蛇床子素的生物学活性与作用机制研究进展

蛇床子素的生物学活性与作用机制研究进展

作者：徐燕 廖建华 吴龙火

来源：《湖北农业科学》2013年第18期

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摘要：蛇床子素是一种天然香豆素类化合物，具有保护肝脏、保护神经、抗癌、抗骨质疏松、抗炎等生物学活性。综述了蛇床子素的分子细胞学作用机制的最新研究进展，以期为深入探究其在疾病治疗方面的应用提供依据。

关键词：蛇床子素；香豆素；生物学活性；作用机制

中图分类号：R282.71；R966 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4313-06 蛇床子素为7-甲氧基-8-（3-甲基-2 -丁烯基）香豆素（图1），是已知的一种具有多种药理学和生化活性的天然化合物，具有潜在治疗疾病的作用[1]。天然蛇床子素主要存在于14种伞形科和17种芸香科植物中。蛇床子是中国长期以来用于治疗男性功能障碍的一种中药，其主要有效成分为蛇床子素[2]。蛇床子素具有独特的结构特征，如C-7位的甲氧基、C-8位的3-甲基-2-丁烯基等，这些都是非常重要的活性基团[3，4]。蛇床子素已经被证明具有抗癌[5]、抗氧化[1]、抗炎和免疫调节[6，7]等活性。同时它还具有保护肝脏[8]和保护神经[9]的作用，也可抑制绝经后骨质疏松症[10]，并改善脂质代谢[11]。蛇床子素具有多种多样的药理学作用，最近已受到广泛的关注，这使其可成为新药开发中非常有前景的天然先导化合物。本文针对这几方面的生物学活性进行了简要综述。

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1 蛇床子素的生物学活性及作用机制 1.1 抗癌作用

蛇床子素已被证明具有预防和治疗癌症的特性。Fujioka等[12]对伞形科植物中具有抗细胞增殖的活性成分进行了筛选，结果表明，蛇床子素对人体胃腺癌（MK-1）、人类子宫癌（HeLa细胞）和小鼠黑色素瘤（B16F10）的体外细胞系等均具有抗细胞增殖活性，其ED50分别为82.7、53.0和61.3 μg/mL。PC3和DU145为激素非依赖型的人前列腺癌细胞系，蛇床子素（100 μmol/L）可对其表现出较弱的抗增殖活性，但呈显著性差异，其抑制率分别为25.0%和34.0%。以同样的浓度，蛇床子素对小鼠白血病L1210细胞株表现出强烈的抗增殖活性，其抑制率达（65.4±10.4）%[13]。有研究表明，蛇床子素是中药蛇床子中具有抗肝星状细胞（HSC-T6）的纤维化活性的主要有效成分。浓度在100 μmol/L时，蛇床子素可抑制HSC-T6的增殖活性（细胞存活率高达31%）、降低胶原蛋白的表达量至24.5%，达到显著性水平，且呈时间、浓度依赖性，其可能的机制是通过干预细胞的增殖，而非细胞毒性作用[14]。 Yang等[15]研究发现，蛇床子素对肿瘤细胞株表现出强烈的细胞毒性作用，在给药24 h后人白血病HL-60、P-388、HeLa细胞和大肠癌CoLo 205等细胞系的IC50值分别为14.9、9.3、31.7、29.9 μg/mL。蛇床子素可诱导HL-60细胞系发生凋亡小体、DNA碎片，并促进PARP的降解。蛇床子素对原代培养的正常宫颈成纤维细胞具有低毒作用。体外研究表明，蛇床子素可抑制HeLa细胞生长，在24和48 h后其IC50值分别为77.96、64.94 μmol/L，呈时间和浓度依赖性。其可能是通过诱发DNA片段化和激活PARP致使细胞凋亡发生[16]。体内模型研究表明，以30 mg/kg剂量的蛇床子素给药，每天1次，P-388 D1致癌的CDF1小鼠的存活天数可延长9 d（ILS%=37）[17]。

