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下调Ape1Ref-1在Genistein防护放射性肺损伤和PDT对非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究

来源：九壹网

分类号学号

R734 2002010250

密级公开学校代码 90031

硕士学位论文

下调Ape1/Ref-1在Genistein防护放射性肺损伤和PDT

对非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究

夏蕾

指

导

教

师

王东教授

第三军医大学第三附属医院（所）全军战创伤中心临床医学

硕士专业学位专业名称肿瘤学 2013年5月

论文答辩日期

丁彦青

朱波王东林

2013年5月

导师组成员培

养

单

位

申请学位类别论文提交日期

答辩委员会评阅人

二〇一三年五月

缩略语表..............................................................................................................................1 英文摘要..............................................................................................................................4 中文摘要..............................................................................................................................8 论文正文下调Ape1/Ref-1在Genistein防护放射性肺损伤和PDT对非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究.................................................................................................................11 第一章前言.........................................................................................................11 第二章三羟异黄酮下调Ape1/Ref-1对放射性肺损伤防护作用的实验研究...........13

2.1 材料与方法................................................................................................13 2.2 结果....................................................................................................17 2.3 讨论....................................................................................................24

第三章 Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合HpD-PDT对非小细胞肺癌杀伤作用

的实验研究.........................................................................................................28 3.1 材料与方法................................................................................................28 3.2 结果....................................................................................................33 3.3 讨论....................................................................................................37

全文结论.............................................................................................................................39 参考文献.............................................................................................................................40 文献综述.............................................................................................................................46 研究生期间发表论文情况..................................................................................................60 致谢.............................................................................................................................61

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缩略语表

英文缩写英文全称 APE1

Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1

中文全称

脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶凋亡指数 AI Apoptosis index BER Base-excision bp Base BSA CAR

cDNA complementary d day

DAB Diaminobenzidine DMSO Dimethyl DNA Deoxyribonucleic DSB DSBR EB Ethidium EDTA

FCM Flow FCS

FITC Fluorescein Hepes N-2-hydroxyethyl h hour

HpD hematoporphyrin HRP Horseradish IC inhibiting kb kilobase KD Kilo-doltons min Minute

repair pair Bovine serum albumin

Coxsackie B virus-adenovirus receptor

DNA sulfoxide acid double strand break

DNA double-strand-break repair bromide

Ethylene dianinetraccetic acid

cytometry Fetal calf serum

isothiocyanate

piperaine-N/-2-ethane sulfonic acid

derivative peroxidase concentration 1

碱基切除修复碱基对牛血清白蛋白

柯萨奇B组病毒和腺病毒受体互补DNA 天

二氨基联苯胺二甲基亚砜脱氧核糖核苷酸双链断裂

DNA双链断裂修复溴化乙锭乙二胺四乙酸流式细胞分析胎牛血清异硫氰酸荧光素

N-2-羟乙基哌嗪-N/-2-乙磺酸

小时

血卟啉衍生物辣根过氧化酶抑制剂量千碱基对千道尔顿分钟

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MMR Mismatch repair MOI multiplicity of infection

错配修复感染复数

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-NER NSCLC

nt nucleotide OD Optical OGG1 8-oxoguanine PBS PCR-CTPP

PFA Polyformaldehydum PDT Photodynamic PI Propidium PLL Poly-L-Lycine PMSF PTGS

Ref-1 Redox RGS

RIF radiation-induced RILI

RIP radiation-induced RNA Ribonucleic RNAi RNA ROS rpm siRNA s second

SCGE shRNA

tetrazoliumbromide

Nucleotide excision repair non-small cell lung carcinomas

density

glycosylase-1 Phosphate buffered saline polymerase chain reaction with confronting two-pair primers

therapy iodide phenylmethyl sulphonyl fluoride posttranscriptional gene silencing

factor-1 relative gray scale

fibrosis radiation-induced lung injury

pneumonitis acid interfering Reactive oxygen species rounds per minute Small interfering RNA Single cell gel electrophoresis Short Hairpin RNA

二苯基四氮唑嗅盐核苷酸切除修复非小细胞肺癌核苷酸光密度

8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1 磷酸盐缓冲液

两对引物-聚合酶链反应

多聚甲醛光动力疗法碘化丙锭多聚赖氨酸苯甲基磺酰氟转录后基因沉默机制氧化还原因子相对灰度值放射性肺纤维化放射性肺损伤放射性肺炎核糖核酸 RNA干扰活性氧分子每分钟转速小干扰RNA 秒

单细胞凝胶电泳短发夹RNA

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SLDR sublethaldamage repair SPF SSB TUNEL

Specific Pathogen Free single strand break

亚致死损伤修复无特殊病原体单链断裂四甲基乙二胺 TEMED N,N,N',N'- tetramethyl-ethylenediamine TdT-mediated biotin-dUTP nick-end labelling TdT介导dUTP缺口末端标记

Tris tris(hydroxymethyl) VEGF XRCC1

8-oxo-G 8-Oxoguanine

aminometnane vascular endothelial growth factor X-ray repair cross-complementing 1

三(羟甲基)氨基甲烷血管内皮细胞生长因子 X线修复交叉互补基因1 8-羟基鸟嘌呤

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Study of down-regulation of Ape1/ Ref-1 expression by genistein is associated with mitigating the effect of radiation and killing effect of photodynamic therapy on

human non-small cell lung cancer

Abstract

Radiation-induced lung injury (RILI) is a severe complication commonly found as a result of nuclear war or accident, total body irradiation before stem cell transplantation and the radiotherapy of thoracic tumors. However, the current clinical treatment cannot efficiently prevent RILI and the further fibrosis, which results in a high mortality rate. There are two major obstacles in the treatment of RILI: 1. the oxidative injury of DNA. 2. The inflammatory cytokine cascade induced by the driven oxidative stress and the activated target cells such as alveolar epithelial cells type Ⅱ, and vascular endothelial cells, etc., that were driven by the oxygenated intermediate product of reactive oxygen species (ROS). Regarding the oxidative injury of DNA, the studies of radio-biology have revealed DNA as the major target of ionizing radiation (IR). Either through a direct ionizing or an indirect mechanism of ROS, the IR can lead to the oxidation of the purine and pyrimidine in the cells, the absence of bases (AP site), the single-strand breaks and the associated double-strand breaks. Almost all the living cells including human cells have four pathways of DNA repairing: Nucleotide excision repair, base excision repair, double-strand break repair and mismatch repair. These are basic defense and protection mechanisms of the cells to maintain the stability and integrity of the genome. The present studies have also reported that the apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1(APE1, also known as redox factor-1Ref-1) is not only the major rate-limiting enzyme of the DNA base excision repair pathway, but also a protective gene that defenses oxidative stress-induced apoptosis through the regulation of several transcription factors redox state. Previous studies have suggested that the -κB(NF-κB) may regulate the inflammatory cytokine cascade reaction which leads to non-targeted effects, which plays a key role in the cause and the amplification of

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radiation-induced lung injury. The research on the inhibition of NF-κB activity may provide a new platform for the development of special treatment of the radiation-induced lung injury. Polyphenols small molecule compounds genistein can inhibit NF-κB DNA binding activity by reducing the increase of radiation-induced Ape1/Ref-1 expression.

However, the expression characteristics, regularity and reaction mechanisms of Ape1 / Ref-1 protein in the radiation-induced lung injury are still unclear. The effective measures of RILI prevention and control are also missing. The investigations of these problems are highly desirable in clinics to improve the RILI treatment and prevention..

Study objective

1. To investigate the effect and the molecular mechanism of the genistein (GEN) in the protection against the RILI by depressing the expression of Ape1/Ref-1, which provide theoretical basis to the prevention and treatment of the RILI.

2. To study the killing effect of human lung adenocarcinoma (A549) and the molecular mechanism of the photodynamic therapy (PDT) induced by a combination of Ad5/F35-APE1 siRNA and hematoporphrphyrin derivative (HpD). To further investigate the pathway of Ape1/Ref-1-NF-κB in the prevention of RILI, hence enrich the knowledge of the molecular biological effect of Ape1/Ref-1.

Materials and methods

1. The development and amplification of the Ad5/F35-APE1 siRNA recombinant adenovirus;

2. The observation of the RILI prevention effect of genistein: the mouse model of radiation pneumonitis protected by the genistein and amifostine was developted (compared with the control group): genistein and amifostine were given at various times. The pathological morphology and the hydroxyproline content in the lung tissue were examined. Using the methods of liquid-phase chip, double antibody sandwich method, and ROS-specific fluorescent probes, the inflammatory cytokines (IL-1, TNF-α, IL-6, TGFβ1) / inflammatory cell number and changes of the intracellular ROS level in the serum and bronchoalveolar lavage fluid were detected. These were conducted to clarify the protective effect, the timing of administration, the dose/effect and time/effect relations of genistein, as a preparation for the next experiments.

3. The discussion on the mechanisms of genistein in protecting the target cells of RILI

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(alveolar type II epithelial cells and endothelial cells). In this controlled study, the technologies of Western blot and EMSA were used to detect the increased expression of Ape1/Ref-1 caused by the genistein induced depression of radiation. The same methods were also adopted to investigate the effect on the activeness of the NF-κB as a result of the depressed expression of Ape1/Ref-1 by Genistein.

4. Regulate the impact and possible mechanism of synergistic effect of Ape1/Ref-1: The exogenous intervention (Ape1/Ref-1 RNAi transfection) was applied to affect the inhabitation of the A549 cell proliferation; The APE1 protein expression and the activity of NF-κB were detected by Western blot method and EMSA method respectively in order to validate the reduced synergistic effect of the Ape1/Ref-1 and NF-κB and the possible mechanisms.

Results

1. The observed effect of the genistein (GEN) in the protection against the RILI: The pathological test indicated that the degree of the pulmonary fibrosis in the RILI mice increased with the time after irradiation. However, genistein can relief the inflammation and fibrosis of the lung tissue. After irradiation, the increasing trends of TGF-β1, IL-6, IL-1, TNF-α and other inflammatory cytokines were also observed in serum and bronchoalveolar lavage fluid. An increased hydroxyproline level in the lung tissue was also found. Genistein can reduce the level of a variety of inflammatory cytokines and hydroxyproline content (P <0.05). Especially if genistein was given 24 hours before irradiation, a comparable efficacy can be achieved as amifostine was given 30 minutes before irradiation.

2. The genistein protective mechanism of RILI: the content of ROS in A549 cells was significantly elevated after irradiation, yet the genistein significantly reduced the expression of intracellular ROS; The genistein can reduce the radiation-induced increase of APE1 protein and NF-ΚB expression (P <0.05).

3. verify the affect on the NF-κB synergies by regulating Ape1/Ref-1:After the introduction of the HpD-PDT, the inhibition of A549 cell proliferation and the increase of apoptosis were significantly higher than that in the control group (P <0.05). The inhibition efficiency depended on the HPD concentration and the laser dose. The combination of Ad5/F35-APE1 siRNA and PDT displayed a stronger proliferation inhibition of A549 cells. The intracellular levels of ROS and the expression of inflammatory factors increased

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significantly (P <0.05). HpD-PDT induced enhancement of APE1 protein expression by A549 cells reached the peak at 24h. The APE1 expression in the A549 cells infected by 10MOI Ad5/F35-APE1 siRNA recombinant adenovirus was inhibited most significantly at 48 hours.

Conclusion

1. Based on the studies on the mouse model of RILI, the expression of nucleoprotein APE1/Ref-1 in the lung tissue was significantly increased, showing the characteristics of shifting from the nucleus to the cytoplasm which increased first and then decreased; The radiation can induce an increased expression and andectopic expression of APE1/Ref-1, hence affect the repair of RILI through DNA damage repair and / or redox functions.

2. APE1/Ref-1 is a regulatory factor of inflammatory factors. The levels of TGF-β1, IL-6, IL-1β and TNF-α in the serum / lavage fluid were predictors of RILI. This study provides new experimental evidence to predict the incidence of RILI.

3. Important protective role against RILI of genistein by regulating APE1/Ref-1 expression was verified and the regulatory mechanism was clarified. Genistein can significantly reduce the inflammatory exudate in the alveolar space, the hydroxyproline content in the lung tissue and collagen deposition in the RILI mice. The mechanism is associated with the depression of ROS level to reduce the expression of APE1/Ref-1 and NF-κB, hence decrease the secretion of inflammatory factors. This study provides new means for the prevention and treatment of RILI.

4. Genistein has unique advantages of the protection against RILI. Regarding the radiotherapy of lung cancer, genistein does not only protect against RILI by depressing the expression of Ape1 / Ref-1, but also increase the radio-sensitivity of lung cancer cells by regulating the DNA damage repair and Redox dual function.

Keywords: Lung cancer; RILI; Genistein; Ape1/Ref-1; ROS; NF-κB; HpD-PDT;

Ad5/F35-APE1 siRNA; hydroxyproline.

