血管性痴呆动物模型研究概况

血管性痴呆动物模型研究概况

血管性痴呆是由于血管源性的脑部病灶所导致的严重认知功能障碍，它不是一种单一的疾病，而是由于多种发病原因引起的多类型综合征，皮质下小动脉病变、多发梗塞、脑慢性低灌注以及脑血管淀粉样改变等都是引起血管性痴呆的不同病因。针对不同的病因制备血管性痴呆动物模型是研究血管性痴呆发病机制、治疗药物等的重要条件，本文就近几年来血管性痴呆动物模型的制备做以综述。

[Abstract] Vascular dementia (VD) is caused by vascular lesions of the brain leading to severe cognitive impairment. It should be understood as multifactorial syndrome not a single disease. The main causes of VD include: subcortical small artery disease, multiple infarction, chronic global hypoperfusion, cerebral amyloid angiopathy and so on. According to different etiology to establish various VD animal models, which provide important condition for studying pathogenesis and therapeutic drugs of VD. This review will summarize overview about animal model studies of VD.

[Key words] Vascular dementia; Animal model; Cognitive disorder

随着年龄的增长及人口的快速老化，痴呆的发病率及死亡率也在逐渐上升。有统计显示，年龄超过65岁的老年人痴呆的发病率是5%~10%，年龄超过85岁的老年人发病率达到了50%，其中2/3是阿尔茨海默病（alzheimer disease，AD），1/3是血管性痴呆（vascular dementia，VD），并且这个数值还在不断增长。VD是由于血管源性的脑部病灶所导致的严重认知功能障碍。VD动物模型的制作，是研究其发病机制、治疗药物等的重要条件。本文就近年来VD动物模型的制备研究进展做以综述。

1 血管阻断法

包括两血管阻断法（2-vessel occlusion，2-VO）、三血管阻断法（3-vessel occlusion，3-VO）、四血管阻断法（4-vessel occlusion，4-VO）、双侧颈总动脉狭窄法（bilateral common carotid artery stenosis，BCAS）、单侧颈总动脉闭塞法（unilateral common carotid artery occlusion，UCCAO）、大脑中动脉阻断法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）等。

1.1 两血管阻断法

2-VO模型是手术结扎大鼠双侧颈总动脉形成慢性的全脑低灌注状态，术后出现明显的学习记忆功能障碍，无明显感觉运动功能障碍[1]，主要的组织病理学改变是脑白质改变和血管病变[2]。该模型传统做法是同时结扎双侧颈总动脉，对动物创伤大，死亡率高，且可引起视神经缺血性损伤。近年来学者不断改良2-VO法制作动物模型，使之广泛应用于科研[3]，其中，Sarti等[4]改良的动物模型具体操作如下：用氟烷麻醉大鼠后，取颈部正中切口，避开甲状腺分离皮下脂肪组织，切断肩胛舌骨肌，在光学显微镜下暴露颈总动脉，用丝线结扎一侧颈总动脉，1周后行相同的手术结扎对侧颈总动脉。经过这种不同时段结扎双侧颈总动脉，大鼠恢复快，死亡率低，模型稳定，且错开时间分次结扎颈总动脉更接近于临床慢性脑缺血的病理过程[5]。改良后的2-VO多用于缺血性白质损伤及缺血性视神经损伤的研究。

1.2 三血管阻断法

3-VO模型制作的方法是[6]：将大鼠麻醉固定后，取颈部正中切口，在外科显微镜下分离肌肉至枕骨腹面，做一个3 mm×3 mm的骨窗，在骨窗下电凝灼烧基底动脉，第2

天闭塞双侧颈总动脉，建立一种慢性脑缺血模型。该模型可导致持续的严重脑血流量低下，宜用于急性全脑缺血性损伤的研究，目前国内学者较少采用[7]。

1.3 四血管阻断法

4-VO模型首先由Pusinelli等[8]建立应用于科研，先永久性闭塞双侧椎动脉，再用动脉夹夹闭双侧颈总动脉10~30 min，导致全脑缺血。行为学测试大鼠的学习记忆功能明显受损，主要病理改变为海马区神经元的损害，皮质和丘脑少突胶质细胞的凋亡[9]。该模型高度模拟VD的发病特点，病理改变充分，无明显肢体运动障碍，但其操作复杂，损伤大，导致椎动脉永久性闭塞，大鼠存活率较低。4-VD是国际上目前公认的VD造模方法之一，并不断被改良完善，其中，Li等[10]对之改良制作方法如下：将大鼠麻醉固定后，取枕骨后正中切口，分离双侧椎动脉后用电凝针烧灼致其永久性闭塞，然后取颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，用2-0号丝线环绕双侧颈总动脉而不影响颈动脉血流，缝合切口。24 h后再次麻醉大鼠暴露伤口，用微血管夹夹闭双侧颈总动脉30 min后缝合切口。术后10~20 min即可出现学习记忆功能损害。

