糖在蛋白质药物冷冻干燥过程中保护作用的分子机制
【关键词】蛋白质
摘要论述了冷冻干燥过程对蛋白质药品的损伤及糖类在此过程中的保护作用机制,并分析了蔗糖、葡萄糖、海藻糖、葡聚糖等几种糖作为保护剂的功能特点。
关键词糖;冷冻干燥;蛋白质;保护剂
1 冷冻干燥的损伤作用
冷冻干燥的实质是物质(水蒸汽)和能量的转换传递〔3〕。生物材料在冻干时,必须经历水变成冰的冻结过程。这是一个物理学的状态变化,同时还伴随着化学变化。这些变化,将使受冻结的生物材料受到影响〔4〕。
蛋白质冷冻干燥全过程分为预冻、第一阶段升华干燥和第二阶段再干燥。预冻过程中水结冰时体积增大,致使活性物质活性部位中一些由弱分子力键连接的键遭到破坏,从而使活性损失;另外,水结冰后引起溶质浓度上升以及由于各种溶质在不同温度条件下溶解度变化不一致而引起pH值的变化,导致活性物质所处的环境发生变化而造成失活或变性。
在第一阶段升华干燥时90 %以上的水分被升华除去。第二阶段再干燥主要是除去药品中的残留水分。残留水分过多,生化活性物质容易失活,大大降低了稳定性。Thomas〔5〕报道,残留水分的水平对冻干物质的是否产生非定形的结晶相当重要。控制冻干药品
中的残留水分,关键在于第二阶段再干燥的控制。因此在实际操作中,应该在保证药品活性的条件下,选择能允许的最高温度进行第二阶段再干燥,真空度的控制尽可能提高,有利于残留水分的逸出。但冻干品的水分并不是越低越好〔6〕。因为每种蛋白质药品都含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定,过度的干燥将使蛋白质分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。另外,Shan〔7〕的研究表明残留水分对蛋白质活力的回复影响最大。
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除此之外,在冷冻贮藏中,由于冰晶与蛋白质的水合水的相互作用,使冰晶接近蛋白质的水合层,形成格子构造,水合层的水分子向冰晶的方向移动,产生脱水合现象,使蛋白质的水合构造遭到破坏〔8~10〕。因而使蛋白质的高级结构发生改变,蛋白质的生理功能受到影响。
关于冷冻干燥对蛋白质的变性机理目前普遍认为在冷冻干燥过程中冷冻和干燥都会引起蛋白质变性。Dean〔11〕认为在冷冻过程中缺少保护剂的情况下,蛋白质将失去活性;而脱水过程本身能使蛋白质损伤,从而使复水后的蛋白质失去活性。许多学者认为蛋白质分子周围分布着多层水分子,在降温过程中,蛋白质分子周围的水分子不断冻结,但只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻结,则蛋白质就不会变性;反之,蛋白质就会变性。Hanafusa 〔12〕利用在冷冻干燥过程中把卵清蛋白(ovalbumin)和肌球蛋白(myosin)进行了冷冻干燥对比实验,表明正是由于蛋白质表面覆盖着没有冻结的单层水分子,才使蛋白质在冷冻过
程中不发生变性作用。当蛋白质表面的单层水分子开始冻结时,蛋白质分子表面的氢键以及极性基团就会暴露在周围环境中而变性。同样,在干燥过程中也应保证蛋白质分子表面的单层水分子不受到破坏。因此,在冷冻干燥蛋白质药物的过程中,一般要加入保护剂,防止由于
蛋白质表面的单层水分子破坏而引起蛋白质的变性。
2 糖的保护作用机理
关于糖生物保护作用的机理,仍在研究和探讨之中。目前主要有两种。第一,认为由于蛋白质分子中存在大量氢键,结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后,蛋白的主相变温度会升高。但某些糖的羟基能替代蛋白表面的水的羟基,使得蛋白的主相变温度变化不大,低于操作温度,从而避免了生物活性物质由于发生相变所造成的机械损伤。即在冻干过程中,由于糖类属于亲水性物质,形成氢键能力较强,在氢键形成中即可以作为孤对电子的受体,又可以作为供体,因此,在蛋白质冻干过程中糖的羟基可与蛋白质中的极性基团形成氢键,从而代替蛋白质极性基团周围的水分子,使蛋白质表面形成一层假定的水化膜,这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中,稳定蛋白质的高级结构,防止蛋白质因冻干而变性,使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下,仍保持蛋白质结构与功能的完整性〔13~14〕。这是“水替代假说”。许多研究者赞成这种观点。首先能够直接测量冻干的蛋白质与保护剂蔗糖间的氢键〔15〕,从而显示出蔗糖对蛋白质的保护作用;其次,Dean〔11〕等在分别研究蔗糖、葡聚糖、蔗糖与葡聚糖的混合物对冷冻干燥过程中蛋白质的保护作用时发现,保护剂是否具有保护作用,关键在于保护剂在蛋白质脱水后能否与氢键结合。一些研究者曾用傅立叶变换红外光谱分析法研究了海藻糖对大肠杆菌
DH5α和苏云金杆菌HD-1冻干后蛋白质结构的作用,表明:不加海藻糖时,结构蛋白的酰胺Ⅱ峰从水化细胞的1543 cm-1移至1533 cm-1;添加海藻糖后,结构蛋白的酰胺Ⅱ峰的位置没有改变〔16〕。从而证实,海藻糖作为保护剂在冻干过程中对蛋白质结构具有保护作用,也为“水替代假说”提供了证据。