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下调Ape1/Ref-1在Genistein防护放射性肺损伤和PDT对

非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究

摘要

放射性肺损伤(Radiation-induced lung injury, RILI)是战时或平时如核武器损伤、核辐射事故、造血干细胞移植预处理以及胸部肿瘤放疗的常见严重并发症，且目前的临床救治措施并不能有效预防或转归放射性肺炎及进一步的纤维化，病死率极高。制约放射性肺损伤治疗的关键问题一个是DNA氧化损伤，一个是含氧中间产物活性氧(reactive oxygen species，ROS)驱动氧化应激、启动肺泡Ⅱ型上皮细胞和血管内皮细胞等靶细胞产生的炎性细胞因子级联反应。对于DNA氧化损伤，电离辐射的生物学研究表明，细胞DNA是电离辐射(IR)最为主要的靶分子，IR可通过直接电离和ROS间接作用致细胞嘌呤和嘧啶碱基氧化、碱基缺失(AP位点)以及单链断裂进而形成双链断裂，人体细胞乃至所有生物细胞都存在着核苷酸切除修复、碱基切除修复、双链断裂修复和错配修复等四个较为完善的DNA修复通路，这是细胞维持基因组稳定和完整的一种基本防御及保护机制。目前的研究表明，脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1,APE1)又称为氧化还原因子( redox factor-1，Ref-1)，它不仅是DNA碱基切除修复途径的主要限速酶，还是一种能通过多种转录因子氧化还原状态，对氧化应激诱导细胞凋亡具有防御作用的保护基因。已有研究提示辐射诱导的核转录因子-κB(NF-κB)可能在调节炎性细胞因子级联反应产生非靶向性效应，从而在介导和放大放射性肺损伤中发挥关键作用，针对抑制NF-κB活性的研究将可能为开发放射性肺损伤特殊的治疗方法提供一个平台。多酚类小分子化合物三羟基异黄酮具有下调辐射所致Ape1/ Ref-1表达增加从而抑制NF-κB DNA结合活性功能。但目前关于Ape1/ Ref-1蛋白在放射性肺损伤的表达特点、规律及作用机制尚不清楚，也无明确有效的RILI防治措施，严重制约着放射性肺损伤的防治，研究阐明这些问题对提高放射性肺损伤的救治水平有非常重要的意义。

研究目的

1. 研究三羟异黄酮(genistein, GEN)下调Ape1/ Ref-1 的表达对放射性肺损伤的保护作用及其分子机制，为防治放射性肺损伤提供理论依据。

2. 研究Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合血卟啉衍生物（hematoporphrphyrin

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derivative, HpD）介导的光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）对人肺腺癌细胞A549的杀伤作用及其分子机制，进一步验证在放射性肺损伤防护中Ape1/ Ref-1-NF-κB的作用途径，理论上进一步丰富我们对Ape1/ Ref-1分子生物功能的认识。

研究内容和方法

1. Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒的构建、扩增；

2. 三羟异黄酮防护放射性肺损伤的效应观察：建立三羟异黄酮及氨磷汀防护放射性肺损伤小鼠模型（与对照组比较）：不同时间给予三羟异黄酮及氨磷汀，检测组织病理形态、肺组织羟脯氨酸含量；应用液相芯片法、双抗体夹心法、ROS特异性荧光探针技术检测血清、肺泡灌洗液中炎性细胞因子（IL-1、TNF-α、IL-6、TGFβ1）/炎性细胞数和胞内ROS含量的改变；以明确三羟异黄酮的防护效应、给药时机、量效和时效关系，为下一步实验做准备；

3. 三羟异黄酮防护放射性肺损伤靶细胞（肺泡II型上皮细胞和内皮细胞）的机制探讨：应用对照研究，采用Western blot法及EMSA等技术检测三羟异黄酮下调辐射所致Ape1/Ref-1表达增加；三羟基异黄酮下调Ape1/Ref-1表达对NF-κB活性的影响；

4. Ape1/Ref-1对协同效应的影响及可能机制：应用外源性干预（Ape1/Ref-1 RNAi转染）对A549细胞增殖抑制影响；Western blot法及EMSA法分别检测APE1蛋白的表达及NF-κB活性影响来验证下调Ape1/Ref-1与NF-κB的协同效应及可能机制。

研究结果

1. 三羟异黄酮防护放射性肺损伤的效应观察：病理检测显示照射后时间越长，放射性肺损伤小鼠肺纤维化越重，三羟异黄酮能减轻肺组织炎症及纤维化；照射后小鼠血清及肺泡灌洗液中TGF-β1、IL-6、IL-1和TNF-α等炎性因子和肺组织羟脯氨酸的含量也呈递增趋势，三羟异黄酮能降低各种炎性因子和羟脯氨酸的含量(P<0.05)，尤其是照射前24h给予三羟异黄酮能达到与照射前30分钟给予氨磷汀类似的疗效。

2. 三羟异黄酮防护放射性肺损伤的机制探讨：经射线照射后，A549细胞内ROS含量明显升高，三羟异黄酮能明显降低胞内ROS的表达；三羟异黄酮能下调放疗所致的APE1蛋白及NF-ΚB表达的升高（P<0.05）。

3. 验证Ape1/Ref-1对NF-κB协同效应的影响：HpD-PDT作用后，A549细胞增殖受抑、凋亡增加显著高于对照组（P<0.05），其抑制效率依赖于HPD浓度及激光剂量，同时Ad5/F35-APE1 siRNA联合PDT对A549细胞具有更明显的增殖抑制作用，胞内ROS含量及炎性因子的表达显著升高（P<0.05）。HpD-PDT诱导A549细胞

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APE1蛋白表达增强在24h达到高峰，10MOI Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒感染A549细胞48小时抑制APE1表达最为显著。

结论

1. 放射性肺损伤小鼠模型研究显示，辐射诱导肺组织核蛋白APE1/Ref-1表达显著增高，呈现由胞核向胞浆移位并先增高后降低特征；辐射诱导APE1/Ref-1表达增加和异位表达，可通过其DNA损伤修复和/或氧化还原功能影响放射性肺损伤修复。 2. APE1/Ref-1是炎性因子的因子，血清/ 肺泡灌洗液TGF-β1、IL-6、 IL-1β和TNF-α含量是放射性肺损伤的预测指标。研究发现为预测放射性肺损伤的发生提供了生物学预测指标。

3. 三羟异黄酮APE1/Ref-1表达防护放射性肺损伤的重要作用并阐明了其机制。三羟异黄酮可显著减轻放射性肺损伤小鼠肺泡腔内炎性渗出以及肺组织羟脯氨酸含量和胶原纤维沉积，其作用机制与其降低APE1/Ref-1及NF-ΚB表达从而减轻炎性因子分泌有关。研究发现为放射性肺损伤的防治提供了新的手段和方法。

4. 三羟异黄酮对防护放射性肺损伤具有独特优势。对于肺部肿瘤放射治疗，三羟异黄酮在下调Ape1/ Ref-1表达防护RILI的同时，尚可通过其DNA损伤修复和Redox双功能增加肺癌细胞放射治疗敏感性。

5. Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒能显著增强A549细胞PDT敏感性，主要是通过2种机制实现的：一方面通过抑制A549细胞PDT后的DNA损伤修复能力；另一方面通过抑制A549细胞对PDT所致氧化损伤的修复。

6. PDT可诱导肺腺癌A549细胞APE1蛋白表达增强，但通过Ad5/F35-APE1 siRNA可抑制PDT诱导的APE1蛋白的表达。

关键词：人肺腺癌细胞；放射性肺损伤；三羟异黄酮；Ape1/Ref-1；

光动力学疗法；血卟啉衍生物；Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒； ROS；NF-κB；炎性因子；羟脯氨酸。

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第一章前言

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，居所有恶性肿瘤死因的首位，其发病率及死亡率呈逐年增长的趋势。放射治疗是胸部肿瘤最主要的治疗手段之一，而放射性肺损伤( radiation-induced lung injury, RILI) 包括放射性肺炎(radiation-induced pneumonitis, RIP) 和放射性肺纤维化(radiation-induced fibrosis, RIF)作为胸部肿瘤放疗常见的严重目前普遍认为由ROS (reactive oxygen 并发症和剂量因素，尚缺乏有效防护手段[1]。system, ROS)驱动氧化应急反应启动的“炎性细胞因子级联效应”是介导和放大RILI的核心事件[2-5]。已有研究证实，核转录因子-κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）可为电离辐射刺激活化，通过上调NF-κB DNA结合活性介导炎性细胞因子释放，抑制NF-κB能有效减轻炎性反应[6, 7]。明确电离辐射活化NF-κB的信号通路是选择性抑制NF-κB活性的分子靶点。多功能蛋白脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/ 氧化还原因子（apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1/ redox factor-1, Ape1/Ref-1），作为一种重要的低氧诱导细胞凋亡、坏死和氧化应激的保护基因，具有DNA氧化还原和损伤修复双功能，能通过改善生物体对缺氧和氧化应激的适应性，最大程度地减轻细胞损伤[8]。Ape1/Ref-1是DNA碱基切除修复(base excision repair, BER)的关键限速酶[9]，是基因毒性药物致伤、细胞放射性损伤及其他氧化损伤的重要修复因子。Ape1/Ref-1通过氧化还原机制调节AP-1、p53、myb、HIF-1α，NF- κB等转录因子的DNA结合活性及下游靶基因VEFG等表达，而参与氧化应激、细胞周期及凋亡等多种关键的细胞反应[10]。这些转录因子与肿瘤氧化损伤的耐受密切相关，因此就可能通过下调Ape1/ Ref-1表达抑制NF-κB活性, 而增加Ape1/ Ref-1表达则激活NF-κB[11, 12]。我们前期研究证实5,7,4/-三羟基异黄酮（genistein）是一种值得深入研究的辐射防护剂[13]，然而，三羟异黄酮是否能通过下调Ape1/ Ref-1表达降低NF-κB活性从而防护RILI仍不清楚。

5,7,4’-三羟基异黄酮（genistein）是多酚类化合物中的一种特殊类型，是大豆异黄酮的主要成分。我们前期的研究已证实三羟基异黄酮可依赖其类雌激素活性并通过直接刺激血细胞生成防护放射性造血损伤[14]。RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 是由双链RNA (double-strand RNA, dsRNA) 引起的转录后基因沉默机制(posttranscriptional

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gene silencing，PTGS) ，具有序列高效性、低毒性及特异性，RNAi作为一项全新的基因阻断技术，是当前最具卓越应用前景的抗肿瘤基因治疗方式,近年倍受人们的关注和研究[15]。因对细胞天然的感染性，病毒载体成为重要的基因载入手段，目前腺病毒载体、逆转录病毒载体和AAV载体等病毒载体已经成功应用于导入shRNA(short hairpin RNA)。其中，腺病毒载体具有宿主范围广、感染效率高、无DNA整合、包装容量较大、制备方便且易纯化和浓缩等特点，成为目前基因治疗研究和临床试验中应用最为广泛的病毒载体之一[16]。

本研究拟复制放射性肺损伤小鼠模型，通过不同时间点给予三羟异黄酮及氨磷汀，重点观察RILI发生发展及其与血清、肺泡灌洗液中炎性细胞因子（IL-1、TNF-α、IL-6、TGFβ1），细胞内的ROS和肺组织羟脯氨酸含量的时效关系，阐明三羟异黄酮对RILI的防护效应；同时应用RT-PCR、ELISA、EMSA技术和RNA干扰沉默Ape1/Ref-1基因，以期探讨下调Ape1/Ref-1抑制NF-κB活性在三羟异黄酮防护放射性肺炎中的作用。本研究从Ape1/Ref-1基因角度探讨三羟异黄酮协同抗炎和抗氧化分子机理，从理论上进一步丰富了三羟异黄酮对辐射损伤的防护作用。

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第二章三羟异黄酮下调Ape1/Ref-1对放射性肺损伤防护作用

的实验研究

放射治疗是胸部肿瘤最主要的治疗手段之一，而放射性肺损伤( radiation-induced lung injury, RILI) 包括放射性肺炎(radiation-induced pneumonitis, RIP) 和放射性肺纤维化(radiation-induced fibrosis, RIF)作为胸部肿瘤放疗常见的严重并发症和剂量因素，目前尚缺乏有效防护手段[1]。DNA的氧化损伤和ROS (reactive oxygen system, 已有研究证实，ROS)驱动的“炎性细胞因子级联效应”是制约RILI治疗的关键问题[2-5]。

核转录因子-κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）可为电离辐射刺激活化，通过上调NF-κB DNA结合活性可以介导炎性细胞因子的释放，相反，抑制NF-κB能有效减轻炎性反应[6, 7]。多功能蛋白脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/ 氧化还原因子（apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1/ redox factor-1, Ape1/Ref-1）是NF-κB的氧化还原激活子，因为下调Ape1/ Ref-1表达可抑制NF-κB活性；反之，增加Ape1/ Ref-1表达则可激活NF-κB[11, 12]。既往研究证实5,7,4/-三羟基异黄酮（genistein）是一种值得深入研究的辐射防护剂[14]，研究证实，三羟异黄酮可通过下调Ape1/ Ref-1表达降低NF-κB活性从而增强治疗前列腺癌的敏感性[12]。然而，三羟异黄酮是否能通过下调Ape1/ Ref-1表达降低NF-κB活性从而防护RILI目前仍不清楚。因为“炎性细胞因子级联效应”是介导和放大RILI的核心事件，而NF-κB活性与炎性细胞因子释放密切相关，我们推测三羟异黄酮可通过Ape1/Ref-1—NF-кB—炎性因子途径防护RILI。因此, 在本研究中，我们检测APE1/ Ref-1在RILI不同阶段以及给予三羟异黄酮处理后的表达，并通过在体和离体试验观察照射后NF-кB的变化，同时与氨磷汀（Amifostine，WR-2721）对照研究小鼠肺组织的病理改变、血清和肺泡灌洗液炎性因子及羟脯氨酸含量的变化，以期阐明三羟异黄酮可通过Ape1/Ref-1—NF-кB—炎性因子途径对RILI的防护效应，为放射性肺损伤的治疗提供新的手段。

