病原实验报告

关键词：分离培养、炭疽病、pda培养基、灭菌 前言

柯赫氏法则(koch’s rule)又称柯赫氏假设(kochs postulates)或柯赫氏证病律，是确定侵染性病害病原物的操作程序。如发现一种不熟悉的或新的病害时，就应按柯赫氏法则的四个步骤来完成诊断与鉴定。诊断是从症状等表型特征来判断其病因，确定病害种类。鉴定则是将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，确定其科学名称或分类上的地位。有些病害特征明显，可直接诊断或鉴定，如霜霉病或秆锈病。但在许多场合难以鉴定病原物的属、种。如花叶症状易于识别，要判断由何种病原物引起，就必须经详细鉴定比较后才能确定。 柯赫氏法则表述为：“(1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；(2)该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养；(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出

现症状相同的病害；(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性 【1】状与接种物相同”。 如果进行了上述四步鉴定工作得到确实的证据，就可以确认该微生物即为其病原物。但有些专性寄生物如病毒、菌原体、霜霉菌、白粉菌和一些锈菌等，目前还不能在人工培养基上培养，可以采用其他实验方法来加以证明。侵染性病害的诊断与病原物的鉴定都必须按照

柯赫法则来验证，每个医学家和植物病理学家 都应能熟练地运用。 柯赫氏法则同样也适用来对非侵染性病害的诊断，只是以某种怀疑因子来代替病原物的作用，例如当判断是否缺乏某种元素而引起病害时，可以补施某种元

素来缓解或消除其症状，即可确认是某元素的作用。 1. 材料、仪器与用具

1.1实验材料 柑橘炭疽病或辣椒炭疽病病害部位、pda培养基（自制） 1.2仪器用具

超净工作台、培养箱、培养皿、试管、接种铲、接种针、70%酒精、0.1升汞、电炉等 2. 内容与方法 2.1培养基的配制 “培养基按成分及对成分了解程度分为天然培养基、半组合培养基、组合培养基三类，

从物理性分为固体培养基、液体培养基两种，培养基不同，配制方法 【2】不同。”本实验采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，简称pda培养基。 pda培养基是植物实验室最常用的培养基，主要用于植物病原真菌的分离培养。下面介

绍pda培养基的配制方法：

首先准备优质去皮马铃薯200克、葡萄糖10-20克、琼脂20克，加水至1000ml。 将马铃薯切成小块，加水1000ml煮沸约半小时，煮沸过程中要不断搅拌，然后用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入小块琼脂，加热融化，再加糖，待完全溶化后，趁热分装于三角瓶和试管中，注意每个三角瓶不宜装太多，以少于1/2为宜，试管中用于制备斜面培养基，

也应较少，1/3左右为宜，然后将三角瓶和试管塞好棉塞以备灭菌。 由于pda略带酸性，适于真菌生长，因此不用调节ph值。 2.2灭菌

为了得到某种病原物的纯培养，用于培养病原物的器物和培养基必须经过灭菌才能使用。灭菌前在三角瓶中加入少许孟加拉红抑制细菌和放线菌的生长。本实验采用高压蒸汽灭菌法

对做好的pda培养基和试管内斜面培养基灭菌。 高压蒸汽灭菌法又称湿热灭菌，它是利用高压提高蒸汽温度，达到灭菌的目的，其操作步骤如下：

a、关好清水阀门，放入清水至标准度为止注意水量要加足，否则易造成事故。 b、将要灭菌的培养基、灭菌水等装入铁丝笼中，并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上气盖，旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度，不要太紧，再旋紧相对的两个旋钮，以