李好好等[17]研究发现，蛇床子素体外对小鼠肺腺癌LA795细胞生长抑制率为53.8%，对人肝癌Bel-7402细胞生长抑制率为35.9%，IC50值分别为81.3、134.8 μg/mL，作用48 h比24 h的细胞生长抑制率要高。

通过伤口愈合和细胞穿透试验，蛇床子素可抑制乳腺癌细胞（MCF-7和MDA-MB 231细胞系）的迁移和侵袭。荧光素酶和酶谱分析表明，蛇床子素可有效地抑制基质金属蛋白酶2（MMP-2）启动子及其酶的活性（表1），这可能是蛇床子素抑制细胞迁移和入侵的机制之一[5]。FASN已被证明在人许多实体瘤中具有表达，目前FASN也被确认为癌前病变的生物标记之一。HER2（或称为Neu或ErbB2）在乳腺癌前病变有表达，并可上调FASN的表达。在HER2过度表达的乳腺癌细胞中，蛇床子素可有效地抑制FASN表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡[18]。郭保凤等[19]发现蛇床子素、补骨脂素和丹皮酚在最佳配伍比例

10.00∶7.78∶6.67时对乳腺癌MDA-MB-231BO细胞的生长具有抑制作用，有效抑制其侵袭，其机制可能与抑制TCG-β1基因的表达有关。此外，蛇床子素还可抑制Akt和mTOR的磷酸化[18]。

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组蛋白去乙酰化酶（HDACs）在染色质改造和基因表达调控中具有很重要作用。HDACs抑制剂被认为具有治疗癌症的前景，所有HDAC抑制剂的结构可分为3个功能亚基，每个亚基都可与离散区域的活性部位互相作用。这3个亚基包括：锌结合位点（如羟肟酸），1个疏水结合腔连接着4～6个碳原子和1个疏水性表面识别帽，而这个识别帽是HDAC表面在边缘活性腔位点具有特定的识别功能。蛇床子素的疏水性常数C logP值在3.5左右[20]。其与已知的HDAC抑制剂帽端基团的化学常数是一致的，因此可与活性部位边缘的表面基团发生疏水性作用。此外，蛇床子素化学结构中脂肪族侧链的分支可进一步开发与不同的HDACs发生特异性相互作用，可作为有前景的抗癌药物特异性先导化合物[21]。 1.2 保护肝脏作用

酒精是导致脂肪肝的主要诱因，可导致炎症，坏死，呈纤维化，最后成为肝硬化。目前尚无理想的药物试剂可以防治这种疾病。通过几种不同动物模型研究表明，蛇床子素作为一种天然化合物，具有肝保护功能，可预防和治疗脂肪肝。

为研究蛇床子素对脂肪肝的影响，通过分别喂食高脂肪食物和酒精，建立起高脂血症脂肪肝鹌鹑模型与酒精性脂肪肝大鼠模型[22]及小鼠高脂性脂肪肝模型[23]和小鼠酒精性脂肪肝模型[24]。结果表明，用蛇床子素治疗后，模型动物中血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、肝重量系数以及肝组织TC、TG含量显著下降，肝细胞中超氧化物歧化酶（SOD）的活性有所提高（表1）。在大鼠酒精性脂肪肝中的丙二醛（MDA）水平有所下降；而在高脂血症鹌鹑脂肪肝中，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的表达水平显著提高。蛇床子素显著降低了脂质的积累[25]。在高脂性脂肪肝大鼠模型中，蛇床子素也可显著降低大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平[26]。在牛奶诱导的高脂血症脂肪肝小鼠中，经10～20 mg/kg蛇床子素治疗3周后，肝素血浆活性的脂蛋白脂肪酶（LPL）、肝脂酶（HL）、总脂酶（TL）水平显著升高[26]（表1）。此外蛇床子素可改善脂肪肝大鼠中由高脂肪和高乳糖引起的胰岛素耐受性，其作用机制可能是与激活PPARα/γ信号通路，增加释放脂联素有关[27]。研究发现蛇床子素降脂作用的可能机制是通过诱导氧化物酶体增殖物激活受体PPARα及其相关靶基因胆固醇7A-羟化酶（CYP7A）的mRNA表达上调，而另外2个靶基因的二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）3和β-羟基-β-甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶mRNA的表达明显下调（表1）。且这种作用可被PPARα特异性抑制剂MK886预处理后而消除[11]。

