PCR扩增及其扩增回收片断的重组与转化

22100934 程雅楠

摘要：以R-pGEX-4T-1质粒DNA为实验对象，对其进行双酶切与电泳检测，并以R-pGEX-4T-1质粒DNA为DNA模版进行PCR扩增，对其扩增产物进行鉴定与纯化，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并对获得的产物进行割胶纯化回收，为接下来的DNA重组和转化实验提供外源DNA片段。在进行DNA重组转化之前，进行大肠杆菌感受态细胞的制备以便将重组DNA导入其中。通过一系列的实验操作流程，掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法，学习PCR反应的基本原理与实验技术、PCR扩增产物的鉴定与纯化、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备的方法和技术以及学习重组DNA连接与转化的方法。 关键词：质粒DNA,PCR扩增,重组,转化。

1.材料和方法

1.1实验仪器与用具：

水浴锅、移液和头、机、浮板、小离心管、PCR热循环仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外投射仪、台式离心机、移液（配套头）、－20℃低温冰箱、分析天平、水浴锅 （65 ℃）、小离心管、1.5mL离心管、50mL离心管、单面刀片、超净工作台冷冻离心机、恒温摇床、－70℃冰箱、10mL移液管、吸耳球、超净工作台恒温培养箱、玻璃涂棒、培养皿

水浴锅 PCR热循环仪

1.2 实验试剂

XhoⅠ酶、EcoRⅠ酶、10×H Buffer、无菌水、2.5mmol/L dNTP（TaKaRa）、10×PCR缓冲液（TaKaRa）、25mmol/L MgCl2 （TaKaRa）、琼脂糖、1×TAE、6×Loading Buffer、DNA Marker 2000 、Agarose Gel DNA Purification Kit（生物）、超纯水（无菌）、引物1、引物2（5pmol/μL）引物1：5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’引物2：5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’、Taq DNA聚合酶（TaKaRa）。DNA marker 2000（TaKaRa公司）、10mg/mL溴化乙锭溶液（EB）（0.5μg/mL终浓度，20mL胶加1μL）、10×Loading Buffer、1%SDS/50%Glycerol(甘油)/ 0.05% Bromophenol Blue (溴酚蓝) 、X-gal、IPTG、氨苄青霉素、pMD18-T Vector（TaKaRa连接试剂盒）、LB固体/液体培养基、大肠杆菌DH5α（R-,M-，

-Amp）、0.1mol/LCaCl2溶液、LB液体培养基、30％甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压

灭菌。

1.3 实验材料

R-pGEX-4T-1质粒DNA、DNA模板（质粒R-pGEX-4T-1，R指代外源基因）、PCR扩增产物、PCR基因扩增回收片段。

1.4质粒DNA的双酶切与电泳检测 1.4.1质粒DNA的双酶切 反应体系：

10×H Buffer 2μL 质粒DNA 10μL～12μL≤1μg

无菌水 6μL ～ 4μL

EcoRⅠ 1μL

XhoⅠ 1μL

总体积 20μL（无菌水补至总体积）

反应条件：温度37℃，酶切1.5h

1.4.2 电泳检测双酶切结果

琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果：制备1％琼脂糖凝胶（含 0.5μg/mLEB），120V电泳20分钟（最高电压不超过5V/cm）。凝胶成像系统记录结果（电泳图） 1.5 PCR基因的扩增

1.5.1在0.5mL Eppendorf管内配制25μL反应体系，按下表准确加入各反应物

反应物 10×PCR缓冲液 25mmol/L MgCl2 2.5mmol/LdNTP 引物1 引物2 体积（μL） 2.5 1.5 2.0 2.0 2.0 0.2 2.0 1.6. Taq DNA聚合酶 模板DNA(1ng/μL) 加ddH2O至25μL 1.5.2 PCR反应条件的设置： 在PCR热循环仪上设置程序，按程序设置的条件进行扩增94 ℃预变性5min，94 ℃变性40sec，55 ℃退火50sec，72 ℃延伸50sec，72 ℃延伸8min，12 ℃ for ever，1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果（此步骤与下次实验PCR扩增产物的割胶纯化一起进行） 1.6 PCR扩增产物鉴定与纯化

 

电泳检测PCR扩增产物：使用1×TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，1%的胶，30ml（参照琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验） 在紫外灯下切出含有目的DNA（约600bp）的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，切碎胶块，以加快后续步骤的胶块融化时间，提高DNA的回收率

注意：尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，减少凝胶体积，提高DNA回收率；且不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤

 称量胶块重量：按每100mg胶重加入500μL Solution SN，置于65℃水浴中约6-8分

钟，中途每2min混匀一次，至胶完全融化（注意：胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率）

 胶融化后每500μL Solution SN加入50μL Solution B，混匀  将试剂盒中的3S柱（DNA收集柱）放入2mL收集管中，将融化的胶溶液转移到3S柱中，

