美国红栌组培快繁灭菌措施的研究
摘要 美国红栌的茎段为外植体，运用正交设计对美国红栌在离体初代培养过程中不同灭菌方法的灭菌效果和不同腋芽诱导方法的诱导结果进行了研究。结果表明其最佳灭菌措施为：切取美国红栌茎段→用洗衣粉上清液浸泡15min，并用毛笔刷去材料表面污垢→自来水冲洗30min→超净台上用70%酒精浸泡10s→无菌水冲洗2次→0.1%升汞溶液浸泡8min→无菌水冲洗8次→100mg/L的VC液浸泡10min→无菌水冲洗1次。
关键词 美国红栌；组培；灭菌措施
美国红栌[Cotinus coggyria（Royal purple）]为漆树科黄栌属美国黄栌（C. coggygria）的一个变种，原产于美国，系亚热带树种。美国红栌，落叶灌木或小乔木，树冠卵圆形至半圆形，小枝紫红色，叶片比普通黄栌叶片大。美国红栌，一年三季之中，叶色富于变化：初春时树体的全部叶片为鲜嫩的红色，或紫色，娇鲜欲滴；春夏之交，叶色红而亮丽；至盛夏时节，树体下部叶片开始渐渐转为绿色，但顶梢新生叶片始终为深红色，或紫色，远看彩色缤纷；而入秋之后随着天气转凉，整体叶色又逐渐转变为深红色，秋霜过后，叶色更加红艳美丽。入冬前，美国红栌叶片挂树时间长于普通黄栌，观景时间更长。美国红栌夏季开花，于枝条顶端花序絮状，有淡紫色羽毛状伸长花梗，宿存树梢较久，观之如烟似雾，故又有“烟树”之称，美不胜收。在园林绿化中宜丛植于草坪、土丘、山坡，或混植于其他树群中，尤其是点缀在长绿树群中，可保持1年常红，具有广阔的发展前景。
1材料与方法
1.1材料
以安徽省农科院蚕桑所苗圃内发育良好的美国红栌优株茎段为试验材料。
1.2外植体无菌材料的建立
选取长势良好的美国红栌植株的一年生嫩枝，去除叶片，切成1.5～2.0cm长带节的茎段作为外植体。首先用毛笔 轻轻刷去外植体表面的灰尘，再将外植体用洗衣粉上清液浸泡15min，并用毛笔刷洗材料表面；然后用自来水冲洗0.5h后，在超净台上将外植体材料经过9种不同的灭菌方式处理，每个处理接种20瓶。灭菌方式的具体处理如表1。最后在超静台上将茎段两端切去0.5cm，并接
种于培养基（MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA 0.1mg/L），置于相同的培养条件下[（25±2）℃、光照12h/d、光强2 000～2 500Lx]。每2d调查记录1次材料污染情况，经过2周培养后统计接种材料的灭菌效果，运用SPSS软件进行分析，从而筛选出最佳的灭菌措施。
为了解70%酒精、0.1%升汞和Vc 以及不同培养条件的处理对美国红栌灭菌效果的影响，本试验采用4因素3水平正交设计L9（34）（见表1），每瓶接种1个美国红栌茎段，每个处理接种8瓶，重复3次。70%酒精设置3个水平：a1（10s）、a2（20s）、a3（30s）；0.1%升汞设置3个水平：b1（6min）、b2（8min）、b3（10min）；Vc设置3个水平c1（5min）、c2（10min）、c3（20min）；培养条件设置3个水平：d1（15℃暗培养）、d2（20℃暗培养）、d3（15℃光照培养）。
2结果与分析
培养20d后，统计污染率、成功率、褐变指数（见表2），并进行方差分析。
对褐变指数进行方差分析（见表3），结果表明处理的总效应和a及d因素达到显著水平（P≤0.05），这说明在本试验中酒精的浸泡时间、培养条件对美国红栌褐变程度有显著影响，是影响褐变程度的重要因素。b和c因素的效应均未达到显著水平（P＞0.05），这说明在本试验中升汞浸泡时间和VC浸泡时间对褐变程度的影响不大，不是主导因素。进一步对a因素和d因素进行多重比较。
2.1酒精浸泡时间对褐变程度的影响
由表4多重比较得知，a因素3水平之间a1和a3水平之间差异极显著，a1和a2差异显著。从平均值看a1水平的值最高，所以在灭菌过程中对酒精浸泡时间进行筛选时应选用a1即酒精浸泡10s。
2.2培养方式对褐变程度的影响
由表5多重比较得知，d因素3水平之间d2和d1、d3水平之间差异显著，d1和d3之间异差不显著，这说明对褐变有明显影响的是温度。从平均值看d3水平的值最高，故d3最优，所以在灭菌过程中对培养条件进行筛选时应选用d3，即15℃光照培养。
对污染率进行方差分析结果表明（见表6），处理总效应未达到显著水平（P=0.616＞0.05），这说明在本试验中这几种灭菌措施对污染率的控制没有明显的作用。