达到平衡旋紧，否则易造成漏气不能彻底灭菌。 c、通电加温，同时打开排气活门牌尽锅内的空气，当活门喷出的全是蒸汽的时候即可关闭阀门，一定要排尽空气以达到彻底灭菌的目的，通常压力表上升至5磅时打开放气降至零点再关闭。

d、压力表的指针上升时温度也随之升高，当压力表升至15磅时蒸汽压相当于一个大气压，此时计算灭菌时间，控制热源，使处于15磅压力保持30分钟，就能达到完全灭菌目的，然后停止加温。 e、一般应待压力表降至5磅时稍微打开排气活门，使锅内蒸汽缓慢排除，然后加大活门

开口，勿使排气过快。 f、当压力表降至0时锅内蒸汽完全排尽时，打开锅盖取出培养基。然后将高压锅内水排出。

g、抽取上述培养基放入25摄氏度恒温箱中，48小时不见杂菌证明培养基已达到目的。 有些培养基经高温灭菌后容易失去营养成分，则可采用间歇性蒸汽灭菌法，即每天保持

100摄氏度一个小时连续三天也可达到灭菌效果。 2.3病原真菌的分离培养 为了获得分离菌的纯培养，必须进行分离菌的纯化，本实验采用组织分离法分离炭疽病菌。分离培养一般在超净工作台上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用紫外线照射消毒，工作前将所需物品放在超净工作台内，操作人员需用肥皂洗手，操作时还需用70%的

酒精擦拭双手，操作时呼吸要轻，不要说话。 操作方法如下： a、取灭菌培养基一个置于湿纱布上，在皿盖上表明分离日期、材料和分离人姓名，并分

别将10s、15s、20s、25s四个标示均匀标示到培养皿背面备用。点燃酒精灯。 b、将培养皿拿在手上在酒精灯上烘烤皿口一圈，用无菌培养操作法向培养皿中加入25%乳酸1-2滴，然后将溶化冷至60摄氏度左右的pda培养基倒入培养皿中，每皿倒15-20毫升，

轻轻摇动使成平面，凝固后即成平板培养基。 c、取辣椒或柑橘炭疽病新鲜病叶，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘既

病健结合部切取长宽3-4mm的方形小块病组织数块。 d、取5个灭菌培养皿，两个分别加入75%酒精、0.1%升汞，其余三个加入适量无菌水。将切好的病组织放入75%酒精中浸泡3-5秒（消除表面张力），然后按无菌操作法将病组织移入0.1%升汞液中分别进行表面消毒10s、15s、20s、25s，然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留消毒剂。 e、将漂洗后的病组织放到无菌吸水纸上吸取多余水分，减少细菌污染，然后在酒精灯火线前用无菌操作法分别将消毒时间为10s、15s、20s、25s的病组织各1个分别放入培养皿对

应标识的位置，然后迅速将培养皿盖上。 f、将培养皿放到25摄氏度左右恒温箱内培养。前两天主要观察是否被细菌污染，后两

天主要观察待分离菌生长情况。

g、若病组织长出较为一致的菌落则多半为要分离的病原菌，为确定病原物是否为需要分离培养的病原物，可挑取菌落镜检，观察其形态特征，若与之前看到的一致即为所需病原物。待病原菌生长到一定情况，取出培养皿，在超净工作台内用接种环在菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上（接种环使用前在酒精灯火焰上烘烤数秒，防止杂菌滋生），在25摄氏度左右恒温箱内培养，数日后观察待分离菌生长状况，如无杂菌生长，即得到该病菌的纯菌种，便可置于冰箱中保存。 如需验证此病害，可将分离培养所得病原物通过无菌操作接种到健康的相同植株上，保湿培养数日，观察其所致病害特征是否与原来一致，如一致，可再将其

病原物分离培养观察其性状是否与第一次分离培养的病原物一致。 3. 结果分析 3.1实验结果 分离培养所得病原物菌落多数在平板培养基中生长良好，呈纯白色或灰白色，约有极少数被细菌污染，呈乳胶状，灰色。约3天后接种到斜面培养基中，生长数天后观察生长良好，