第二,认为在含糖溶液的干燥过程中,当浓度足够大且糖的结晶不会发生时,糖-水混合物就会玻璃化,这时糖所处的状态称为玻璃态。研究表明,单糖、双糖、多羟基化合物以及结构蛋白质、酶都能显示玻璃行为,只是玻璃化转变温度不同而已。由于某些糖的玻璃化温度较高,在较高的保存温度下,仍能在蛋白质分子附近形成玻璃态。而在玻璃态下,物质兼有固体和流体的行为,粘度极高,不容易形成结晶;且分子扩散系数很低,因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围,形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体,使大分子物质的链锻运动受阻,阻止蛋白质的伸展和沉淀,维持蛋白质分子三维结构的稳定,从而起到保护作用,这是“玻璃态假说”〔17~18〕。
总之,生物活性物质保护剂要有较高的玻璃态温度,或者有一定量的羟基来替代水,使蛋白保持较低的主相变温度。一般说来,如工作温度低于保护剂的玻璃化温度,高于被保护的活性物质的主相变温度,那么该活性物质就能有效地保持活性。但在目前,这两种假说还不能完全解释现有的实验现象,所以对其保护的作用机理仍需深入研究。
3 几种糖的保护作用分析
作为保护剂的糖类,其保护作用与它们的化学结构有密切关系。它们通常具有5个以上的羟基,可以与蛋白质形成氢键以取代水,保证了蛋白质的稳定性;在溶液中它们易结合水
分子,发生水合作用,减少了游离水的含量并增加了溶液的粘性,从而减缓晶核的生长过程,使形成的冰晶较细小,以达到保护的目的。常用作保护剂的糖类单糖主要有葡萄糖,双糖有蔗糖、海藻糖、乳糖,聚糖有葡聚糖。它们有一个共同的特点就是具有大量的自由羟基,其
中,葡萄糖、乳糖具有还原性,而蔗糖、海藻糖、葡聚糖没有还原性。
Saez〔19〕等研究表明,在-45℃时添加蔗糖、葡萄糖等保护剂对保持物质的活性是必需的,而且20%的浓度其保护效果最佳。杨小明〔20〕在比较不同温度下葡萄糖、蔗糖、海藻糖和葡聚糖对纤维素酶的酶热稳定性的影响时发现,在20℃下蔗糖和葡萄糖对纤维素酶都有保护作用。在高温下两种糖都破坏了纤维素酶的稳定性。根据“水替代学说”,在比较低的温度下,可能是葡萄糖的羟基代替水分子同蛋白质表面分子作用,可以防止蛋白质因失水而引起的主相变温度的升高,减缓酶在存放过程中失活。在高温下,由于葡萄糖是还原性糖,它的羟基会同蛋白质活性部位的氨基酸残基反应,使酶变性失活;而蔗糖在高温下很难形成玻璃态,起不到保护作用。Mouradian也认为还原性保护糖的醛基能与蛋白质的伯氨基发生非酶性棕色反应,从而影响蛋白质的功能。糖的还原性越弱,对冻干生物分子的贮存稳定性越强〔21〕。Kai等研究发现,作为冷冻干燥保护剂,蔗糖在肽核酸再水化过程中对保持粒子大小证明是最有效的。他认为蔗糖主要是作为填充剂对粒子赋型,另外,它的空间位阻效应也使之更能有效地进行冷冻保护〔22〕。
海藻糖是一种稳定的非还原性双糖。与葡萄糖及蔗糖一样,海藻糖的羟基也能代替水分子同蛋白质分子表面部分结合,对蛋白质形成保护。同时海藻糖的分子较小,易于以分子的形式填充到蛋白质分子的空隙中,有效蛋白质分子内部的结构发生变化。从而能避免变性失活。值得注意的是虽然海藻糖与蔗糖都是二糖,水化能力也基本相同,但海藻糖的
保护作用却远高于蔗糖。这可能是因为它们的理化性质的差异所致。可能由于海藻糖有较高的玻璃化温度,较易形成玻璃态,将蛋白质分子支撑和包裹起来,使之不易变性。1987年,Leopld 和Vertucci提出一种想法来解释蔗糖和海藻糖保护效果的差异,他们指出因为蔗糖比海藻糖具有更容易形成结晶的趋势。可以推想,蔗糖的结晶状态是不易与其它物质发生作用的〔2 3〕。
葡聚糖具有保护作用是因其有较高的玻璃化温度,能在酶蛋白分子的周围形成玻璃态,从而保护酶分子免受高温所引起的损伤。但葡聚糖和蛋白质均为大分子,葡聚糖分子不容易进入蛋白质分子的空隙中,干燥后葡聚糖仅在蛋白质分子周围形成玻璃态的保护外壳。处于壳内的蛋白质分子可以作一定限度的空间结构的变化,引起部分失活。而在高温下,葡聚糖与蛋白质分子之间混合作用增大,有部分葡聚糖分子在蛋白质分子内部形成玻璃态,从而更有效地蛋白质分子空间结构发生变化。
4 问题
目前,蛋白质的冻干技术还不够成熟,冷冻干燥引起蛋白质变性的机理还不完全清楚,对玻璃化、去玻璃化和结晶规律了解甚微,糖的保护作用机理仍在探讨之中,冷冻过程中降温速率对溶液的结晶及玻璃化程度的影响复杂,而它的选择似乎与保护剂的浓度有关。同时,以玻璃态存在的保护剂呈现出复杂的特性,不同保护剂之间的组合保护特性等都需要进一步研究。因此,应在已有的研究基础上,大力开展冷冻干燥对蛋白质变性机理的研究,并建立传热、传质的数学模型;研究不同的保护剂的保护作用;优化干燥工艺,提高冻干品的质量。
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(华南理工大学生物工程系,广东广州5100)