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.1.1 主要仪器和设备 LEICA AM 2135型切片机

德国Leica

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电热恒温干燥箱 BX-50型显微镜 PM-20型显微摄像系统电子天平电子酸度计温控微波炉 5415型台式离心机 79-1型磁力加热搅拌器水平电泳仪和电泳槽凝胶成像系统 PH计微量移液器超低温冰箱 96孔板

5804型台式冷冻离心机 Precise 全数字化直线加速器电热恒温水浴箱

2.1.1.2 主要试剂和试剂盒鼠抗人APE1单克隆抗体 DPX封片剂甲醛 H2O2

Power VisionTM(IgG抗体-HRP多聚体)复合物DAB显色试剂盒甲醇三羟异黄酮氨磷汀 DCF探针

鼠抗人β-actin单克隆抗体

EMSA试剂盒 ThermoFisher ELISA试剂盒 14

上海跃进医疗器械厂日本Olympus

日本Olympus 美国sartotius 美国Beckman 中国Galanz 德国Eppendorf 江苏中大仪器厂美国Bio-Rad 美国Bio-Rad 美国sartotius 法国GILSON 美国NUAIRE AB gene 德国Eppendorf ELEKTA 公司北京长风仪器仪表公司

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北京中杉金桥生物技术有限公司

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cientific

深圳NeoBioscience公司

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羟脯氨酸试剂盒 2.1.1.3 主要试剂配制 1.1 3% H2O2-甲醇

30% H2O2 甲醇 1.2 0.01mol/L PBS

0.2mol/L PB NaCl 双蒸水 2.1.2 方法

2.1.2.1 动物、细胞株

南京建成科技有限公司

50ml

定容至500ml

50ml 8.8g

定容至1000ml

8周龄C57BL／6J雌性小鼠60只，体重(20±2)g，购于第三军医大学大坪医院实验动物中心，利用随机数字表把小鼠分为4组：①对照组（Control组）10只；②单纯照射组（R组）10只；③三羟异黄酮+照射组（GEN+R组）30只；④氨磷汀+照射组（Ami+R组）10只。三羟异黄酮(纯度≥98%，Sigma Inc) 以生理盐水为溶剂，分别于照射前24小时、16小时、8小时，以200mg/Kg皮下注射[17.18]；氨磷汀(印度太阳药业Inc) 以生理盐水为溶剂，按100 mg/kg于照射前30分钟皮下注射；均饲养于标准层流动物房。人A549肺腺癌细胞株（ATCC序列号CCL-185）：由第三军医大学新桥医院肿瘤研究所惠赠，常规传代培养。

2.1.2.2 照射方法

1%戊巴比妥钠肌肉注射（50mg/Kg）充分麻醉小鼠，采用特制塑料鼠夹固定，8MV X线( Precise 全数字化直线加速器，ELEKTA 公司)，吸收剂量率0.5Gy／min，SSD=100cm行全胸照射[19]。对照组小鼠在同等条件下肺部假照射0 Gy，其余各组小鼠单次全胸照射(12±0.2)Gy。

2.1.1.3 肺组织病理学观察

解剖小鼠，取左肺组织于10％的中性甲醛固定，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片（5μm）、HE染色及Masson三联染色，在光学显微镜下观察肺组织的病理改变。 2.1.1.4 流式分析仪检测细胞ROS含量

将2.0×105个/孔对数生长期的A549细胞接种于24孔板，每孔0.5ml，贴壁后分为6组：对照组、单纯照射5Gy组、单纯照射10Gy组、单纯三羟异黄酮组、三羟异黄酮+照射5Gy组(Genistein+IR 5Gy组)、三羟异黄酮+照射10Gy组(Genistein+IR 10Gy组)；

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三羟异黄酮按终浓度30μmol/L于照射前24小时加入，以8MV X线，吸收剂量率0.5Gy／min，分别照射5 Gy或10 Gy；处理结束后继续培养24小时；用500ul的DMSO充分溶解DCF(Sigma Inc) 1.7mg；配制50mmol/L NaOH溶液，取500ul加入DCF中，溶液呈荧光黄绿色；室温下避光孵育30min；取15ml离心管加入6ml PBS，将已激活的DCF加入其中，置于冰上备用；处理结束后用PBS洗细胞一次，用2%血清/PBS稀释DCF探针（1:20），而后加入各培养孔继续培养1h；探针装载结束后用PBS收集细胞，然后PBS洗细胞2次；应用流式细胞仪检测细胞内ROS含量。 2.1.1.5 Western-blot检测APE1蛋白表达

取照射后各组小鼠右肺组织提取总蛋白，上样后转膜1.5小时，鼠抗人APE1/ Ref1 多克隆抗体(1：200 ，Novus公司) 孵育1.5小时，HRP 标记的二抗(1：2000 ，Pierce公司) 孵育1.0小时，化学发光试剂盒( Pierce 公司)显色。 2.1.1.6 EMSA法测定NF-ΚB的表达

将2×105个/ 孔A549细胞接种于24孔板培养板，设对照组、单纯Genistein组、单纯照射5Gy组、Genistein+IR 5Gy组，三羟异黄酮终浓度为30μmol/L，于照射前24小时加入；以8MV X线，吸收剂量率0.5Gy／min，分别照射5Gy，照射完毕后各培养孔继续培养12h。收集细胞按试剂盒说明书提取细胞核蛋白（Pierce公司）备用。分别取照射后3天各组小鼠右肺组织按试剂盒说明书提取细胞核蛋白（Pierce公司）备用。NF-ΚB

探针：5’TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG NF-ΚB-R，

5’AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC NF-ΚB-F。按照EMSA试剂盒说明书（Thermo Fisher Scientific）进行NF-ΚB的检测。

2.1.1.7 双抗体夹心ELISA法测定血清及肺泡灌洗液中的炎性因子表达

照射后2周，1%戊巴比妥钠肌肉注射（50 mg/kg），充分麻醉后摘除眼球，行眶静脉采血，血液搜集至干净的EP管，静置30分钟后，1000 rpm离心3分钟，取上清置于干净EP管中，-70℃冰箱保存。切开颈部皮肤游离气管后，用医用留置针行气管插管，每次用1ml的生理盐水灌洗全肺并收集支气管肺泡灌洗液（BALF），重复3次，共回收约2ml，4℃，1000 rpm离心10分钟，收集上清液置于-70℃冰箱保存。按试剂盒说明书采用ELISA法测定血清及肺泡灌洗液中的IL-1β、TNF-α、IL-6、TGFβ1，绘制标准曲线，计算上述炎性因子浓度。分别于照射后4、8、12周，1%戊巴比妥钠肌肉注射（50 mg/kg）麻醉小鼠，充分麻醉后摘除眼球，行眶静脉采血，血液收集至干净的EP管，静置30分钟后，1000 rpm离心3分钟，取上清置于干净EP管中，-70℃冰箱保存。按ELISA试剂盒（NeoBioscience公司）说明书测定血清中的TGFβ1，绘制标准曲线，计算TGFβ1

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炎性因子浓度。

2.1.1.8 湿肺羟脯氨酸含量测定

采用比色法测定肺组织内羟脯氨酸含量。羟脯氨酸试剂盒购自南京建成科技有限公司。分别于照射后4、8、12周，解剖小鼠，取出右肺组织，精确称取右上叶肺组织匀浆，加入水解液后以95℃加热水解，冷却后加入颜色指示剂和调pH的甲液，混匀，再加调pH的乙液直至指示剂颜色变成黄绿色，调整PH值在6-6.8左右，然后加蒸馏水至10ml,混匀后取3ml稀释水解液，与适量活性炭混匀，离心后取上清1ml，依次加入试剂一、二、三各0.5ml混匀，60℃水浴15分钟，离心后取上清在550nm处做分光光度计检测。以每100毫克肺组织中含羟脯氨酸量的微克数表示。

2.1.3 资料分析及统计学处理

各组计量资料均用x±s表示，进行多样本均数两两比较的单因素方差分析和t检验，P＜0.05有统计学差异。采用SPSS 13.0软件进行分析。

2.2 结果

2.2.1 小鼠肺组织形态学观察

对照组小鼠肺组织结构清晰，肺泡壁及毛细血管壁完整，无肺萎陷，支气管腔及肺泡腔内未见炎性渗出物（图2.1A）。而单纯放疗组肺组织照射后3d病变以渗出为主，肺间质及肺毛细血管水肿、充血，肺泡腔及细支气管内见较多的炎性细胞，间质水肿致肺泡壁轻度增厚，肺泡间部分含水肿液（图2.1B）。单纯照射后第4周和8周，可见肺组织实变区呈斑片状分布，在支气管周围尤为明显。肺泡壁中度增厚，壁内成纤维细胞和毛细血管数目增多，尚见淋巴细胞、巨噬细胞及多核巨细胞；肺泡腔缩小，腔内可见巨噬细胞簇集成团，局部可见陈旧性出血灶。纤维化区可见大量增生的纤维细胞和胶原纤维沉积，炎性细胞相对较少，出现明显的局灶性纤维化（图2.1C）。Gen+IR组各个时间点肺组织亦呈急性炎性到肺间质纤维化改变，但胶原沉积、成纤维细胞灶形成以及炎性细胞浸润较单纯照射组明显减轻（图2.1D-图2.1G），尤其是Gen 24h+IR组（图2.1F、G）和Ami+IR组（图2.1H、I），大部分肺泡结构完整，仅见少量肺泡壁中度增厚，肺间质少量淋巴细胞浸润，肺泡间隔无明显增宽，支气管、血管周围少量纤维胶原组织。Masson三联染色结果显示小鼠肺间质内沉积大量蓝色胶原纤维，对照组仅见少量纤维组织（图2.2A）；单纯照射组于照射后2周肺纤维组织逐渐开始增生（图2.2B），照射4周、8周后形成明显的肺纤维化，肺组织结构紊乱，并可见大量染成蓝色的胶原纤维沉积（图2.2C、D）。

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图2.1 小鼠肺照射后组织形态学改变（HE ×400)）

A：对照组；B：IR组3d；C：IR组8周；D：Gen8h+IR组8周；E：Gen8h+IR组12周；F：Gen24h+IR

组8周；G：Gen24h+IR组12周；H：Ami+IR组8周；I：Ami+IR组12周；

图2.2 小鼠肺组织Masson三联染色显示肺组织在受照射后胶原纤维的变化（Masson×400）

A：对照组；B：照射后2周；C：照射后4周；D：照射后8周

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2.2.2 活性氧（ROS）含量的测定

与对照组比较，A549细胞经照射后细胞内ROS水平明显升高（p<0.05）；而Genistein联合照射处理显著地降低了细胞内ROS的生成，与对照组差异不明显，但相比单纯照射组则显著降低（p<0.05）（见图2.3），说明Genistein能够有效地抑制射线所激发的靶细胞内大量活性氧物质的产生。

图2.3 流式细胞术分析A549细胞内ROS含量

2.2.3 Genistein对放射性肺损伤小鼠肺组织Ape1/Ref-1表达的影响

Western blot结果显示，对照组小鼠肺组织Ape1/Ref-1表达各时相点变化不大，而在照射组小鼠肺组织Ape1/Ref-1表达随着小鼠放射性肺损伤的发生发展呈现先增高后降低规律，照射后1d Ape1/Ref-1表达开始升高，第3d达高峰，明显高于对照组（p<0.05），约是对照组2.2倍，此后随着小鼠放射性肺损伤发展逐渐降低，第28d与对照组水平相当，而第56d则仅为对照组的1/5（p<0.05）（图2.4）。于照射开始前24h皮下注射三羟异黄酮200mg/ Kg，照射后3d，Western blot结果显示，照射组Ape1蛋白表达量最高，其次为对照组，再次为单纯GEN组，而Genistein+IR组表达量最低，提示Genistein可显著降低放疗诱导的Ape1/Ref-1表达升高（图2.5）。

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图2.4 Western blot 检测放射性肺损伤小鼠肺组织Ape1/Ref-1各时相点的表达

图2.5 Western blot 检测genistein对放射性肺损伤小鼠肺组织Ape1/Ref-1表达的影响

2.2.4 EMSA检测放射性肺损伤小鼠肺组织及A549细胞中NF-ΚB的表达分别取照射后3天各组小鼠右肺组织提取细胞核蛋白检测NF-ΚB的表达，其结果显示：对照组小鼠肺组织中NF-ΚB的表达较低，其余各组与对照组相比均有所增高，说明照射后肺组织中NF-ΚB的表达均不同程度增加，以单纯放疗组增加最显著（p<0.05）。经三羟异黄酮和氨磷汀分别预处理后NF-ΚB的表达增加不明显，说明照射前24小时给予三羟异黄酮及照射前30min给予氨磷汀可以明显降低肺组织中NF-ΚB的表达，而照射前16小时及8小时给予三羟异黄酮则没有类似的作用（见图2.6）。A549细胞经照射后NF-ΚB的表达明显增高，而给于genistein预处理后NF-κB表达量有所降低，说明下调Ape1/ Ref-1表达可抑制NF-κB活性（见图2.7）。