让盖子开着，室温放置2min

 盖上离心管盖，离心（10000rpm，1min）

 取下3S柱，倒掉收集液中的废液，将3S柱放入同一个离心管中，加入600μL Wash

Solution，离心（10000rpm，1min）  重复第8步骤1次  取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个离心管中，离心（10000rpm，2min）  将3S柱放入一个新的1.5mL离心管中，在3S柱子膜加30μL ddH2O（可预热一下），

室温放置2min（注意：提高洗脱温度有利于提高DNA的洗脱效率；也可以用预热的TE或水洗脱）

 盖上离心管盖，10000rpm高速离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，保存

于－20℃备用

1.7大肠杆菌感受态细胞的制备 1.7.1受体菌的培养：①从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h）②将该菌种悬液以1：100的比例接种，取250μL菌液转接到25mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右 1.7.2感受态细胞的制备：①将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min②在4℃，4000r/min离心10min。弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽③用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液10mL轻轻悬 浮细胞，冰上放置30min④ 4 ℃，4000r/min，离心10min，⑤弃去上清，沉淀中加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备） 1.7.3感受态细胞的分装与冷冻：①在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30％甘油（即1:1体积，甘油终浓度15%） ②将此感受态细胞分装成每份200μL（1.5mL Eppendorf管），液氮速冻，快速转入－70 ℃冰箱保存（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70℃冰箱保存。）

1.8 DNA重组与转化

① 在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μL pMD18-T Simple Vector（50ng/μL） 1μL Insert DNA（0.1pmol～0.3pmol） ddH2O up to 5μL Solution 1 总体积 5μL 10μL 3μL ② 16℃连接反应30min

③ 含有X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基的制备：每块平板约20mL固体培养基（融化状态下加入20μL100mg/mL Amp），在预制的LB琼脂平板上，加40μL X-gal （20mg/mL）和4μL IPTG（ 200mg/mL）溶液，用灭菌的玻璃涂棒均匀涂布于琼脂培养基表面（避光吸收）

④实验组：将5μL连接产物加入至200μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30min 阳性对照组：将2μL质粒加入至200μLDH5α感受态细胞中，冰中放置30min ⑤ 42℃加热45s后，再在冰中放置1min

⑥ 加入800μL LB液体培养基，37℃振荡培养60min ⑦ 4000r/min离心5min，去掉600μL上清，混匀菌液，用灭菌玻璃涂棒涂布于含有X-gal、IPTG、Amp 的LB琼脂平板培养基上，37℃正置吸收30min ⑧ 倒置平皿37℃培养过夜（12～16h）。在含有X-gal、IPTG、Amp 的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落

⑨ 计数白色、蓝色菌落。挑选白色菌落，可使用菌落PCR 法确认载体中插入片段的长度大小

1.9 对目的基因的测序

2.实验结果

琼脂糖凝胶电泳检测酶切电泳图

2.1左图为琼脂糖凝胶电泳检测酶切的结果（电泳图）对材料进行酶切后，一般会出现三条清晰的条带，高度由上至下依次为（越高分子量越大）： 1.酶切不完全残留的完整基因组条带10bp

2.酶切后剩余部分的载体，大约7bp（10bp-3bp）

3.目的基因，3bp(10bp-7bp)

左起第三组为我组实验结果，由于点样时加样量稍大，故条带较亮。

蓝白斑筛选

2.2 左图2为我组蓝/白斑筛选结果，有白斑但是不见蓝斑，分析原因可能是因为时间太长会出现杂菌，有可能是假阳性，需要通过pcr和酶切进行鉴定。

2.3 PCR扩增产物跑胶后在紫外线灯下观察到一条清晰明亮的条带，说明只有此组PCR扩增情况较成功

测序结果：TAAAGGCAAGGTTGTTGACCTCCTGTACTGGAGAGACATTAAGAAGACTGGAGTGGTGTTTGGTGCCAGCCTATTCCTGC TGCTTTCATTGACAGTATTCAGCATTGTGAGCGTAACAGCCTACATTGCCTTGGCCCTGCTCTCTGTGGCCATCAGCTTTAGGATATACAAGGGTGTGATCCAAGCTATCCAGAAATCAGATGAAGGCCACCCATTCAGGGCATATCTGGAATCTGAAGTTGCTATATCTGAGGAGTTGGTTCAGAAGTACAGTAATTCTGCTCTTGGTCATGTGAACTGCACGATAAAGGAACTCGGGCGCCTCTTCTTAGTTGATGATTTAGTTGATTCTCTGAAATTTGCAGTGTTGATGTGGGTATTTATCTATGTTGGTGCCTTGT