1.4 双侧颈总动脉狭窄法

Nishio等[11]将雄性C57B1/6小鼠麻醉固定后，颈部正中切口，暴露双侧颈总动脉，利用一个直径为0.18 mm的微弹簧圈造成双侧颈总动脉狭窄，术后缝合切口。BCAS术后5~6个月，小鼠的工作记忆功能降低显著，18氟-脱氧葡萄糖PET显示海马葡萄糖利用功能受损，组织学显示海马萎缩。BCAS模型实质上是模拟慢性脑低灌注致脑缺血缺氧性脑损伤，较好的模拟了人类因动脉粥样硬化、动脉管腔狭窄等因素导致的VD，且制作简单，重复性好，特别适用于皮质下血管性痴呆动物模型的致病分析和行为学评估。

1.5 单侧颈总动脉闭塞法

UCCAO模型制作方法[12]：将小鼠麻醉固定后，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉后用丝线结扎，术后该模型鼠的同侧半球脑血流量降低，对侧半球脑血流量无影响，4周后脑血流量可恢复80%；免疫组化标记显示胼胝体区明显的白质损害，神经丝密度降低，轴索的丢失及小神经胶质细胞增生；行为学测试可发现认知功能减低，无明显运动功能受损；主要的组织病理学改变是脑白质病变；血管闭塞12个月后可见血管病变[13]。UCCAO模型制作易于操作，死亡率极低，有利于进行慢性实验研究。

1.6 大脑中动脉阻断法

Ferrara等[14]将小鼠麻醉固定后，取颈部正中切口，分离肌肉后暴露右侧颈总动脉，从右侧颈内动脉插入一6.0硅涂层单丝实现大脑中动脉阻塞导致脑血流量降低，保留硅涂层单丝缝合颈部切口，60 min后再次简单麻醉小鼠拔出硅涂层单丝。MCAO主要导致皮质及尾壳核的广泛损伤[15]，行为学测试提示学习记忆功能持续受损[16]。MCAO致缺血性改变明显，重复性好，可靠性高，死亡率较低，无肢体运动障碍，也常用于慢性实验的研究[17]。

1.7 血管栓塞法

目前利用栓子栓塞血管来建立VD动物模型也较为常见，文献报道的栓子有悬浮胆固醇晶体、琼脂糖、塑料微球、自体血栓、空气栓子等。行为学测试发现，造模后动物学习记忆功能减低，主要的病理表现为多发的广泛区域的小的梗塞病灶[18]。Ren等[19]制作的PE60混合栓子建立栓塞性大脑中动脉闭塞模型，克服了既往血管栓塞模型梗塞灶大小不一致的限制。他们首先从麻醉后的鼠心脏中抽取新鲜动脉血，将0.4 mL的新鲜血液和

80 μL凝血酶及0.4 mL纤维蛋白原混合，并将之立刻注入至PE60导管（ID：0.72 mm，OD：1.22 mm）中，将导管中的凝血块冲出并在显微镜下将之切成固定长度并制成混合栓子，然后将大鼠麻醉固定后，取颈部正中切口，在操作显微镜的帮助下暴露左侧颈总动脉、颈外动脉和它的分支甲状腺上动脉及枕动脉、颈内动脉和它的分支翼腭动脉，将远端的颈外动脉、甲状腺上动脉及枕动脉永久性损伤，其他动脉暂时夹闭，开放颈内动脉夹后快速将6~8枚2~3 mm PE60混合栓子注入颈外动脉，术后开放颈总动脉及翼腭动脉，利用其血流将栓子送入颅内，缝合皮肤。该模型虽然操作复杂，但其有导致的多发梗塞灶能更好的接近于VD的病理特点。

2 基于脑血管病危险因素的VD模型

包括自发性高血压脑卒中大鼠（stroke prone spontaneously hypertensive rats，SHRSP）模型、高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）大鼠模型、糖尿病鼠模型、伴有皮质下梗死和脑白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病（cerebral autosomal

dominant

arteriopathy

with

subcortical

infarcts

and

leukoencephalopathy，CADASIL）Notch3转基因鼠模型、M5毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M5 muscarinic acetylcholine receptor，M5R）-/-鼠模型等。

2.1 自发性高血压脑卒中大鼠模型

SHRSP模型鼠出生时血压正常，在6个月时能自行发展成稳定的高血压[20]，约10个月可发生脑卒中事件，该模型鼠在学习记忆测试中显示明显的学习记忆功能受损[21]，随着动脉血压的升高，逐渐出现脑萎缩，神经细胞的丢失，神经胶质细胞反应及脑内大小不同的卒中病灶等组织病理学表现[22]，并伴有神经递质的改变，尤其是胆碱能神经递质的改变[20]。因此该模型很好的模拟了人类血管性痴呆患者的组织病理学及神经生化的改

变，但因其价格较贵，来源有限，不适用于科研的广泛应用[23]，且该模型与临床血管性痴呆患者多因素发病有所不同，尚需不断研究完善。

2.2 高同型半胱氨酸血症大鼠模型

通过增加食物中同型半胱氨酸或其前体蛋氨酸的水平可建立HHcy动物模型，也可通过诱导鼠内同型半胱氨酸代谢酶的缺乏建立HHcy动物模型[24]。Sudduth等[25]将野生型小鼠置于饮食中缺乏叶酸、B6及B12而富含蛋氨酸的环境中，建立HHcy鼠，模型鼠血浆同型半胱氨酸水平为（82.93±3.561）μmol/L，11周后，HHcy鼠出现空间记忆功能明显障碍，并发现该模型主要引起脑微出血及神经炎症反应。该模型易于操作，无明显运动障碍，但只模拟了VD发病机制的某一侧面。