在筛选治疗乙型肝炎病毒（HBV）的中药材时，体外研究发现，蛇床子素能够抑制乙肝病毒表面抗原（HBsAg）分泌的作用。在MS-G2和HBV DNA转染的HuH-7、MS-G2细胞在培养基中分泌的HBsAg减少60%～70%，未发现有任何细胞毒性作用。其可能的机制是由于蛇床子素可增加乙肝表面抗原糖基化方面的新功能[28]。蛇床子素是目前少部分香豆素类化合物中具有治疗丙型肝炎病毒（HCV）作用的化合物。蛇床子素能够抑制丙型肝炎病毒复制和增殖，抑制丙型肝炎转为肝癌[29]。

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深入研究其机制表明，蛇床子素通过抑制细胞凋亡来预防肝炎。FAS（Apo-1/CD95）配体是一种Ⅱ型膜蛋白，也是一种重要的细胞凋亡诱导剂。蛇床子素以10 mg/kg的剂量可显著抑制小鼠抗Fas抗体诱导的血浆谷丙转氨酶（ALT）的升高。用抗Fas抗体治疗小鼠，在3.5～6.0 h内引起了Caspase-3活性升高。用蛇床子素（100 mg/kg）预处理小鼠能够抑制抗Fas抗体引起Caspase-3的活性升高。然而，在体外增加肝细胞液中的蛇床子素（最多1×10-4 mol/L）浓度，抗Fas抗体并不能抑制Caspase-3的活性。因此蛇床子素可能是通过影响Caspase-3上游的活化效应来抑制Caspase-3的活性。因此，蛇床子素是通过抑制Fas介导的细胞凋亡途径抑制抗Fas抗体诱导肝炎[8]。 1.3 防骨质疏松作用

利用体外成骨样细胞UMR106作为细胞模型对蛇床子的有效成分进行筛选发现，蛇床子素作为主要的药理活性成分，显著地提高了细胞活性[30]。在探讨对大鼠去卵巢模型绝经后骨质疏松症的作用时，Li等[10]研究发现，蛇床子素对卵巢切除导致骨质流失产生的作用与17β-雌二醇相当，但它可能不是通过雌激素通路发生作用的。在传统中医学中，弱骨或骨损失一般被认为是肾虚造成的，近年研究发现蛇床子素能通过OPG-RANKL-RANK系统影响骨重建[31]。蛇床子素可通过诱导上调碱性磷酸酶（ALP）的活性而提高成骨细胞的活性（表1）。在浓度低于40 mg/kg时，蛇床子素诱导成骨细胞活性低下，而当浓度达到320 mg/kg时，则会出现细胞毒性作用[32]。

成骨细胞的存活是骨质疏松症的决定因素之一[33]，1×10-5 mol/L是蛇床子素促进成骨细胞分化成熟的理想浓度[34]。BMP-2/p38途径与成骨细胞分化早期阶段有关，而ERK1/2途径则与分化后期有关。蛇床子素在人骨肉瘤细胞株（MG-63）和人胚胎成骨细胞株（hFOB）两种人的成骨细胞株中表现出显著的诱导分化作用，这可能与促进BMP2的表达和激活SMAD1/5/8、p38、ERK1/2的信号途径有关（表1）[35]。靶向性突变β-catenin或BMP2基因后，蛇床子素对成骨细胞分化的刺激作用消失。由于BMP2基因的缺失并不影响蛇床子素诱导β-catenin的表达，而在成骨细胞中β-catenin基因缺失则抑制了其调节的BMP2的表达。因此，蛇床子素可通过β-catenin-BMP信号促进成骨细胞分化[36]。