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图2.6 EMSA检测放射性肺损伤小鼠肺组织中NF-ΚB的表达（1、Genistein 24h+IR组；2、Genistein 16h+IR组；3、Genistein 8h+IR组；4、Amifostine +IR组；5、单纯照射组；6、对照组）

图2.7 EMSA检测A549细胞中NF-ΚB的表达（1、单纯照射组；2、Genistein+IR组；3、单纯Genistein组；4、对照组）

2.2.5 ELISA分析放射性肺炎小鼠血清和肺泡灌洗液中各炎性因子的表达 2.2.5.1 IL-1β蛋白含量

应用ELISA法检测三羟异黄酮对小鼠血清和肺泡灌洗液IL-1β蛋白表达的影响。与对照组相比，除照射前24h给予三羟异黄酮组小鼠肺泡灌洗液中IL-1β蛋白含量外，其余各组均显著升高（P＜0.05），提示肺放射性损伤时存在IL-1β蛋白高表达。与单纯放疗组相比，照射前24h给予三羟异黄酮组和照射前30min给予氨磷汀组小鼠IL-1β蛋白显著降低（P＜0.05），而照射前8h, 16h给予三羟异黄酮无明显差异（P＞0.05），表明经皮下注射途径应用三羟异黄酮防护放射性肺损伤，须在照射前24h给予才能达到照射前30min应用氨磷汀的类似疗效，能显著降低血清和肺泡灌洗液中IL-1β蛋白含量（见表2.1, 表2.2）。

2.2.5.2 TNF-α蛋白含量

应用ELISA法检测三羟异黄酮对小鼠血清和肺泡灌洗液TNF-α蛋白表达的影响。与对照组相比，照射前24h给予三羟异黄酮组小鼠血清TNF-α蛋白含量以及照射前16h,

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24h 给予三羟异黄酮组肺泡灌洗液TNF-α蛋白含量无显著差异（P＞0.05），而其余各组均显著升高（P＜0.05）。与单纯放疗组相比，照射前给予三羟异黄酮各处理组和氨磷汀组小鼠血清TNF-α蛋白均显著降低（P＜0.05），而肺泡灌洗液TNF-α含量在照射前16h、24h给予GEN+R组也存在明显差异（P＜0.05），表明TNF-α可较为敏感地预测三羟异黄酮防护放射性肺损伤效应（见表2.1, 表2.2）。

2.2.5.3 IL-6蛋白含量

应用ELISA法检测三羟异黄酮对小鼠血清和肺泡灌洗液IL-6蛋白表达的影响。与对照组相比，除外照射前16h给予三羟异黄酮组和氨磷汀组小鼠血清IL-6，其余各组IL-6均有显著升高（P＜0.05）；与单纯放疗组相比，照射前8h给予三羟异黄酮组小鼠血清IL-6含量明显升高（P＜0.05），其余各组IL-6含量虽有所降低，但差异亦不显著（P＞0.05），而在肺泡灌洗液中各处理组IL-6蛋白含量均显示明显降低（P＜0.05），提示相比肺泡灌洗液，血清IL-6含量并非预测三羟异黄酮防护放射性肺损伤的合理指标（见表2.1, 表2.2）。

2.2.5.4 TGFβ1蛋白含量

应用ELISA法检测三羟异黄酮对小鼠血清和肺泡灌洗液TGFβ1蛋白表达的影响。与对照组相比，除照射前24h 给予三羟异黄酮组小鼠肺泡灌洗液中TGFβ1蛋白含量外，其余各组均显著升高（P＜0.05），表明肺放射性损伤小鼠血清和肺泡灌洗液均存在TGFβ1蛋白高表达，提示TGFβ1是预测急性放射性肺炎的较为敏感指标。与单纯放疗组相比，照射前24h 给予三羟异黄酮组小鼠血清TGFβ1显著降低（P＜0.05），而肺泡灌洗液TGFβ1含量三羟异黄酮各处理组以及氨磷汀组均显著降低（P＜0.05），提示TGFβ1可较为敏感地预测三羟异黄酮防护放射性肺损伤效应（见表2.1, 表2.2）。

表2.1 IL-1β、TNF-α、IL-6、TGFβ1在各组小鼠血清中的含量（n=10, pg/ml, x±s） IL-1β TNF-α IL-6 对照组单纯放疗组 GEN 8h+IR组 GEN 16h+IR组 GEN 24h+IR组 Ami+IR组

TGFβ1

90.52±4.61 27.84±1.49 11.22±1.72 22353.18±52.88 215.09±7.38* 63.11±2.37* 26.01±9.51* 71421.59±40.81* 244.11±2.31* 55.12±4.18*◇252.26±7.38* 37.02±3.57*◇

39.75±1.06*◇ 67138.16±1163.00* 14.45±2.19 62776.32±1097.88*

129.±4.03*◇ 32.58±2.67◇ 17.63±5.55* 52927.63±15621.48*◇ 170.23±9.43*◇ 38.81±2.90*◇

15.40±5.53 63538.81±73.50*

P<0.05与“对照”相比，◇ P<0.05与“单纯放疗组”相比。

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表2.2 IL-1β、TNF-α、IL-6、TGFβ1在各组小鼠肺泡灌洗液中的含量（n=10, pg/ml, x±s）

IL-1β TNF-α IL-6 TGFβ1 对照组单纯放疗组 GEN 8h+IR组 GEN 16h+IR组 GEN 24h+IR组 Ami+IR组

103.98±4.15 529.42±23.00 320.87±6. 532.57±37.51* 972.40±43.97* 948.48±56.49*

127.37±8.19 650.00±8.93*

454.41±39.81* 867.49±20.00* 658.0±54.09*◇ 493.88±2.51*◇ 310.30±13.65* 570.21±31.44◇ 480.50±21.21*◇115.19±7.52◇ 544.42±14.23◇ 442.52±31.31*◇

253.42±69.59* ◇ 159.59±0.91◇

223.02±7.72*◇ 1.35±14.82* 698.48±7.13*◇ 374.76±1.73*◇

P<0.05与“对照”相比，◇ P<0.05与“单纯放疗组”相比。

2.2.6. 肺组织羟脯氨酸的含量变化

各组结果分析显示，照射后随时间延长，各组小鼠肺组织羟脯氨酸含量逐渐增高，说明照射后肺组织胶原蛋白水平上升，间接反映了其纤维化程度加重，是小鼠发生肺间质纤维化的一个指征。与对照组相比，照射后4w，GEN+IR各组及氨磷汀+IR组羟脯氨酸含量无显著差异（P＞0.05），维持在基本正常水平，而照射后8w、12w，GEN+IR各组及氨磷汀+IR组羟脯氨酸含量高于对照组（P＞0.05）；在照射后3个时间点上，GEN+IR各组和氨磷汀+IR组羟脯氨酸含量均明显低于单纯放疗组（P＜0.05），说明通过皮下注射途径给予三羟异黄酮可以明显抑制辐射引起的肺组织羟脯氨酸含量增高，与氨磷汀的效果类似，表明三羟异黄酮对小鼠放射性肺纤维化具有一定的防治作用（见表2.3）。

表2.3 各组小鼠双肺组织羟脯氨酸含量(n=10, ug/100mg, x±s) 对照组单纯放疗组 GEN 8h+IR组 GEN 16h+IR组 GEN 24h+IR组 Ami+IR组

4周

8周 12周

51.206±0.878 51.206±0.878 51.206±0.878 146.781±0.492 149.793±6.243 156.211±5.296 87.010±1.430◇ 90.580±2.049◇ 93.130±0.102◇ 76.252±6.960◇ 92.014±0.512◇ 97.340±0.716◇ 79.569±18.872◇ 85.924±1.586◇ 94.0±0.615◇ 77.579±0.459◇ 78.084±0.051◇ 94.150±1.627◇

◇ P<0.05与“单纯放疗组”相比。

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2.2.7. ELISA分析放射性肺纤维化小鼠血清TGFβ1的含量

照射后随时间延长，各组小鼠血清中TGFβ1的表达也逐渐增强，照射后12w达到高峰（P＜0.05）。在照射后4w、8w和12w这三个时间点上，GEN+IR各组及氨磷汀+R组TGFβ1含量均高于对照组（P＜0.05），表明肺放射性纤维化小鼠血清中存在TGFβ1蛋白高表达，提示TGFβ1与放射性肺纤维化的发生发展密切相关，是预测放射性肺纤维化的较为敏感指标；同时，与单纯放疗组相比，GEN+IR各组小鼠TGFβ1含量均明显降低（P＜0.05），该作用与Ami+R组比较无明显差异（P>0.05），提示三羟异黄酮对放射性肺纤维化的保护作用与氨磷汀类似（见表2.4）。

表2.4 各组小鼠血清TGFβ1含量(n=10, pg/100mg, x±s)

对照组单纯放疗组 GEN 8h+IR组 GEN 16h+IR组 GEN 24h+IR组 Ami+IR组

4周

8周 12周

25085.53±32.90 25085.53±32.90 25085.53±32.90 59328.95±52.63 61953.95±72.37 63723.68±0.00 45572.37±32.474◇

51782.±85.53◇ 55625.0±3361.84◇

31993.42±1230.26◇ 31875.0±1177.632◇ 55118.42±2776.32◇ 31769.74±59.21◇ 32572.37±32.◇ 58500.0±618.42 306.47±59.21◇ 46539.47±92.11◇ 48335.53±72.37

◇ P<0.05与“单纯放疗组”相比。

2.3 讨论

恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康。放射治疗是胸部肿瘤最主要的局部治疗手段之一[20]，而放射性肺损伤( radiation-induced lung injury, RILI) 包括放射性肺炎(radiation-induced pneumonitis, RIP) 和放射性肺纤维化(radiation-induced fibrosis, RIF)作为胸部肿瘤放疗常见的严重并发症和剂量因素，其发生率达5~15%，一旦发生，通常引起严重的临床后果[21]，临床上亟待寻找一种理想的辐射防护剂。

放射性肺损伤动物模型建立对进一步研究放射性肺损伤机制及防治至关重要。目前以建立放射性肺损伤鼠类动物模型应用最为广泛。虽然小剂量多次照射被认为更符合临床常规治疗剂量，但对放射肺损伤进行短期研究，目前多采用大分割单次照射法，如孟玲玲等采用6MV-X线单次照射小鼠右肺30Gy，观察至照射后2个月[22]。在本实验中我们应用8周龄C57BL/ 6J雌性小鼠，采用12Gy全肺单次照射构建放射性肺损伤模型，通过肺组织HE、Masson染色检测小鼠肺组织炎性病理改变和胶原纤维沉积，ELISA

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法检测TNF-α、IL-1β、IL-6 和TGF-β1等炎性因子表达，以及比色法测定肺组织羟脯氨酸的含量，我们成功构建放射性肺损伤小鼠动物模型，与刘英等[23]和韩光等[24]报道的相似。

新近的研究认为放射性肺损伤( radiation-induced lung injury, RILI)的发生是一个由多种细胞参与并相互作用而产生的多种因子共同的复杂病理过程[25.26]。一旦靶细胞即肺泡Ⅱ型上皮细胞、血管内皮细胞等受辐射损伤后，立即合成和分泌多种生长因子和抑制因子，并持续至放射后数周至数月，如肿瘤坏死因子 (TNF)、纤维母细胞生长因子β(FGFβ)、转化生长因子(TGFβ)、表皮生长因子(EGF)、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、血小板源性生长因子(PDGF)和纤维连接素(fibronec-tion)等[27.28]，其中TGFβ1起着关键性的作用[29.30]。已有研究证实肺泡II型上皮细胞和纤维母细胞是表达TGFβ1的主要细胞；TGFβ1主要作用于胶原的转录和翻译过程，诱导肺脏高水平表达结缔组织生长因子，加速肺纤维化发生[31、32]。TGFβ1高表达的患者发生放射性肺纤维化的几率较低表达水平者要高，且更严重。新近的研究结果均表明，肺的成纤维细胞增殖和细胞外基质增加应归咎于肺实质细胞产生的TGFβ1的作用，TGFβ1是诱发放射性肺纤维化的主要细胞因子。羟脯氨酸是胶原纤维中特有的一种成分，占正常胶原蛋白的13.4％左右，其含量恒定，参与了肺纤维化的发展，能直接反映肺组织内胶原纤维的变化情况。分析羟脯氨酸含量可以为病理状态下的肺纤维化提供一个可靠的量化指标，已广泛应用于肺纤维化的研究。本研究中，我们应用ELISA法检测放射性肺炎小鼠血清和肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β、IL-6 和TGF-β1蛋白表达的变化，发现电离辐射均可导致四种炎性因子表达显著升高，其中TGFβ1, IL-1β相比较TNF-α和IL-6更是较好地预测放射性肺损伤的敏感指标。这与国内外其他学者认为血浆TGF-β1水平可作为放射性肺损伤预测因子的研究结果相一致[33-36]。同时，我们应用ELISA法检测放射性肺纤维化小鼠血清TGF-β1表达的变化和比色法检测肺组织中羟脯氨酸含量的变化，发现电离辐射可导致TGFβ1和羟脯氨酸表达显著升高，照射后随着时间延长，TGFβ1和羟脯氨酸的表达亦逐渐增强，其表达水平的高低反映了放射性肺纤维化的严重程度，其中血清的TGFβ1相比较肺组织的羟脯氨酸更能敏感地预测肺放射性肺纤维化。