无杂菌污染，呈黑褐色。 挑取菌落部分与显微镜下观察，其分生孢子着生于分生孢子盘内壁上，分生孢子梗呈无色或褐色，分生孢子为无色单胞，长椭圆形或新月形，有的分生孢子盘上还长有黑褐色刚毛。 3.2结果分析 本实验过程主要为科赫氏法则的前两步，通过实验操作，了解了分离培养的基本原理和方法，基本掌握了消毒灭菌方法和培养基的制作、无菌操作技术，了解了科赫氏法则的程序

和方法。篇二：雪松病原培养实验报告 陵川雪松病害病原培养实验报告 雪松为松科常绿乔木，是世界三大著名观赏树种之一。由于雪松适应性强，病虫害少，

树形优美，常作为城市庭园和道路绿化树种。 雪松很少发生病害，目前国内报道有以下几种：（1）假蜜环菌引起的根朽病。（2）异担孔菌引起的针叶树根白腐病。（3）蛛形葡萄孢菌引起的雪松枯梢病。（4）松球壳孢菌引起的雪松梢枝病。（5）聚生小穴壳菌引起的雪松溃疡病（6）樟疫霉菌、掘氏疫霉菌和寄生疫霉菌引起的雪松疫病，主要症状为根腐、溃疡、猝倒和立枯，造成植株直立枯死。（7）葡萄孢菌引起的雪松灰霉病，造成嫩梢发生溃疡、枯梢及小枝枝枯。（摘自雪松针叶枯斑病病原鉴定及其生物学特性研究）。以上病害除蛛形葡萄孢菌和松球壳孢菌引起雪松枝梢枯死外，其他5种病害分别危害根茎和干部皮层。引起雪松针叶病害的报道较少,有过报道的有雪松落叶病和雪松赤枯病。 雪松落叶病（松针枯病）是下部的针叶先出现症状，逐渐向上蔓延，严重时全株干枯死

亡，受害的针叶从尖端开始一段一段的发黄；以后逐渐变深褐色。 雪松赤枯病症状为松针受害后先出现黄色段斑，渐变褐，最后呈灰白色或暗灰色，稍凹陷的病斑。病斑与健康组织交界处常有1暗红色的环圈，病部散生黑色小点，即病菌的分生

孢子盘，以叶尖枯死为主。 我们将发病叶片采集回来发现，病叶表面散生有黑色小点，叶尖变白枯死，病斑与健康

组织交界处有暗红色的环圈，我们初步鉴定为 此病为雪松赤枯病。为了更进一步的证明此病的病原，来更有力的鉴定此病害，我们对

此做了病原培养实验。 一、病原菌的分离纯化 1.组织培养：取新鲜雪松病叶用无菌水清洗晾干后，剪取病健交界处组织，大小约3mm左右，在超净工作台内，用75%的酒精消毒1min，用无菌水冲洗3次，用灭菌的滤纸吸干水

分，接种到pda培养基上，在每皿放臵4～5块，臵于25℃恒温培养箱中培养。 培养7天后可以看到菌落中心发黑，边缘发白，可以初步判断为此病有真菌侵染。

a

b 2、病原镜检 将培养7天后的菌落，用已用酒精灯灭菌的挑针挑取一小块黑白交界处的菌块，放臵于用75%的酒精消毒的载玻片上，在光学显微镜下进行镜检。（除了菌落，所有的器具均在超净

台紫外灭菌15分钟以上，整个操作在超净台完成） a

b 从图中可以看到雪松病叶中有真菌侵染，此病原分生孢子为链格孢属，和去年引起水杉赤枯病的病原一样。为了证明此病就是这种病原侵染所致，我们必须再做病原菌的纯化和健

康雪松叶子接种实验。

3、病原菌的分离纯化 （1）分离纯化 将培养7天后形成的菌落，用挑针挑取菌落边缘的新鲜菌丝，转到新新鲜的pda培养基上进行纯化培养。 （2）单孢分离：

将已纯化培养7天后的菌落，待产孢后向平板中加入灭菌水轻微 晃动，进行梯度稀释，至一滴水中含有1～2个分生孢子为最佳。将适宜浓度的孢子悬浮液涂布于水琼脂上，24h后臵于显微镜下观察，用接种针含有单孢子的培养基移入新的pda