由表7方差分析结果表明：处理总效应和b因素、c因素（P=0.012≤0.05）
的作用达到显著水平。这说明在本试验中升汞浸泡时间和Vc浸泡时间对成功率具有显著的影响。进一步对b因素、c因素进行多重比较。
2.3升汞浸泡时间在灭菌过程中对成功率的影响
由表8多重比较得知，b因素3水平之间b2和b1之间差异显著，b1与b3之间差异不显著，由于b2的平均值最高，故在筛选b因素时以b2水平为最佳，即升汞浸泡8min。
2.4Vc浸泡时间在灭菌过程中对成功率的影响
由表9多重比较得知，c因素3水平之间c1与c2、c3之间差异极显著，c2与c3之间差异显著，由于c2的平均值最高，故在筛选c因素时以c2水平为最佳，即Vc浸泡10min。
综上分析，美国红栌灭菌措施最佳组合是a1 b2 c2 d3，即自来水冲洗30min→超静台上70%酒精浸泡10s→无菌水冲洗2次→0.1%升汞浸泡8min→无菌水冲洗8次→100mg/L 的Vc浸泡10min→接种后放在15℃的条件下光照培养。
3结论与讨论
3.1结论
3.1.1美国红栌组织培养条件。培养条件：温度（25±2）℃、光照时间12～14h/d、光照强度1 500～2 500Lx。
3.1.2外植体的选择。美国红栌组织培养的外植体宜选用发育良好的美国红栌优株茎段。
3.1.3外植体无菌体系的建立。美国红栌最佳灭菌方法是：美国红栌茎段→用洗衣粉上清液浸泡15min，并用毛笔刷去材料表面污垢→自来水冲洗30min→超静台上用70%酒精浸泡10s→无菌水冲洗2次→0.1％升汞浸泡8min→无菌水冲洗8次→100mg/L的Vc浸泡10min，将茎段芽两端各切去约0.5cm→取出吸干水分→接种。
3.2讨论
3.2.1外植体的消毒。树木生长周期长，在自然状态下，其各部分表层组织不同程度受到各种微生物的污染。由于枝条长期暴露野外，杂菌污染相当普遍，有些杂菌甚至能够侵入组织内部，导致形成层的内侧均发现有细菌污染，所以在
继代过程中也有可能发生细菌污染。
在本试验中，我们尽量避免阴雨天在田间采取外植体，因为材料经过日晒后可杀死部分微生物。选取的外植体是中上部枝条上带腋芽的茎段，从灭菌效果看，成功率最高可达93.3％，如果在继代过程中一旦发生污染，就很难对其进行2次消毒利用，所以必须在初代时严格做好外植体的灭菌工作。
3.2.2外植体的选择。在以后的试验中，可以尝试采用茎尖、叶片，或采用新生的或新抽的材料如水培抽出的芽条、新萌发的萌条等材料，以获得更高诱导的成功率。
培育无菌苗为外植体是近年来被认为行之有效的办法，即利用种子在无菌的条件下经严格消毒灭菌后培育成无菌苗，然后采用无菌苗茎尖、茎段、叶片等为材料，既可减少污染，其成功率也较高，在今后的试验中可以考虑采用。
3.2.3褐化问题。在组织培养过程中，褐化问题是最难克服的问题之一。当外植体被切割和接种时，损伤的切面细胞中酚类物质会在多酚氧化酶的作用下发生氧化反应，形成有毒的醌类物质，发生褐变。醌会逐渐扩散到培养基中，抑制其他酶的活性，导致组织代谢紊乱，对外植体的脱分化产生严重的影响，毒害整个组织。外植体的褐变也与培养基的成分有关。合适培养基的选择是防治褐化的手段之一。过高的无机盐浓度会刺激外植体的伤口释放更多的酚类物质，加重褐变。采用降低无机盐浓度的培养基可以缓解褐化的发生。这种现象在其他木本植物的组织培养中也有报道。
同时，在灭菌过程中，由于消毒剂具有很强的穿透力和杀伤力，容易杀死或损伤细胞，造成细胞长势不良，释放酚类物质导致褐变，所以消毒剂类型的选择和消毒时间的长短也非常重要。
防止外植体褐变，最常用的方法是在培养基中加人抗氧化剂来抑制酚类物的氧化或用酚类物质吸附剂吸收这些物质。PVP（聚乙烯毗咯烷酮）是酚类物质的专一吸附剂，它可以使多酚化合物不能成为多酚氧化酶的底物，从而抑制褐化的发生。
活性碳是组织培养工作中常用的物质之一，它具有大量小孔和巨大的表面积，吸附能力强，可以吸附一些有害物质的影响，减少其对植株的毒害。但是由于其吸附能力没有选择性，同样会吸附培养基中营养物质和生长激素，从而滞缓植株的生长。在本试验中就发现添加活性碳后，丛生芽的增殖低于未添加活性碳的处理组。
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