方法二、乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定
L(-) - 羟脯氨酸含量测定法
一、原理：
主要用于动物水解蛋白的鉴定，因用皮革等水解制成的动物水解蛋白质中含有特有的成分L-羟脯氨酸和羟赖氨酸，特别是羟脯氨酸的含量较高，达10%以上，而大豆蛋白与乳蛋白中不含有此成分。利用这一特性就可进行动物水解蛋白质的鉴定。方法原理为样品中的蛋白质酸水解成氨基酸，经氯胺T氧化,生成含有吡咯环的氧化物。用高氯酸破坏过量的氯胺T。羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。 范围：
1. 本标准适用于生鲜牛乳、液态乳、全脂乳粉、脱脂乳粉、全脂加糖乳粉、含乳饮料中动物水解蛋白的鉴定。本方法通过对L(-)-羟脯氨酸含量的测定，可判定是否为皮革水解蛋白
2. 本标准的方法检出限：乳粉类5mg/100g；
二、试剂：
1. 氢氧化钠(GB 629);1 mol/L、10 mol/L溶液。
2. 缓冲液:将50g柠檬酸,26.3g氢氧化钠和146.1g结晶乙酸钠(GB 694)溶于水,稀至1L,此溶液与200mL水和300mL正丙醇混合。
3. 氯胺T(HG 3-972)溶液:将1.41g氯胺T,溶于10mL水中,依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液(用时现配)。
4.显色剂:称取10g对二甲氨基苯甲醛,用35mL高氯酸(GB 623)溶解,缓慢加入65mL.好的显色液贮存于棕色瓶中。 5.L(-)-羟脯氨酸(C5H9NO3)标准溶液。 6.标准储备液500μg/mL 7.标准工作液5μg/mL
三、仪器和设备：
1.实验室常规设备： 2.恒温干燥箱。 3.恒温水浴。 4.酸度计。
5.分光光度计。
四、试样处理：
1. 准确称取固体样品0.5g(液体样品4-5g，精确到0.0001g)，放于水解管中。 在水解管内加入12mol/L盐酸10～15mL后充分溶解样品，然后充入高纯氮气；在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖。将已封口的水解管放于110±1℃的恒温干燥箱内，水解6h以上，取出稍冷却。 2. 打开水解管，上下翻转几次，缓慢放出其中的气体，防止液体喷出（注意防止水解液冲出消化管），趁热将水解溶液转入100mL容量瓶中,并用
蒸馏水定容至刻度、混匀、过滤,此液为水解液。吸取5～25mL(V1)水解液于100mL三角瓶中,用10mol/L、1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH为8.3±0.2,定容至100mL容量瓶中,摇匀备用。此液为待测液。
五、分析步骤：
1 标准曲线的绘制
吸取L(-)-羟脯氨酸标准工作液（5μg/mL）0.00，10.00，20.00，30.00，40.00，50 mL分别置于100mL容量瓶中，定容摇匀。浓度分别为0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg/mL。取上述不同浓度的溶液5.00mL，分别加入25mL具塞试管或比色管中,其L(-)-羟脯氨酸含量分别为0.0,2.5,5.0,7.5,10.0，12.5μg。然后向上述比色管中分别加氯胺T溶液2mL,摇匀后于室温放置20min。再加入显色剂2mL,摇匀,塞上塞子放于60℃试管加热器(或恒温水浴)中保温20min后取出,迅速冷却,在波长558±2nm处测定吸光值,绘制标准曲线。
2 试样测定
根据L(-)-羟脯氨酸含量，吸取待测液1.00—5.00mL（V2）于25mL具塞试管中,若吸取的待测液小于5ml，需用蒸馏水补充至5ml 。按以上步骤进行比色测定,同时作空白试验。
3. 分析结果的计算
计算公式: X=CV1A100
m1000
式中:X——样品中L(-)-羟脯氨酸的含量,％;
C——从标准曲线上查得相应的L(-)-羟脯氨酸量,μg; m——称取试样的质量,g; V1——样液体积,mL。 A——稀释倍数
当符合允许差所规定的要求时,取两次测定结果的算术平均值作为结果,结果精确到0.01％。
4 . 允许差
同一分析者同时或相继进行的两次测定结果之差不得超过平均值的5％。
5 . 判定方法
因 L(-)-羟脯氨酸为胶原蛋白中的特有组分，其含量占10%以上；而乳蛋白中不含有此成分，如若样品中含有L(-)-羟脯氨酸，可判定添加了动物水解蛋白。