目前放射性肺损伤最常用的治疗方法仍是使用肾上腺皮质激素，同时辅以抗生素、支气管扩张剂、给氧等对症治疗措施，但并不能有效预防或逆转放射性肺炎及进一步的肺纤维化。我们前期研究证实5,7,4/-三羟基异黄酮（genistein）是一种值得深入研究的辐射防护剂，genistein是多酚类化合物中的一种特殊类型，是大豆异黄酮的主要成分[14]。本研究结果清楚的显示：在总体趋势上，除对照组外，其余各实验组小鼠的肺

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组织按照射后时间延长呈现由肺泡炎至肺纤维化的动态变化，与文献报道一致[20]。照射前24小时, 16小时或8小时皮下注射三羟异黄酮与照射前30 min皮下注射氨磷汀组比较，各组肺组织均出现急性炎症到肺纤维化变化，但与单纯放疗组对比，炎症范围缩小，肺间质及肺泡壁毛细血管充血情况减轻，炎性渗出减少，后期胶原纤维增生减少，表明放疗前给予Genistein可明显缓解急性放射性肺炎及放射性肺纤维化反应，与氨磷汀一样对放射性肺损伤有明显的防护作用。

近年来大量研究发现，核转录因子-κB (NF-κB）在介导炎性细胞因子释放中扮演着重要角色[6, 7]，三羟基异黄酮淬灭辐射诱导的自由基和抑制氧化应激诱导的NF-κB DNA结合活性是其抗辐射作用的主要分子基础[37-39]。前期的研究证实，三羟基异黄酮可通过下调Ape1/ Ref-1表达降低NF-κB活性[11]。本研究通过Western bolt方法检测Ape1/Ref-1在小鼠放射性肺损伤不同阶段的表达情况发现Ape1/Ref-1表达先增高后降低：照射后1d开始升高，3d达高峰，约是对照组2.2倍，此后随着小鼠放射性肺损伤发展逐渐降低，28d降至对照组水平，56d明显低于对照组，约是对照组的1/5。这可能与电离辐射产生的大量ROS使肺组织细胞处于氧化应激状态，从而代偿性合成Ape1/Ref-1蛋白以满足参与细胞氧化应激反应的转录因子，而随着放射性肺损伤进展，肺损伤修复过程中消耗的Ape1/Ref-1蛋白超过了肺组织细胞的合成有关[40]。照射前24h给予genistein预处理，采用Western Blot法检测表明，单纯放疗组Ape1/Ref1蛋白表达量最高，其次为对照组，再次为单纯GEN组，而Genistein+IR组表达量最低，故可以认为给予Genistein预处理降低了放疗所致的Ape1/Ref1蛋白升高。已有研究表明，Ape1/Ref-是NF-κB的氧化还原激活子，下调Ape1/ Ref-1表达可抑制NF-κB活性，增加Ape1/ Ref-1表达则激活NF-κB[11, 12]。本研究通过在体和离体试验均取得一致的结果：照射后NF-κB的表达明显增加，而给于genistein或Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒预处理后NF-κB表达量有所降低，Genistein+Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒协同处理后表达量最低，进一步验证Ape1/Ref-是NF-κB的氧化还原激活子。

研究结果还显示：射线能明显地刺激靶细胞内产生大量ROS，Genistein能有效抑制照射后细胞内ROS表达的升高；应用ELISA法检测三羟异黄酮对小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β1等急性炎性因子表达的影响，研究发现三羟异黄酮经皮下注射途径给药防护肺损伤，须在照射前24h给予才能达到照射前30min应用氨磷汀的类似疗效，降低炎性因子表达，相比IL-1β，TNF-α是预测三羟异黄酮防护放射性肺损伤效应的较为敏感指标，而肺泡灌洗液IL-6水平相比血清是预测三羟异黄酮防护放射性肺损伤的合理指标。本研究还发现，在照射后4w、8w、12w，各实验组小鼠

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TGFβ1相对含量明显高于对照组，这种增高的趋势从第4周就开始，第12周达到高峰，而羟脯氨酸的含量也逐步增加，两者动态的变化趋势与小鼠肺纤维化的病理发展过程相关，至于TGFβ1不仅是预测急性放射性肺损伤的较为敏感指标，而且可较为敏感地预测三羟异黄酮防护放射性肺损伤效应TGFβ1较羟脯氨酸更能敏感合理地预测放射性肺纤维化。Genistein能明显抑制照射后TGFβ1和羟脯氨酸的表达，在所测的3个时间点上Gen+IR各组和Ami+IR组的TGFβ1和羟脯氨酸的相对含量都低于单纯照射组，且均维持在较低水平，特别是照射前24h给予三羟异黄酮能达到照射前30min应用氨磷汀的类似疗效。

总之，Genistein可防护放射性肺损伤，其机制之一可能是通过降低Ape1/Ref1蛋白表达从而下调NF-κB以此减少炎性因子合成来实现的。随着分子生物学研究的进一步发展，Genistein防护放射性肺损伤的更多分子机制将被逐一揭开，这必将会为临床防护放射性肺损伤提供一条新的、有效的治疗途径。

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第三章 Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合HpD-PDT对非小

细胞肺癌杀伤作用的实验研究

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，居所有恶性肿瘤死因的首位，且其发病率和死亡率呈逐年增加趋势，尽管手术、放疗、化疗和生物治疗等有了长足进步，但目前肺癌患者的长期生存率仍不理想，亟待探索肺癌治疗新手段[41. 42]。血卟啉衍生物（hematoporphrphyrin derivative, HpD）介导的光动力治疗（Photodynamic therapy，PDT）利用肿瘤细胞选择性吸收光敏剂并在特定波长激光照射下活化光敏剂产生光化学反应杀伤细胞的肿瘤微创治疗方法，在肺癌治疗中具有重要地位[43. 44]。在有氧条件下，PDT通过合适波长光激发靶细胞内光敏剂产生活性氧物质（reactive oxygen species，ROS）直接损伤肿瘤细胞、使微血管受损造成癌组织血流灌注减少以及产生多种炎性因子而致细胞发生凋亡或坏死。肺癌细胞可表达脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（apurinic apyrimidinic endonuclease，APE1）[45]，APE1/ Ref-1作为一种氧化应激和低氧诱导细胞凋亡、坏死的重要保护基因，具有氧化还原和DNA损伤修复的双功能，并通过调节生物体对氧化应激和缺氧的适应性，最大程度地减少细胞损伤[46]。本研究应用本室前期构建的重组腺病毒Ad5/F35-APE1 siRNA干扰载体，采用MTT、流式细胞术法、ELISA法和Western blot检测HpD-PDT对A549细胞的杀伤作用，为今后以APE1为靶点联合HpD-PDT治疗肺癌提供理论依据。

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.1.1 主要仪器和设备低温离心机超净工作台 CO2细胞培养箱 -80℃超低温冰箱 PH计

DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱凝胶成像系统

德国Heraeus公司苏州净化设备公司美国Thermo公司日本Sanyo 美国sartotius

上海精密实验股份设备有限公司美国Bio-Rad公司

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CKX41型倒置显微镜水平电泳仪电热恒温水浴箱电子天平

5804型台式冷冻离心机直线加速器 TS-1型脱色摇床 DMN-9602酶标分析仪 Elixl Rios纯水系统 79-1型磁力加热搅拌器电热恒温干燥箱 630PDT 激光治疗仪 5415型台式离心机 3.1.1.2. 主要材料和试剂鼠抗人APE1单克隆抗体 SDS

RPMI 10培养基胎牛血清 TEMED

磷酸盐缓冲液(PBS) 青霉素链霉素

聚丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺鼠抗人β-Actin单克隆抗体胰蛋白酶

N’N’-亚甲双丙烯酰胺，丙烯酰胺四甲基偶氮唑盐(MTT) Triton X-100 BSA 尿素甲酰胺

日本OLYMPUS 美国Bio-Rad

北京长风仪器仪表公司美国sartotius 德国Eppendorf 瑞典ELEKTA

江苏海门其林贝尔仪器制造公司北京普朗新技术有限公司美国Millipore公司江苏中大仪器厂上海跃进医疗器械厂德国Diomed公司德国Eppendorf

美国Novus Biologicals 美国Ameresco 美国Hyclone 美国Hyclone 美国Ameresco

北京中杉金桥生物技术有限公司华北制药股份有限公司华北制药股份有限公司美国Ameresco 美国Sigma 美国Hyclone 美国Ameresco 美国Sigma 美国Ameresco 美国Ameresco 美国Ameresco 美国Ameresco

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葡聚糖凝胶

T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK) 6×上样缓冲液 [γ-32P]ATP X光片

二硫苏糖醇(DTT) 二甲基亚砜(DMSO) 血卟啉衍生物(HpD) Vybrant® Apoptosis Assay Kit 鼠抗人Rb单克隆抗体抗鼠IgG-HRP二抗抗鼠IgG-TRITC二抗化学发光试剂 DAB显色试剂盒 RPMI 10培养基低熔点琼脂溴化乙啶(10mg/ml) Hepes

PMSF，Aprotinin，Leupeptin 3.1.1.3 细胞株

美国Ameresco

宝生物工程(大连)有限公司宝生物工程(大连)有限公司北京市福瑞生物工程公司美国Pierce 美国Ameresco 美国Sigma

重庆华鼎现代生物制药公司美国Invitrogen 美国Santa Cruz 美国Pierce 美国Pierce 美国Pierce

北京中杉金桥生物技术有限公司美国Hyclone

北京夏新生物有限公司美国Promega 美国Hyclone 美国Sigma

人A549肺腺癌细胞株(ATCC序列号CCL-185)：由第三军医大学新桥医院肿瘤研究所惠赠。

3.1.1.4 腺病毒

Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒：参照Wang D [54]设计的有效APE1 siRNA序列，应用Ambion公司在线设计软件(www.ambion.com)确定APE1 siRNA cDNA序列，并由第三军医大学大坪医院肿瘤中心Xiang DB博士根据此序列设计构建Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒，本元正阳公司包装生产，病毒颗粒数3.8×1011 VP/mL，感染性滴度1.6×1010 TCID50/mL，其包装流程见图3.1。

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图3.1 重组腺病毒Ad5/F35-APE1 siRNA包装流程图

3.1.2 方法

3.1.2.1 MTT法检测Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合HpD-PDT对A549细胞增殖抑制作用

将1×105/ ml A549细胞100μl接种于96孔板培养板，设对照组、单纯HpD-PDT组和Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合HpD-PDT组，1 mg/ ml HPD 贮存液用RPMI10 完全培养基稀释至2.5、5、10、20μg/ ml 4个浓度，照光设0.5、1、2、4、6、8、10 J / cm2 7种剂量，每组有6个复孔。HPD浓度为5μg/ ml，按7种激光剂量0.5、1、2、4、6、8、10 J / cm2对5、10MOI Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒感染组A549细胞进行PDT照射，每组有6个复孔。370C、5 % CO2 孵箱中培养24 h 贴壁后加入不同浓度HpD的完全培养基200μl，再避光培养24 h使细胞充分吸收HpD，予不同剂量激光照射后立即换新鲜的10 完全培养基再继续避光培养24 h。将上述处理的细胞每孔加入MTT 溶液(5 g/ L) 20μl ，继续避光培养4h后终止培养，每孔加入

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150μl DMSO，振荡10min，使紫色结晶完全溶解，在492 nm处用酶标仪检测各组OD值，重复3次取均值，根据测得的OD值按如下公式计算出细胞相对抑制率[ 7]：

相对抑制率(%)=（对照组OD值—实验组OD值）/对照组OD值×100% 3.1.2.2 流式分析仪检测细胞凋亡

将1×105/ ml A549细胞100μl接种于96孔板培养板，设对照组、单纯HpD-PDT组、单纯Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒组和Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒+HpD-PDT组，PDT组按HPD浓度为5μg/ ml，光照剂量4 J / cm2进行照射，Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒感染剂量为10MOI；PDT24h后收集各组细胞，计数后调整细胞浓度为5×105-1×106/ml；取1ml细胞，4℃ 800g转速离心5min，弃上清，加4℃预冷的PBS 4ml重悬细胞，离心后加入185μl结合缓冲液重悬细胞，再分别加入5μl Pacific Blue™ annexin V和1μl 7AAD；室温避光孵育20min，应用流式细胞仪检测。 3.1.2.3 流式分析仪检测细胞ROS含量