3.讨论

质粒DNA双酶切中应使用到性内切酶，它是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序列。在此次双酶切中，使用到两种酶，XhoⅠ酶（TaKaRa公司）识别序列和切割位点： EcoRⅠ酶（TaKaRa公司）识别序列和切割位点：

经过双酶切后电泳检测我组显示的条带并不清晰，分析原因可能是凝胶不新鲜，或者是电泳时电压过高，或者是酶切时间过长，也有可能是头或者离心管等器材污染

PCR扩增实验中可能遇到无扩增产物 、非特异性扩增、拖尾及假阳性等问题。产生上述问题的原因有：1.无扩增产物：模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解退火温

2+

度太高，延伸时间太短；2.非特异性扩增：引物特异性差, 模板或引物浓度过高，酶量过多，Mg浓度偏高，退火温度偏低，循环次数过多；3.拖尾：模板不纯或降解，Buffer不合适，退火温度偏低，酶量

2+

过多，dNTP、Mg浓度偏高，循环次数过多；4.假阳性：靶序列或扩增产物的交叉污染，可用1) 操作时防止将靶序列吸入加样内或溅出离心管外2) 除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及头等一次性使用3) 各种试剂先进行分装，低温贮存等方法解决

利用α互补进行蓝白斑筛选的原理是: 由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lac Z′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lac Z′中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。

在DNA重组和转化实验中，蓝白斑筛选只出现了若干白斑未出现蓝斑，做蓝白斑筛选只见白斑，不见蓝斑，该如何做？解决方案：（1）做空白对照，将没有进行重组的宿主菌直接接入含有IPTG和X-gal LB琼脂糖平板在37℃下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4℃两小时，蓝色会加深。如果正常显色，说明试剂，培养基及菌没有问题，如果不能正常显色，更换试剂重新配置培养基或者接入新的菌种，再次培养，确保空白对照结果正确。（2）若空白试验结果正确，用牙签挑取白色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，确定是否重组，即PCR扩增后的反应液中加入2μl的6×上样缓冲液，混匀，上样至已预电泳的10％非变性PAGE加样孔中，200V电压电泳后，取胶至EB液中染色30min，最后在紫外灯下数码照相。比对结果，判断白斑是否为重组子。

[参考文献]

[1]PPT: 质粒DNA的双酶切 PCR基因扩增 PCR扩增产物鉴定与纯化 [2] 魏群 分子生物学实验指导

[3] 蒋俊豪;贺修胜; PCR-双酶切鉴定STGC3抑癌基因重组子假阳性研究 《现代生物医学进展》2010年 第7期

[4] 高文娜;陈万权;王中康; AFLP双酶切和连接方法探讨 《植物保护》 2003年 第6期

[5] 唐晓明 从单酶切到双酶切看目的基因与运载体结合的准确率 《生物学教学》 2010年 第7期 [6] 杜先平;马鹏; 实时荧光定量PCR法检测结肠癌患者P53基因表达水平的研究 《中国医疗前沿》 2011年 第11期

[7] 王勇;袁华; 改进的碱裂解法大规模提取质粒DNA《数理医药学杂志》 2010年 第5期 [8] 张立荣;于璇; DNA片段的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验组织与安排

The double digests to plasmid DNA AND PCR amplification, identify and purification

22100934 ChengYanan

Abstraction: Do the double digests and electrophoresis detection to R-pGEX-4T-1 plasmid DNA.AND then make R-pGEX-4T-1 plasmid DNA as a DNA masterplate to do PCR amplification. Identify and purify their amplification product. Via AGE identifying the amplication profuct. Do rubber tapping purification recycling for product. Before doing the DNA recombination,we should prepare to make competene cells of E.coli. Through a series of experiment operating flow, mastering the method and theory of double digests to plasmid DNA, studying the basic theory and operate technology of PCR reaction, grasping the method of DNA recombination and inversion. Keyword: plasmid DNA, PCR amplification, recombination, inversion.

The extract of plasmid DNA and the recombination and inversion of recycled part in PCR amplification 22100934 ChengYanan

Abstraction:Through the alkaline lysis method,extractiong the plasmid DNA in E.coli.Detecting the plasmid DNA with AGE. Do the double digests and electrophoresis detection to R-pGEX-4T-1 plasmid DNA.AND then make R-pGEX-4T-1 plasmid DNA as a DNA masterplate to do PCR amplification. Identify and purify their amplification product. Via AGE identifying the amplication profuct. Do rubber tapping purification recycling for product. Before doing the DNA recombination,we should prepare to make competene cells of E.coli.Taking advantage of blue-white selection to identify whether exogenous plasmid DNA inserts into multiple cloning site.Furthermore,to judge whether the plasmid have recombined and transformed or not.

Keyword:plasmid DNA,alkaline lysis method, PCR amplification , recombination and inversion of DNA