行有效区分。 7其他方法 1990年夏静等用生理体液法测定茶叶的中茶氨酸,该法 能分开茶氨酸与谷氨酰胺 ]。2002年中科院生态环境研究中 心设计了一种阴离子交换色谱完全脉冲电流法(AEC—IPAD) 检测绿茶中的茶氨酸和糖类[33]。 8小结 由于茶氨酸含量与茶叶品质成高度正相关且具有众多重 要生理功能,因此研究茶氨酸的准确分析方法显得十分重要。 维普资讯 http://www.cqvip.com 目前较为成熟的检测方法是高效液相色谱法和氨基酸分析仪 法,但是也因仪器价格昂贵、操作过程复杂等缺点难以广泛 推广。未来的研究重点应在简化操作、降低成本、提高灵敏 度、提高稳定性等方面下功夫。 参考文献 [1]宛晓春.茶叶生物化学[M】.第三版:中国农业出版社 2003.34-35. 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