将2.0×105个/孔对数生长期的A549细胞接种于24孔板，每孔0.5ml，贴壁后分为4组：对照组、单纯HpD-PDT组、Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒组和Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒+HpD-PDT组，PDT组按HPD浓度为5μg/ ml，照光剂量4 J / cm2进行照射，Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒感染剂量为10MOI；处理结束后培养24小时；用500ul的DMSO充分溶解DCF1.7mg；配制50mmol/L NaOH溶液，取500ul加入DCF中，溶液呈荧光黄绿色；室温下避光孵育30min；取15ml离心管加入6ml PBS，将已激活的DCF加入其中，置于冰上备用；处理结束后用PBS洗细胞一次，用2%血清/PBS稀释DCF探针（1:20），而后加入各培养孔继续培养1h；探针装载结束后用PBS收集细胞，然后PBS洗细胞2次；应用流式细胞仪检测。 3.1.2.4 ELISA法检测IL-1β和TGFβ1

将2.0×105个/孔对数生长期的A549细胞接种于24孔板，每孔0.5ml，24小时贴壁后分为4组：对照组、单纯HpD-PDT组、Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒组和Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒+HpD-PDT组，PDT组按HPD浓度为5μg/ ml，照光剂量4 J / cm2进行照射，Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒感染剂量为10MOI；处理后继续培养24小时，收集培养液，按试剂盒说明书采用ELISA法（NeoBioscience）测定细胞培养液中的IL-1β、TGFβ1，绘制标准曲线，计算上述炎性因子浓度。

3.1.2.5 Western-blot检测Ad5/F35-APE1siRNA对APE1蛋白表达的时效和量效关系及对HpD-PDT诱导APE1表达的敲低作用

将A549细胞按1×105个/ 孔分别接种于6孔板和96孔板，其中一个6孔板以10

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MOI腺病毒Ad5/F35-APE1 siRNA感染细胞4小时后吸弃培养液，更换培养基后继续培养6、12、24、48h收集细胞；另一6孔板分别以1、2.5、5、10 MOI腺病毒Ad5/F35-APE1 siRNA感染细胞4小时后吸弃培养液，更换培养基后继续培养48h收集细胞，提取蛋白后按上述步骤进行Western blot检测APE1表达。96孔板设对照组、单纯HpD-PDT组、Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒组和Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒+HpD-PDT组，腺病毒处理组给予10 MOI Ad5/F35-APE1siRNA感染A549细胞24h，HpD-PDT处理组按HpD浓度5 μg/ml、激光10 KJ/m2照射，照射后继续培养24h收集细胞，提取蛋白后按上述步骤检测APE1表达。

3.1.3 资料分析及统计学处理

数据采用SPSS10.0统计处理，各组均数间差异显著性比较采用t检验进行，P<0.05为统计学差异显著，P<0.01为统计学差异非常显著。

3.2 结果

3.2.1 MTT法检测Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合PDT对A549细胞增殖抑制作用

HpD-PDT对A549细胞增殖抑制作用的结果显示：PDT能明显地抑制A549细胞的生长增殖，且HPD浓度及激光剂量是决定抑制效率的关键条件，即随HPD浓度增加和激光剂量的增大，A549细胞相对抑制率逐渐升高，在较低的激光剂量下，抑制率曲线上升迅速，后逐渐趋缓达平台期（见图3.2）。Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒联合PDT也显示，Ad5/ F35-APE1 siRNA腺病毒能显著增强PDT对A549细胞的增殖抑制，尤其当PDT作用强度小于IC50时，Ad5/F35-APE1 siRNA的增敏作用更为明显（见表3.1）。

图3.2 PDT对A549细胞的增殖抑制作用成剂量依赖型抑制（不同光敏剂浓度和不同激光剂量组之间比较，P值均<0.01）

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表1B MTT测定Ad5/F35-APE1 siRNA联合PDT对A549细胞的相对抑制率（%）激光剂量(J / cm2) PDT Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒+PDT

5MOI 10MOI

0 0.125 1.345 2.787 0.5 7.52 19. 39.86 1.0 13.67 28.63 58.48 2.0 25.65 57.86 75.43 4.0 59.12 74.28 88.16 6.0 78.35 90.14 96.52 8.0 90.18 97.88 99.17 10.0 95.63 99.36 99.84

3.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

流式细胞仪检测凋亡结果显示：对照组与单纯Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒组A549细胞凋亡不明显，HpD-PDT处理后A549细胞凋亡细胞比例增加，而Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合HpD-PDT组凋亡最明显，与其余各组之间的差异显著(P＜0.01)(图3.3)。

图3.3 流式细胞仪检测凋亡结果

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3.2.3 活性氧（ROS）含量的测定

与对照组比较，A549细胞经HpD-PDT和Ad5/F35-APE1 siRNA分别处理后细胞内ROS水平明显升高（p<0.05）；而Ad5/F35-APE1 siRNA联合PDT处理显著地增加了ROS的生成，与其余各组之间的差异显著（p<0.05）（见图3.4），说明PDT通过合适波长光激发靶细胞内光敏剂产生大量活性氧物质。

图3.4 流式细胞术分析A549细胞内ROS含量

3.2.4. ELISA分析IL-1β和TGFβ1的表达

与对照组相比，其余各组细胞培养液中IL-1β和TGFβ1蛋白含量均显著升高（P＜0.05），提示PDT照射后细胞内存在IL-1β和TGFβ1蛋白高表达。与单纯HpD-PDT处理组相比，Ad5/ F35-APE1 siRNA组升高不明显（P＞0.05），而Ad5/ F35-APE1 siRNA+HpD-PDT组则显著增高（P＜0.05），表明Ad5/ F35-APE1 siRNA腺病毒能显著升高细胞培养液中IL-1β和TGFβ1蛋白含量，增强PDT对A549细胞的杀伤作用（图3.5A, 图3.5B）。

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图3.5 ELISA分析IL-1β和TGFβ1结果（A：IL-1β的表达。与对照组相比，*p<0.05；与单纯HpD-PDT相比， p<0.05）（B：TGFβ1的表达。与对照组相比，*p<0.05；

与单纯HpD-PDT相比， p<0.05）

3.2.5 Ad5/F35-APE1siRNA影响APE1蛋白表达的时效和量效关系检测

应用Western blot方法进一步检测Ad5/F35-APE1siRNA影响APE1蛋白表达的时效关系显示，Ad5/F35-APE1 siRNA能有效降低APE1蛋白表达，Ad5/F35-APE1 siRNA感染时间延长，APE1蛋白表达逐渐降低，其中感染后48小时降低最为显著（见图3.6A）；进一步检测Ad5/F35-APE1siRNA影响APE1蛋白表达的量效关系：10 MOI感染剂量的重组腺病毒能最有效地抑制APE1（见图3.6B）；HpD-PDT可诱导APE1表达增强，而与对照组比较Ad5/F35-APE1 siRNA可有效敲低PDT诱导的APE1表达增强（见图3.6C）。

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图3.6 Western blot检测APE1蛋白表达（A：Ad5/F35-APE1siRNA敲低APE1蛋白表达的时效关系；

B：Ad5/F35-APE1siRNA敲低APE1蛋白表达的量效关系； C：Ad5/F35-APE1siRNA对PDT诱导APE1表达增强的有效敲低作用）

3.3 讨论

光动力治疗(photodynamic therapy，PDT)是一种微创、非产热方式引起局部组织坏死的治疗手段，与传统疗法相比，它最大优势在于可以选择性地杀伤肿瘤细胞，对正常组织损伤较小，能最大限度地保留正常组织和器官的结构和功能，可与手术、放疗、化疗联合应用，具有良好的临床应用前景[43]。尽管PDT在肿瘤的治疗上具有良好的前景，但由于肿瘤细胞可能对其治疗过程中的氧化损伤及DNA损伤具有一定的自身修复作用，导致PDT仍然存在着局限的穿透深度、治疗抵抗或耐受及肿瘤复发等问题。其中，人肺癌细胞可表达脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)，是一种受Hsp27等、又能诱导VEGF表达增高，对低氧和氧化应激诱导细胞凋亡具有保护作用的重要基因[48]，可

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通过其氧化还原和DNA损伤修复双功能从而防止PDT诱导的人肺腺癌细胞凋亡，从而影响PDT治疗肺癌的最终疗效。本研究结果显示PDT治疗引起的氧化应激和缺氧可使人肺癌细胞内APE1表达增加，从而保护低氧和氧化应激诱导的癌细胞凋亡，对肺癌治疗的最终疗效产生深远的影响。因此，探讨以APE1基因为靶点，PDT治疗肺癌中的作用，并选择更为有效的方法抑制APE1表达，可望有效提高PDT治疗对肺癌细胞的敏感性。

有较多的研究已经表明，下调APE1表达可增加肿瘤治疗的敏感性。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是自然界真核细胞共有的转录后基因沉默机制，是生物体进化过程中抵抗/抑制病毒或外源寄生基因的保护性机制。siRNA(short interfering RNA，siRNA)介导的RNAi已成为研究特定候选基因功能的新工具之一[49]。通过对RNAi作用机制的研究还提示，只有当siRNA介于21~25nt(neucleotide)时才可特异性地诱导细胞候选基因转录后基因沉默，该发现使得化学合成的siRNA完全有可能成为一种新的分子生物学工具，特异性地抑制哺乳细胞的基因表达，并成为未来癌症治疗的一种全新技术[49-53]。Wang等[54]最早利用合成的APE1特异性siRNA转染骨肉瘤细胞株，使骨肉瘤细胞对DNA损伤药物的敏感性有效地增加。运用反义酸技术特异抑制APE1可以增强细胞对化疗药物及氧化性药物的敏感性[55。56]。新近McNeill等[57]通过有效的方法抑制APE1的表达可以显著增强典型的DNA损伤药物的细胞毒效应，其中MMS增强了5.4倍。Yang ZZ[58]等实验结果提示APE1 siRNA可显著增强多发性骨髓瘤细胞对化疗药物马法兰的敏感性。因此，本课题以APE1为靶点，通过重组腺病毒Ad5/F35介导的APE1 siRNA以阻断其基因转录，从而发现Ad5/F35-APE1 siRNA联合PDT可加重细胞早期DNA损伤，并影响晚期的DNA修复功能，并通过对HIF-1等转录因子的下调而降低了VEGF等蛋白的表达，促进PDT氧化损伤。同时本研究结果还清楚的显示：在总体趋势上，Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒能有效地抑制APE1对PDT作用后人肺腺癌细胞的损伤修复功能，进一步增强PDT对A549细胞的增殖抑制作用，增加细胞内ROS的表达从而影响炎性因子IL-1β、TGF-β1释放，促进了细胞的凋亡，增加PDT治疗肺癌的敏感性。通过本研究结果提示：Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒基因治疗联合PDT为治疗肺癌提供了新的理论和治疗手段，对肺癌的治疗具有重要意义，所提出的治疗手段和方法具有重要的经济价值和社会效益。我们相信，在不久的将来，随着分子生物学工程技术的发展、光敏剂的优化及PDT仪器的进步，PDT在肺癌中的治疗水平将得到进一步的提高和优化。

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全文结论

1. 放射性肺损伤小鼠模型研究显示，辐射诱导肺组织核蛋白APE1/Ref-1表达显著增高，呈现由胞核向胞浆移位并先增高后降低特征；辐射诱导APE1/Ref-1表达增加和异位表达，可通过其DNA损伤修复和/或氧化还原功能影响放射性肺损伤修复。

2. APE1/Ref-1是炎性因子的因子，血清/ 肺泡灌洗液TGFβ1、IL-6、IL-1β和TNF-α含量是放射性肺损伤的预测指标。研究发现为预测放射性肺损伤的发生提供了生物学的预测指标。

3. 三羟异黄酮APE1/Ref-1表达防护放射性肺损伤的重要作用并阐明了其机制。三羟异黄酮可显著减轻放射性肺损伤小鼠肺泡腔内炎性渗出以及肺组织羟脯氨酸含量和胶原纤维沉积，其作用机制与其下调APE1/Ref-1及NF-ΚB表达从而减轻炎性因子分泌有关。研究发现为放射性肺损伤的防治提供了新的手段和方法。

6. PDT可诱导肺腺癌A549细胞APE1蛋白表达增强，但通过Ad5/F35-APE1 siRNA可抑制PDT诱导的APE1蛋白的表达。

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文献综述

放射性肺损伤的发病机制及其防治策略

恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康。胸部肿瘤约占恶性肿瘤的35~45%，放射治疗是胸部肿瘤最主要的治疗手段之一，而放射性肺损伤（radiation-induced lung injury, RILI）作为胸部肿瘤放疗常见的严重并发症和剂量因素，其发生率达5~15%，一因此，提高RILI的救治水平有非常重要的意义。旦发生，通常引起严重的临床后果[1]，然而，制约放射性肺损伤治疗的关键问题一个是含氧中间产物活性氧驱动的氧化应激，启动肺泡II型上皮细胞和血管内皮细胞等靶细胞产生的炎性细胞因子级联反应，一个是DNA氧化损伤。因此，本文着重从整体和离体，细胞和分子水平等多个层次阐述有关放射性肺损伤的发生机制以及防治策略。

1. 放射性肺损伤发生机制 1.1 炎性细胞因子级联反应

RILI是一个复杂的病理过程，以往认为早期放射性肺炎的靶细胞为肺泡Ⅱ型细胞、血管内皮细胞，靶细胞及微血管的损伤为其发病的主要机制[2]，但伴随分子生物学技术的发展，人们逐渐认识到单一的靶细胞或靶组织受损观点难以解释放射性肺损伤过程的动态变化，目前认为肺的辐射敏感亚单位为肺泡/毛细血管复合体，放射性肺损伤表现为弥漫性肺泡受损。放射诱导的活性氧直接作用于实质细胞并由此改变细胞因子的微环境从而启动一系列“分子级联”反应；随着活性氧自由基的增多，导致脂质过氧化、DNA和蛋白质的氧化以及致炎因子的进一步激活，最终导致肺纤维化[3, 4]。