明磊国等[37]研究发现，蛇床子素能显著促进破骨细胞的凋亡并抑制其骨吸收，其作用机制是：蛇床子素能够改变破骨细胞中OPG/RANK/RANKL系统，抑制破骨细胞成熟分化过程中的关键蛋白JNK1/2的磷酸化水平，从而影响其信号传导。 1.4 保护神经作用

蛇床子素可促进4-氨基吡啶（4-AP）激活的谷氨酸释放，达到显著水平，并呈浓度依赖性。在研究对胞浆内Ca2+的作用时发现，蛇床子素促进谷氨酸释放可能是由于电压依赖性Ca2+内流增加造成的。ω-芋螺毒素MVIIC是一种广谱性的N和P/Q型钙通道阻滞剂，MVIIC可显著性地抑制蛇床子素介导的谷氨酸释放，但胞内Ca2+释放的抑制剂丹曲林却无此作用。另外，蛇床子素并没有改变突触膜静息电位或4-AP介导的去极化，但可增加4-AP诱导的

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PKC磷酸化（表1）。因此，蛇床子素促进神经末梢释放谷氨酸是通过PKC的信号调节激活N和P/Q型钙离子通道[38]。Lin等[39]研究在胞外是否对Ca2+内流下游元件具有同样的作用时发现，蛇床子素介导的谷氨酸释放是可通过对下游元件控制调节突触囊泡的归整和外排，其可能的机制是通过增加钙调节蛋白依赖性激酶Ⅱ（CaMK Ⅱ）的活性和突触素Ⅰ的磷酸化作用实现的。

在小鼠神经母细胞瘤N2A细胞中，蛇床子素可抑制状态依赖的钠离子电压门控通道（在电压-70 和-100 mV时，IC50值分别为12.3、31.5 mmol/L）（表1），在胞外和胞内具有相当的效果。蛇床子素抑制钠离子通道可呈频率依赖性。当触发频率在0.33、1.00和3.33 Hz时，其抑制效果分别为17%、34%和49%。因此，蛇床子素可抑制状态和频率依赖的钠离子电压门控通道[38]。利用全细胞膜片钳技术研究蛇床子素对小鼠神经母细胞瘤和大鼠Glima杂交细胞系NG105-18的离子电流作用时发现，蛇床子素（0.3～100.0 μmol/L）可抑制电压依赖性L-型钙电流（ICa，L）（表1），并呈浓度依赖性，其IC50为4 μmol/L。蛇床子素（3 μmol/L）也可使ICa，L失活复苏期延长。

虽然蛇床子素可抑制磷酸二酯酶的活性，而增加细胞内cAMP或cGMP的水平，但sp-cAMPS并没有影响ICa，L，而8-溴环鸟苷具有轻微抑制作用。因此，蛇床子素介导的ICa，L的抑制作用与细胞内环AMP或GMP无关[40]。然而，蛇床子素对电压依赖的K+离子外向电流并没有影响[41]。

1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）是一种线粒体复合物Ⅰ的抑制剂，已被广泛用作神经毒素。MPP+可通过细胞内活性氧水平（ROS）和促进细胞凋亡引起严重的帕金森氏病样综合征。通过建立多巴胺能神经元损伤模型[42]，发现蛇床子素对MPP+诱导的PC12细胞损伤具有保护作用。蛇床子素预处理PC12细胞后，细胞的死亡率、乳酸脱氢酶的释放、Caspase-3和细胞色素C的活性、Bax/Bcl-2的比例、MPP+诱导的胞内ROS的产生等均有显著性的下降。通过细胞提取物进行HPLC分析证实，胞外的蛇床子素已经渗入细胞膜[9]。最近，利用神经功能缺损评分（NDS）、干湿重和2，3，5-三苯基氯（TTC）染色等试验对蛇床子素治疗急性缺血性中风的神经保护作用进行了研究，蛇床子素预处理可使GSH显著增加，并降低梗死面积、NDS评分，减轻水肿，降低MDA、髓过氧化物酶（MPO）、IL-1β和IL-8的表达水平[43]。为探讨蛇床子素对认知障碍和海马神经元退化的影响，建立普通双侧颈动脉（2VO）闭塞模型发现，蛇床子素可降低MDA的水平、Bax/bcl-2比值及Caspase-3的活性，显著提高GPX和过氧化氢酶的活性。此外，口服蛇床子素3周可明显减轻认知障碍和神经元损害[44-52]。