培养基上，25℃培养7天，长出的菌落即为水杉病原菌的纯培养物。 通过对其单个分生孢子的形态观察，我们鉴定此分生孢子为半知菌链格孢属，顶端产生

倒棍棒形、椭圆形或卵圆形的分生孢子。 二、接种实验 根据柯赫氏法则，要将分离纯化的病原菌接种到健康的雪松叶子上，如果症状相同，才

可判断引起该病的就是此病原。 接种体的制备：在纯培养物上喷洒无菌水，配臵孢子悬浮液，进行梯度稀释直至一滴水

中含有1-2个分生孢子最佳。 接种：将配好的孢子悬浮液喷洒于已用75%酒精消毒的健康的雪松叶片上，以一小枝为一个处理，放臵于覆盖有两层滤纸的培养皿上进行保湿培养（喷雾不可过多、过湿）。对照用

无菌水进行喷雾，臵 于25℃培养箱中培养，每天观察病叶发病情况。 图6.

刚接种完接种与未接种的健康雪松叶子篇三：1植物病原细菌实验报告(一) 仲恺农业工程学院实验报告纸 （院、系）专业

植物病原细菌的分离、培养和纯化 一、 实验目的 通过对植物病原细菌的分离、培养和纯化，进一步了解和掌握植物病原细菌实验的 技术，

为以后研究和植物病害诊断打下基础。 二、 实验内容

植物病原细菌的分离、培养和纯化 三、 实验仪器及材料 培养皿 剪刀 患病植物组织 75%酒精 镊子 na培养基 接种环 酒精

灯 超净工作台 试管 四、 实验步骤

1) 实验准备：配制na培养基，倒好平板和斜面。

2) 取样：在仲恺农学院植病实验室的花棚中找到患病植株。 3) 用剪刀剪取患病植物组织，剪碎，放入盛有75%酒精的培养皿中进行消毒，并用灭菌水清洗数次。 4) 灭菌后，置入盛有灭菌水的培养皿中制成悬浮液。在无菌操作下，用接种环蘸取悬浮液，在配置好的灭菌的na培养基（牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，琼脂15.0g，均为每升的含量）平板上划线。

5) 接种好的培养皿标记号接种时间和接种人名，置于25℃恒温箱中倒置培养。 6) 7 天后，挑取取数量占优势的菌落进行再次划线纯化培养。 7) 7 天后，挑取单菌落进行斜面接种，保存，以备后用。 五、 实验结果 分离到五种细菌，其中一种菌落黄色粘稠，另一种菌落白色，生长缓慢，可能是植物致

病菌，有待进一步鉴定。篇四：脓汁和粪便标本中病原菌的检验实验报告 脓汁和粪便标本中病原菌的检测 年级专业： 学号： 姓名： 一 实验目的：从脓汁和粪便标本中分离、培养和检测病原体。了解医学微生物学主要的

研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理，树立牢固的无菌观念。 二 实验器材：试管架,酒精灯,污物盘，普通冰箱，隔水式电热恒温培养箱，奥林巴斯 cx21型 生物显微镜，乙醇乙醚，吸水纸，石蜡油，拭镜纸，染色架，革兰染色瓶，1500w电炉，石棉网，手套，酒精棉球，镊子，碘酒棉球,接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、冷藏室、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛

皮纸、橡皮筋、尺子 三 方法与步骤：

1培养基的制备、消毒和灭菌: ○ 1. 调配→溶化→ 矫正ph →分装→灭菌→检定→保存。 2. 干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→灭菌→检定→保存。 ②细菌的分离培养: 采用平板划线分离法，将取脓汁和粪便标本中混杂的多种细菌，分别在普通平板和伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细菌，在37℃培养18～24h ，从而分离出单个菌落。 ③细菌的纯培养：脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落；粪便标本在伊红美蓝

平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。挑选这四种不同菌落分别在斜面培养基上接种 ④细菌的形态学检查：涂片制备 → 干燥 → 固定→ 革兰染色 ⑤细菌的生化试验等 : 糖发酵试验, 细菌药物敏感性试验, 血浆凝固酶试验, 半固体

接种法, 痢疾血清玻片凝集反应 ⑥结果观察、分析、总结 四 结果与讨论 结果讨论：

1. 在制备好培养基后，我们首先采用的是平板划线分离法，从脓汁标本中分离出黄 色和白色两种菌落→在显微镜下观察，这两株细菌均为g+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌→再结合菌落或菌苔颜色，可初步断定，这两株葡萄球菌分别是金黄

色葡萄球菌和白色葡萄球菌→再通过血浆凝固酶试验鉴别，金黄色葡萄球菌是致病菌。 2. 用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌 落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，它们都是g-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。经糖发酵试验，半固

体动力试验，血清学试验结果鉴定，它们分别是大肠埃希菌和福氏志贺菌。 在实验过程中，出现以下情况： 1. 开始做实验的时候，可能是第一次做微生物实验，很多操作都不规范。例如，没有在无

菌操作区进行操作；没有坐着操作；操作时经常会和旁边同学交流；棉塞下端接触到管口外的地方；试管用完后忘记将管口迅速通过火焰3次等等。这些错误的操作的发生，都因

为没有养成无菌操作的习惯，应加以改进。 2. 在培养基上接种培养细菌后，出现有的培养基显示的细菌数量聚集在一起，没有形成单

菌落，这是因为，划线的时候力度不对，把琼脂给划破了，标本都渗进了琼脂里面，再

用接种环划线时也不能将细菌分离。 3. 在进行糖发酵试验时，结果显示该有气体产生的却没有气体产生。这可能是因为我们试

验完成后，管口朝上，反应过程中产生的气体溢出，观察不到正确的实验结果。 综上所述，对病原菌的正确检测对指导临床用药具有重要意义，只有在正确知道细菌种类的情况下才能对菌用药，否则就会容易造成耐药性的产生，不容易治愈疾病。在试验过程中必须严格按照试验的要求去做，操作者应树立一种无菌概念，尽量在无菌环境下操作，既能确保能够得出正确的实验结果，又保证操作者的安全和环境不受污染。篇五：病理实验报告

病理综合实验报告

专业：动物医学 班级：08级4班 姓名： 学号： 一、 实验目的 掌握兔和鸭的解剖方法，观察准确描述病变，根据病变能推断出可能的病，知道治疗此病的方法。

二、 实验原理 每种病都有一些特定的病理变化，在掌握不同病不同的病变时，可根据临床解剖，观察

病变反推病，确定治疗方案，但是要注意病情轻重时不同表象。 三、 实验材料

兔 鸭 手术刀 手术剪 消毒水 一次性手套 解剖盘 四、 实验步骤 1、 2、 3、 取兔和鸭，处死。鸭喉部入刀放血，兔断颈锥处死。 消毒水湿润兔和鸭，观察外观状态。 解剖步骤。十字剪开关节→从腹中线剪开皮肤，剥开皮，观察皮下、肌肉病变→手术刀划开肌肉观察内脏器官的病变→剪开食管和气管→用手术钳剪开头骨，观察。 结束清理干净。 4、

五、 实验结果 六、 实验分析 七、 注意事项

1、 处死时要准确快速，避免出现一些反应，造成误诊 2、 解剖按顺序，边解剖边认真细致观察记录病变，注意手术刀的正确使用， 以免划伤。