大量研究证实，转化生长因子-β（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、表面活性物质载体蛋白和细胞粘附素分子（ICAM-1、E-选择蛋白）等生物因子在放射性肺损伤的发生中起着重要作用[5, 6]。国内外学者对这些生物标志物进行了大量研究，尤其是TGF-β1，目前公认其血浆中水平可作为放射性肺损伤的生物预测因子。

TGF-β分子量25kD，由两个12.5kD亚基通过二硫键连接而成，共有5种同分异构体及5种细胞膜受体，可调节细胞生长、分化。TGF-β I型和Ⅱ型受体是其主要的信号转导受体，TGF-β1与I、Ⅱ型受体的亲和力又比TGF-β2大10-80倍。TGF-β首先与其II型受体结合，再与I型受体结合，然后通过多个环节和机制导致细胞外基质（ECM）过度积聚和纤维化发挥生物学作用：① 刺激ECM产生细胞合成大量ECM，

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如I、II、IV型胶原和非胶原糖蛋白等；② 通过抑制ECM降解酶，如基质金属蛋白酶（MMPs）、纤溶酶原激活物（PA）活性，增强这些降解酶抑制物的活性，从而减少ECM降解；③ 促进ECM产生细胞表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）并使其活化而发生表型转化为肌成纤维细胞（MFB），后者能合成和分泌大量胶原成分；④ 增加ECM受体如整合素的表达，从而促进ECM与细胞间的相互作用。TGF-β还可与其它细胞因子如PDGF、IL-1等协同发挥生物学效应。Ji-Yoon Kim等[7]测定了34例肺癌患者放疗前、放疗起始、放疗中及放疗结束时、结束后2周、4周六个时限点血浆TGF-β1水平发现，发生放射性肺损伤患者，在放疗过程中TGF-β1降低，放疗结束时开始升高，结束后4周血浆TGF-β1水平明显高于未发生放射性肺损伤患者。

IL-1是由单核巨噬细胞合成分泌的一种前炎症细胞因子，有IL-1α和IL-1β两种亚型，在组织急性损伤中起重要作用。IL-1能诱导其它炎症细胞因子、趋化因子、粘附分子、急性期蛋白和组织蛋白酶等的合成，对嗜中性粒细胞、巨噬细胞具有趋化和促进释放炎症介质作用[8]。PDGF是由A链和B链组成的二聚体，分为AA、AB和BB三个亚型，通过靶细胞膜上的PDGF受体发挥作用。PDGF能刺激间叶来源的细胞、生长，是纤维母细胞的有丝原，并能促使纤维母细胞转化为MFB及介导MFB表达αI胶原基因，能使静止期的G0细胞进入G1及S1期[9]。TNF为一种多功能性多肽，在炎症和免疫过程中具有重要调节作用，有TNF-α和TNF-β两种亚型。TNF-α与其受体结合可刺激多个信号转导途径，引起多种转录因子、细胞因子、生长因子、受体、细胞粘附因子等炎症及急性期蛋白表达[10]。

1.2 DNA损伤修复基因

细胞受到照射后，DNA分子将产生多种类型的损伤，包括碱基错配、修饰、脱嘌呤或脱嘧啶位点形成、DNA单链、双链断裂以及DNA蛋白质交联等。由于体内存在DNA损伤修复系统，损伤的DNA就能被体内多种参与DNA损伤修复基因及其编码的酶所识别并通过多条途径进行修复[11]。DNA损伤修复途径包括碱基切除修复（BER）、DNA双链断裂修复（DDSBR）、核酸切除修复（NER）和错配修复（MMR）4类，而电离辐射导致的DNA损伤主要是碱基损伤和DNA链断裂，故涉及的DNA损伤修复途径主要是碱基切除修复（BER）和DNA双链断裂修复（DDSBR）[12]。

1.2.1 碱基切除修复（BER）

碱基切除修复途径在短小DNA片段损伤修复中起主要作用。单功能DNA糖基酶通过水解碱基和脱氧核糖的糖苷键切除受损碱基，并留出一个无碱基位点，即无嘌呤/无嘧啶（AP）位点，随后在脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE1）帮助下切开DNA骨

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架，暴露游离的5/-末端脱氧核糖磷酸盐（dRP）和3/-羟基[13]。双功能DNA糖基酶（如OGG1和NEIL1）具有糖苷酶和AP裂解酶活性，能通过一个3/脱氧核糖磷酸基团和一个5/磷酸盐形成一个无碱基位点，APE1水解这个3/脱氧核糖磷酸基团后变成3/羟基，Pol β与之结合。哺乳动物细胞中，Pol β连接已切开的DNA骨架，并且该聚合酶的脱氧核糖磷酸裂解酶结构域能去除5/脱氧核糖磷酸，再根据Watson-Crick碱基互补原则填补无碱基位点，最后由DNA连接酶III/XRCC1复合物将其连接，整个损伤修复过程完成[14]。另外，NEIL1/2 DNA糖基酶也能激活碱基切除修复途径，并能切除受损碱基和同时暴露3/和5/端游离的磷酸[15]。多核苷酸激酶（PNK）切除3/磷酸，DNA Pol β连接受损位点并通过互补的核苷酸填补缺口，XRCC1/ DNA连接酶III再连接已切除的DNA骨架。因此碱基切除修复涉及的相关基因为hOGG1、APE1/Ref-1及XRCC1。

① hOGG1基因

8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosylase，OGG1）基因位于人染色体3p26.2，由7个外显子和6个内含子组成，其等位基因在这个区域的缺失将导致产生肿瘤[16, 17]。OGG1基因启动子TATG和终止子TGA序列分别位于第1和第7外显子，对其启动子序列分析发现存在两个CpG岛，无TATA或是CAAT盒，这个结果说明hOGG1基因是一个看家基因，能在细胞周期中持续表达。OGG1是hOGG1基因表达产物，同时具有糖苷酶和AP裂解酶活性，属于单碱基切除修复酶，最主要功能是修复DNA氧化损伤，和其它修复基因共同维护DNA稳定性[18-20]。人OGG1细胞表达OGG1α和OGG1β两种不同亚型，OGG1α在细胞核和线粒体中均有表达，但OGG1β仅表达于线粒体。两种亚型共享起始的316个氨基酸，不过C末端完全不同，研究发现，重组OGG1β蛋白无DNA糖基酶活性。电离辐射可以通过直接电离和ROS的间接作用致伤DNA，导致DNA单链或/和双链断裂从而引起细胞死亡。OGG1能识别并清除由活性氧攻击DNA氧化产生的8-羟基脱氧鸟嘌呤（8-OHdG），防止复制时G/A错误配对，造成子细胞由G/C到A/T的突变。若hOGG1失活或被人工敲除，使细胞修复8-OHdG能力降低或丧失，该细胞内遗传物质的突变率将比野生型高50倍，因此，hOGG1在DNA氧化损伤修复过程中起着重要作用[21, 22]。

目前多数研究表明OGG1受两种转录因子调节：a. INF-γ通过特异性识别一个CCAAT盒模序调节hOGG1表达[23]；b. 通过真核基因表达中重要的锌指转录因子Sp1调节hOGG1表达。Cha-Kyung Youn等[24]发现镉可通过抑制Sp1活性而下调人OGG1转录，但Bravard A等[25]研究发现镉能可逆性抑制胞内hOGG1活性，而其抑制纯化的hOGG1活性在加入EDTA后不能恢复。

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② APE1/Ref-1

人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶⁄ 氧化还原因子（apurinic/aprimidinic endonuclease/ redox factor-1，APE1/ Ref-1）基因位于14号染色体q11.2～12，含4个内含子和5个外显子共2.6 kb[26]。APE1/ Ref-1启动子约300bp，位于CpG岛区，无TATA盒，CCAAT盒和Sp1能够影响其基础转录水平，氧化应激后cAMP应答元件（CRE）可上调APE1/ Ref-1转录水平。启动子上游含有1个A型负性钙反应元件（nCaRE-A）序列和2个B型负性钙反应（nCaRE-B）序列，故APE1/ Ref-1可通过与自身启动子结合抑制转录，从而进行自身调节。APE1/ Ref-1蛋白含318个氨基酸，分子量36.5kD，其N端包含一个核定位信号区（NLS）主要通过Cys65发挥氧化还原功能，而C端在DNA无碱基位点发挥修复酶活性[27, 28]。研究发现，Cys65突变后APE1/ Ref-1蛋白无氧化还原活性，但并不影响其修复功能，而DNA修复途径所需的各种氨基酸突变也并不影响其氧化还原功能，因此认为APE1/ Ref-1的氧化还原和修复功能能各自发挥作用[29]。APE1/Ref-1的修复功能可使氧化损伤所致的有丝后期不细胞存活，E3330是一种苯醌和萘醌的类似物，可选择性抑制APE1/ Ref-1氧化还原活性进而抑制细胞增殖[30]。新近体内外研究显示APE1/ Ref-1还可作为一种核糖核酸内切酶剪切c-myc CRD RNA中的特定序列[31]。

APE1/Ref-1蛋白的转录后修饰形式有磷酸化、氧化还原、乙酰化及蛋白水解作用等。APE1/ Ref-1蛋白磷酸化位点分散在整个分子中，这些可能的潜在磷酸化位点包括酪氨酸激酶Ⅰ和Ⅱ（CKⅠ和CKⅡ）、蛋白激酶C（PKC）以及糖原合酶激酶3（GSK 3）等蛋白的共有序列。早期的在体试验研究证实APE1磷酸化在由烷化剂导致的AP-1激活中起重要作用[32]，但目前对APE1磷酸化的作用机制尚不清楚。二硫键还原酶硫氧还蛋白（TRX）通过其活性中心的Cys35、Cys32与APE1/ Ref-1氧化还原敏感位点Cys65相互作用，修饰APE1/ Ref-1的氧化还原。这种TRX介导的APE1/ Ref-1氧化还原作用需要p53和AP21的活化。APE1/ Ref-1乙酰化由Lys6和Lys7的P300乙酰化转移酶调节，可增强其对nCaRE序列的DNA结合能力，从而激活PTH启动子[33]。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）Ⅰ型可与APE1/ Ref-1结合，而Ⅱ型不能结合，Ⅲ型HDAC能调节APE1/ Ref-1乙酰化。SIRT1为Ⅲ型HDAC，最近Yamamori T等[34]发现SIRT1能使APE1/ Ref-1去乙酰化、促进APE1/ Ref-1与XRCC1结合、激活胞内AP内切酶活性，同时，部分APE1/ Ref-1可以介导SIRT1的细胞保护作用，故认为APE1/ Ref-1是SIRT1作用的靶蛋白并且SIRT1在通过调节碱基切除修复途径维持基因组完整性中起重要作用。此外，有研究发现乙酰化的APE1/ Ref-1能激活磷酸肌醇的磷酸酶PTEN，PTEN负性调节磷酸肌醇3-激酶/ Akt信号途径，从而影响细胞生长和生存，而这种APE1/

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Ref-1依赖的PTEN表达由Egr-1介导[35]。Busso CS等[36]发现APE1/ Ref-1的泛素受体Lys残基在N-末端附近，即24、25和27K，胞内P53抑制剂MDM2能明显增强这种泛素化作用，甚至DNA损伤试剂和MDM2/ p53相互作用的抑制剂nutlin-3在P53存在下均能增加APE1的泛素化，因此，单一的泛素化不仅是降解的必要条件，而且还能改变细胞内APE1/ Ref-1活性。

在不依赖CRM1的方式中，S-亚硝基谷胱甘肽能有效激活APE1/ Ref-1的出核转运，这种转运是由cys93和cys310的S-亚硝基化调节。转运过程具有特异性和可逆性，可被还原剂逆转，但H2O2不能模拟此过程，并且，P50和HDAC2为APE1/ Ref-1的出核转运抑制蛋白[37]。

③ XRCC1

人类X射线交叉互补修复基因1（X-ray repair cross complementing gene1, XRCC1）定位于人类染色体19q13.2-19q13.3，含17个外显子共33kb，纯化的XRCC1蛋白由633个氨基酸残基组成[38]。XRCC1作为支架蛋白通过直接与聚合酶β、DNA连接酶Ⅲ和多聚ADP核糖聚合酶[poly（ADP ribose）polymerase, PARP]形成复合物，共同参与因电离辐射和氧化损伤引起的碱基切除修复和单链断裂修复[39, 40]。有研究表明，XRCC1的表达依赖于DNA-PKcs表达水平和PI3K/ Akt信号肽的碱基活性状态。并且，放射诱导XRCC1表达的潜能取决于其碱基表达水平。Wang S等[41]发现JWA作为一种修复蛋白与XRCC1相互作用，通过MAPK信号途径调节核因子E2F，进而调节XRCC1转录，氧化损伤后，XRCC1能发挥转运蛋白作用将JWA转运至细胞核内，并共同定位于病灶，并且，JWA可以保护XRCC1不受蛋白酶的降解和泛素化。在染色质中XRCC1磷酸化和在核基质中DNA损伤诱导的寡聚反应对病灶的形成至关重要，且碱基切除修复/ 单链切除修复的反应中心可能出现在核基质中。