1.5 抗炎作用

在LPS处理的巨噬细胞中，蛇床子素可抑制TNF-α、NO和COX-2的表达，但没有降低IL-6表达。LPS诱导的p38、JNK1/2、PKC-α和PKC-ε等的磷酸化可被蛇床子素抑制（表1）；而对ERK1/2和PKC-δ的磷酸化并没有作用。蛇床子素同时也抑制了NF-kB活性和ROS

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释放[45]。通过对环氧合酶（COX）和5-脂氧合酶（5-LOX）的活性测定，结果表明蛇床子素是具有选择性地抑制5-脂氧合酶（IC50 =36.2 μmol/L）[6]。

蛇床子素具有抗过敏活性，可抑制二硝基氟苯（DNFB）所致的耳肿胀作用[46]。哮喘是一种过敏性气道炎症性疾病。嗜酸细胞活化趋化因子Eotaxin在过敏性刺激物进入气道后活化可致敏。通过对人支气管上皮细胞BEAS-2B诱导表达Eotaxin发现，IL-4和TNF-α具有显著诱导作用，这种诱导表达作用可被蛇床子素（0.1～10.0 μmol/L）所抑制，呈剂量依赖性。但蛇床子素并没有抑制IL-4诱导的p38、ERK和JNK表达，但抑制了IL-4诱导的STAT6表达，呈剂量依赖性[47]。

多发性硬化症（MS）是一种炎症性脱髓鞘中枢神经系统（CNS）疾病。通过试验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）动物模型，发现在中枢神经系统脱髓鞘的亚临床期给予蛇床子素，可减缓病情发展。在亚临床和临床阶段给予蛇床子素治疗，可减轻EAE的病情，减轻炎症、脱髓鞘和改善核磁共振成像结果[2]。此外，蛇床子素还抑制了EAE小鼠中神经生长因子（NGF）的减少和干扰素γ（IFN-γ）的增加[2]。 1.6 其他

PPARs是类固醇转录因子，可影响多个靶基因的表达，涉及糖代谢和脂肪酸存储[48]。通过瞬时转染试验，蛇床子素可显著激活PPARα和PPARγ的活性，呈剂量依赖性（表1）。同时蛇床子素也激活了PPAR靶基因如PPAR本身、脂肪酸结合蛋白2、酰基辅酶A合成酶和肉碱棕榈-1A等的表达[49]。最近研究表明，活化的MAPK可激活磷酸化PPAR，呈激动剂非依赖性[50]。蛇床子素可激活MAPK，从而活化PPAR。在肥胖型糖尿病C57BKS.Cg-m+/+ Leprdb/ JNarl（db/db）小鼠模型中，蛇床子素可显著降低血糖水平，这可能也是通过PPAR非依赖途径介导的[50]。蛇床子素具有抗心律失常活性，可能是通过介导的NO-cGMP的信号级联反应调节的[51]（表1）。另外，蛇床子素对人增生性瘢痕成纤维细胞有很强的生长抑制作用并可以下调转化因子β1的影响[52]。 2 结论

综上所述，蛇床子素具有多样的药理和生化功能，包括抗癌、保护肝脏、抗骨质疏松、保护神经和抗炎等特性。由于其独特的结构特征，蛇床子素可成为很好的先导化合物候选物。大量研究证实了蛇床子素在动物模型中的潜在作用，但需要进一步研究确定其对人的作用。由于水溶性差和低生物利用度，蛇床子素及其相关药物的开发非常具有挑战性，研究仍处于早期阶段，但基于化合物的多功能作用，蛇床子素在治疗和预防各种慢性疾病方面具有非常好的前景。

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