2.3 糖尿病鼠模型

研究发现，腹膜内注射链霉素可获得1型糖尿病鼠模型，利用转基因技术能获得2型糖尿病鼠种系，经学习记忆测试可观察到该模型鼠的空间和非空间记忆均受损[26]。Takeda等[27]将APP23阿尔茨海默鼠与两种类型的糖尿病鼠（ob/ob鼠和NSY鼠）进行杂交获得多重转基因鼠，在8周时发现学习记忆功能受损。该多重转基因鼠的组织病理改变主要包括海马胆碱能神经元轴索损害、显著的星形细胞胶质化、脑血管炎症改变及淀粉样血管病。该模型只是模拟了糖尿病患者的发病特点，与临床血管性痴呆患者的多因素共同作用有所不同[28]。

2.4 伴有皮质下梗死和脑白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病Notch3转基因鼠模型

位于19号染色体上的Notch3基因的显性突变能导致CADASIL，Joutel等[29]利用这一原理成功制作了CADASIL鼠模型，他们首先将Notch3点突变的基因导入P1源性的人工染色体（P1-derived artificial chromosome，PAC），操纵Notch3 PAC在大肠埃希菌内不断复制繁殖，然后留下想要的突变的菌株来制作CADASIL氨基酸替换并将之修正，最后将修正的完整的Notch3PAC结构注入到小鼠的卵母细胞并使其表达，从而获得CADASIL鼠模型。转基因鼠的主要的病理表现包括Notch3细胞外域聚集，颗粒状电子致密嗜锇物质沉积于脑血管，脑白质损伤及脑血流量降低。该模型较好地模拟了CADASIL的病理改变，但并没有报道转基因鼠是否有认知功能障碍的发生，而且由于其费用过高，故不适用于实验研究的广泛应用。

2.5 M5毒蕈碱型乙酰胆碱受体-/-鼠模型

M5R在介导乙酰胆碱依赖的脑血管扩张过程中起着重要的作用。Araya等[30]在雄性C57BL6/J小鼠基础上回交雄性M5R-/-小鼠10代得到同类系雄性M5R-/-小鼠，并发现雄性M5R-/-小鼠的脑动脉明显收缩，脑血流量明显减少，皮质及海马椎体神经元萎缩，海马依赖的空间及非空间记忆明显受损，在海马CA3突触可见自发性突触后电位频率明显衰弱及长时程增强（long-term potentiation，LTP）明显受损。LTP是突触可塑性的表现形式，是学习和记忆的细胞学基础。该模型很好模拟了脑血管病变，无运动功能障碍，避免了手术创伤因素，但因其相对较高的费用及复杂的技术，限制其科研大规模应用。

3 立体定向内皮素-1（stereotaxic endothelin-1）颅内注射法

Tennant等[31]将雄性C57BL/6小鼠麻醉后固定在立体定位仪上，切开正中头皮暴露颅骨，在感觉运动皮质区的前肢区域，中心正中线侧部2.25 mm及前囟前面0.6 mm行颅骨钻孔术，将4 μL内皮素-1注入皮质下，最后用明胶海绵填充颅骨缺损，紫外线固化

牙科水泥覆盖切口。该方法主要导致对应区域的小的局灶性皮质梗塞，小鼠的前肢运动功能减低。该模型导致梗塞部位明确，重复性好，但是需要开颅，要求一定的技术。

4 去大脑皮层模型大鼠

司银楚等[32]将大鼠麻醉固定后，剪开大鼠头部皮肤，暴露颅骨，用牙科钻在左侧颅骨分别钻6个孔，用眼科剪翻开左侧颅骨，暴露硬脑膜，剪开硬脑膜，暴露软脑膜，使用沾有生理盐水的棉签在解剖显微镜下轻轻擦拭，直至镜下看不见软脑膜血管为止，用棉签轻轻按压止血，缝合皮肤。术后30 d组织病理学可见大脑皮质、海马、大细胞基底核及丘脑等处神经元明显变性，大鼠的学习记忆功能明显受损。该模型充分模拟了VD的病理改变，手术简单，重复性较好，所造成皮质缺血部位及大小恒定，但是手术过程中打开了蛛网膜下腔，脑脊液受损，并损伤了硬脑膜窦，易造成动物大量出血而死亡。

5 小结

VD动物模型不仅可用来研究血管改变和认知功能障碍之间的关系，而且也可用来研究不同病因与认知功能损伤程度之间的关系，对于疾病的预防、诊断及治疗有着重要的作用。VD动物模型制作的方法多样，没有统一的衡量标准，各种不同模型制备方法各有其优缺点，且不同模型的组织病理学变化差异较大，只能根据不同的研究目的来制备VD动物模型。

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▲通讯作者

·编读往来·

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