XRCC1是一重要的DNA损伤修复基因，在电离辐射过程中发挥重要作用，目前国内外研究大多集中在XRCC1单核苷酸多态性与肿瘤易感性方面，而XRCC1基因多态性与电离辐射损伤关系的研究甚少，也有研究表明XRCC1的C26304T位点多态性与电离辐射损伤的发生有关[42]。

1.2.2 DNA双链断裂修复（DDSBR）

由于复制错误或外源性因素（如电离辐射等）导致DNA链断裂。现今认为DNA分子双链断裂的修复包括两种机制，一种是非同源性末端连接（NHEJ），即由DNA依赖的蛋白激酶介导，通过DNA连接酶的直接作用将断裂的DNA双链重新连接起来

[43]

。非同源性重组在染色质易位中修复病理性的DNA双链损伤，并且修复在VJ重组

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和CSR重组中产生的生理性的DNA双链损伤。因此，若缺乏正常非同源重组修复途径不仅对电离辐射敏感，还将出现严重的免疫缺陷。另一种是通过同源重组的机制（HR），是细胞修复DNA双链断裂的主要机制。同源重组可修复由于电离辐射或DNA复制过程中复制叉受损所致的DNA双链断裂，是维持基因组稳定性及产生遗传多样性的一个重要的进化性保守机制[44]。

2. 放射性肺炎治疗进展

目前急性放射性肺炎常规治疗方法是肾上腺皮质激素与抗生素联合应用，但并不能有效预防或转归放射性肺炎及进一步的纤维化。自1949年Patt等发现半胱氨酸可防护小鼠接受电离辐射所致的损伤以来，国内外学者对辐射防护药物进行了大量研究，根据（1）巯基化合物和活性氧清除剂；（2）细胞因不同的作用机理，归纳起来主要包括[45]：

子；（3）血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂（ARB）和（4）天然化合物。虽然现有辐射防护剂可显著提高小啮齿动物的辐射防护程度，并控制毒性在可接受的范围内，但对大的哺乳动物防护能力较差或毒性较高，加之这其中的多数辐射防护剂自化学合成物中筛选出来，研制周期长、创新成本高，离理想的辐射防护剂尚有差距。因而，越来越多的学者开始关注从天然小分子化合物中寻找抗辐射药物。

5,7,4’-三羟基异黄酮（genistein）是多酚类化合物中的一种特殊类型，是大豆异黄酮的主要成分。我们在前期研究中证实三羟基异黄酮可依赖其类雌激素活性通过直接刺激血细胞生成防护放射性造血损伤[46]。近年来大量研究发现，三羟基异黄酮增加谷胱苷肽过氧物酶、超氧化剂物歧化酶等抗氧化酶基因表达，淬灭辐射诱导的自由基，抑制氧化应激诱导的NF-κB DNA结合活性和膜脂质过氧化，调节细胞周期抑制细胞凋亡等是其抗辐射作用的主要分子基础，但三羟基异黄酮这些基因表达的具体信号途径目前尚不清楚[47-49]。

① 三羟基异黄酮激活Nrf2/ARE途径抗辐射损伤

电离辐射的生物学效应主要通过直接作用和诱导细胞内产生自由基的间接作用引起，其中自由基是吸收辐射能量和生物分子损伤的重要媒介，含氧中间产物活性氧（reactive oxygen system, ROS）起着重要调节作用，ROS驱动的氧化应急反应启动放射性肺炎[50]。核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件（nuclear factor-E2-related factor 2/antioxidant responsive element, Nrf2/ARE）是一种细胞重要的抗氧化反应信号途径，其中ARE是一顺式转录元件，位于一些抗氧化酶、解毒酶基因上游启动子区域；而Nrf2是与ARE结合的起始转录因子，属于碱性亮氨酸拉链（bZIP）蛋白质家族，在ROS或其它亲核信号刺激下，Nrf2与胞浆蛋白伴侣分子Keap1解偶联并转移入细胞核和

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其它bZIP蛋白质结合形成稳定异二聚体，再与ARE结合参与下游硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽-S转移酶、NAD（P）H：苯醌氧化还原酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和亚铁血红素加氧酶1等基因的转录。近年来研究发现，除外电离辐射引起的各类放射性损伤，机体的很多生物学过程都与ROS密切相关，Nrf2/ARE抗氧化信号途径开始受到广泛关注。大量体内外实验研究表明激活Nrf2/ARE通路对辐射损伤具有明显的保护作用，Nrf2/ARE途径被认为是辐射损伤防护的新靶点，活化Nrf2/ARE通路化合物可能是潜在的辐射防护剂[51, 52]。激活Nrf2/ARE抗辐射损伤作用途径也主要包括增加抗氧化酶表达、抑制NF-κB介导的促炎症反应等[53]，与三羟基异黄酮抗辐射作用途径极为相似。Dinkova- Kostova等[54]首先报道了包括三羟基异黄酮的一类植物化合物是天然的Nrf2/ARE途径激活剂，活化Nrf2/ARE通路可有效防护紫外线所致的辐射损伤。基于三羟基异黄酮作为Nrf2/ARE途径激活剂的性质，以及三羟基异黄酮与Nrf2/ARE信号通路抗辐射作用方式的相似性，推测活化Nrf2/ARE途径可能是三羟基异黄酮抗辐射损伤的重要分子机制。

② APE1/Ref-1表达对NF-κB、Nrf2活性影响及协同效应

放射性肺炎的“远地伴随效应”进一步证实了炎性细胞因子级联效应是介导和放大RP的核心事件。虽然目前尚未完全明了介导炎性细胞因子释放的上游事件，但核转录因子-κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）可能在其中扮演着重要角色。NF-κB包括RelA（p65）、RelB、Rel、NF-κB1（p50）和NF-κB2（p52）五种亚型，目前普遍认为其可炎性蛋白质合成，在炎症反应中起关键作用。NF-κB可被细胞因子如TNF、IL-1，UV辐射，自由基等刺激活化[55]。Haase等[56]报道给予小鼠肺部20Gy剂量照射，可持续上调NF-κB DNA结合活性，诱导肺部出现炎性反应。新近研究进一步证实，用γ射线对小鼠作全身照射可致NF-kB和炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8表达平行升高，并伴有抗炎细胞因子IL-10明显降低，而在照射前15分钟注射NF-κB抑制剂咖啡酸苯乙基酯（Caffeic acid phenethyl ester, CAPE）能有效减轻炎性反应[57]。以上结果表明，辐射诱导的NF-κB可能在调节炎性因子表达从而介导和放大放射性肺炎中发挥关键作用，针对抑制NF-κB活性的研究将可能为开发放射性肺炎特殊的治疗方法提供一个平台。

近年来，大量学者对NF-κB活性进行了研究。脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子（apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1/ redox factor-1, Ape1/Ref-1）是一种多功能的蛋白质，除具有AP位点的DNA损伤修复功能外，还可作为包括NF-κB的多个细胞转录因子氧化还原激活子。Ando等[58]研究发现，活化NF-κB增加其与DNA的结合有

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赖于还原NF-κB高度保守的Rel同源性DNA结合区域（RHD）的半胱氨酸残基如p50 Cys-62，而通常胞浆p50的Cys-62都被高度氧化；作为NF-κB的氧化还原激活子，Ape1/Ref-1不仅能直接，还可作为氧化还原分子伴侣增强其它还原性蛋白如谷胱甘肽（GSH）、硫氧还蛋白（Trx）还原NF-κB RHD的半胱氨酸残基。Raffoul等[59]通过体内外实验研究表明，放射治疗将上调细胞表达Ape1/Ref-1，而给予三羟基异黄酮预处理，在降低Ape1/Ref-1表达的同时也将明显下调NF-κB DNA结合活性；进一步研究证实转染Ape1/Ref-1 cDNA使Ape1/Ref-1表达增加2倍，随之也使NF-κB DNA结合活性上调2倍。上述结果提示，降低Ape1/Ref-1表达是NF-κB活性受抑的关键因素，推测三羟基异黄酮下调辐射所致Ape1/Ref-1表达增加从而抑制NF-κB活性是其防护放射性肺炎的有效途径。

NF-κB与Nrf2/ARE信号途径的crosstalk近年有少量文献报道。Jeong等[60]研究发现，苯乙基异硫氰酸酯（PEITC）活化Nrf2途径可有效抑制脂多糖（LPS）诱导的NF-κB激活，从而抑制促炎症反应。另有研究发现，NF-κB/p65亚单位能通过与Nrf2直接竞争转录辅激活子CREB结合蛋白（CBP）CH1-KIX区，或通过募集ARE辅阻遏物组蛋白脱乙酰基酶3（HDAC3）作用于CBP/ MafK致组蛋白低乙酰化阻碍Nrf2/ARE信号通路[61]。以上结果表明，通过抑制NF-κB可有效协同Nrf2/ARE通路，极大地提高后者的抗氧化效应。又基于三羟基异黄酮可下调辐射所致的Ape1/Ref-1表达增高抑制NF-κB活性，推测三羟基异黄酮通过Ape1/Ref-1表达进而影响NF-κB活性能与Nrf2/ARE途径发挥协同作用，这可能是三羟基异黄酮防护放射性肺炎的重要分子机制。

3. 结语

急性肺损伤导致正常细胞死亡，并被纤维细胞替代，发生的机制目前尚未完全阐明。研究表明，当损伤性因素作用于肺组织时，对肺泡上皮和肺血管造成损伤，影响肺功能，此时局部微环境释放的一些细胞因子刺激肺组织内的干细胞增殖、分化、再生并修复损伤细胞；损伤引起的组织细胞变化又可动员骨髓中的干细胞迁移到肺组织，进一步促进损伤修复；同时肺组织损伤的内环境也能够促进外源间充质干细胞向损伤部位趋化，参与组织损伤修复。DNA损伤修复基因与放射性肺损伤的研究目前尚处于起步阶段，相关的研究报道较少，明确上述防治肺损伤的机制，包括控制肿瘤、提高生存率以及生活质量等，是今后需要加强关注的热点问题。

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研究生期间发表论文情况

1. Lei.Xia1, Wei Guan1, Dong Wang1, Yun-Song.Zhang2, Lin-Li Zeng1, Zeng-Peng Li3, Ge.Wang1, Zhen-Zhou Yang1. Killing effect of Ad5/F35-APE1 siRNA recombinant adenovirus in combination with hematoporphrphyrin derivative mediated photodynamic therapy on human non-small cell lung cancer, Journal of Biomedicine and Biotechnology (doi: 10.1155/2013/957913).

2. 夏蕾, 罗维, 李娟, 王阁, 杨镇洲, 王东。三羟异黄酮下调Ape1/Ref-1对放射性肺炎防护作用的实验研究。激光杂志，2013，34（02），99-102.

3. 夏蕾，熊艳丽，罗维，李娟，肖何，王阁，王东，杨镇洲。染料木黄酮对辐射损伤小鼠肺纤维化的防护作用。第三军医大学学报，2012，34(21)，2149－2153.

4. 夏蕾，朱剑武，罗维，李娟，周芊，曾林立，王东，杨剑，杨镇洲。白藜芦醇抑制A549人肺腺癌细胞增殖与IGF-1R的关系研究。第三军医大学学报，2011，33(24)，2567－2570.

5. 夏蕾，杨雪琴，王阁，王东，杨镇洲，杨利军。舒尼替尼治疗甲磺酸伊马替尼治疗失败或不能耐受GIST患者的毒副反应及防治。临床肿瘤学杂志，2011，16(09)，794－799.

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致谢

本课题是在导师王东教授及杨镇洲副教授亲切关怀、精心指导以及大坪医院肿瘤中心全体人员的鼎立协助下如期完成的。

首先，感谢我的导师王东教授三年来的培养和教诲，导师研以致用、求真务实、严谨治学的风范给我留下了深刻的印象和感悟，对我日后科研实践与行医必将产生深远影响。师恩难忘，值此论文完成之际，谨向尊敬的导师致以衷心的谢意！导师在本课题的实验设计、技术方法、实验结果分析和课题经费等诸多方面给予了全力支持和精心指导，在此致以诚挚的谢意！

感谢大坪医院肿瘤中心王阁教授、雷新副教授、谢家印副教授、仲召阳副教授、杨雪琴副教授、病理科李增鹏副教授在三年学习期间给予的关心、指导和热情帮助！

感谢大坪医院肿瘤中心李梦侠博士、张志敏博士、戴楠博士、陈川博士、卿毅博士、单锦露博士、寸燕萍博士、汪广杰博士、关伟硕士、钱程远硕士、卢先锋硕士、顾咸庆硕士、周芊硕士、冯燕硕士、蒋永蓉硕士、蒋平硕士、李峥硕士、廖玲实验员、杨宇馨实验员等在实验中给予的热情指导和无私帮助。

最后，深深地感谢我的家人给予我理解和支持，他们是我完成学业的坚强后盾，是激励我永远前进的动力。

本课题受国家自然基金(No.30970865)课题资助。

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