谷氨酸系列发酵实验

谷氨酸发酵工程系列实验

一、 实验目的

1、了解发酵工业菌种的制备工艺和质量控制，为发酵实验准备菌种。 2、了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程操作、 3、了解和掌握快速测定还原糖含量的方法。

4、了解和掌握快速测定发酵过程谷氨酸含量的方法 5、了解用等电点法从发酵液中回收谷氨酸的方法 二、 实验原理

谷氨酸是由谷氨酸棒杆菌以葡萄糖为原料生产的一种呈味氨基酸，其代谢机理为：葡萄糖先经EMP途径生成丙酮酸，丙酮酸经氧化脱氨基作用生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入三羧酸循环生成α—酮戊二酸，α—酮戊二酸再经氨基化作用生成谷氨酸。由于谷氨酸棒杆菌为生物素缺陷型突变株，因此在发酵过程中要控制生物素亚适量。 三、 实验材料、仪器与试剂

1、材料：谷氨酸棒杆菌、发酵培养基、谷氨酸发酵液不同发酵时间所取的样品等。

2、仪器：三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、pH试纸、天平、高压蒸汽灭菌锅、培养箱、显微镜、发酵罐及控制系统、蒸汽发生器、空气压缩机、补料瓶、补料针、硅胶管、滴定管、滴定架、电炉、容量瓶、高速离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液器及枪头、无极调速搅拌机、旋转蒸发器、冰箱等

3、试剂：无水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母提取液、NaCl、NaOH、HCl、KNO3、去离子水、葡萄糖、尿素、消泡剂、硫酸铜、亚甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氢化钾、盐酸、L-谷氨酸分析纯、茚三酮、丙酮、酒精等。

四、 实验步骤 1、培养基的制备

（1）斜面培养基：葡萄糖0.1%；蛋白胨1%；牛肉膏1%；NaCl0.5%；琼脂2%（pH7.0） （2）一级培养基：蛋白胨1%；酵母浸出粉0.5%；NaCl1%（pH7.2）

（3）二级培养基：葡萄糖2.5%；尿素0.34%；K2HPO4·3H2O0.16%；MgSO4·7H2O；FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O各0.0002%（pH7.0）

各培养基分装到到三角瓶，用铝箔纸封口，高压灭菌。 2、菌种制备

斜面菌种接种100mL一级种子培养基后置于控温摇床200r/min，震荡培养12h，温度为32℃。

取10mL一级种子接种到100mL二级种子培养基中，置于控温摇床200 r/min，震荡培养7~8h，温度为33~34℃.

3、发酵培养基的制备及灭菌

配制好5L发酵培养基。配方：葡萄糖13%、硫酸镁0.06%、磷酸氢二钾0.1%、氢氧化钾0.04%、糖蜜0.3%、硫酸亚铁及硫酸锰各0.0002%。配置400ml40%尿素及400ml消泡剂需灭菌。 4、接种

清洗好发酵罐，对发酵罐进行空消，加入5L的发酵培养基，对发酵罐进行实消，在接种槽中加好酒精并点燃，把二级种子培养基从接种口倒进发酵罐中进行发酵。 5、发酵过程控制

（1）温度：0~12h温度为30~32℃，发酵12h后为34~36℃. （2）pH：当pH值降到7时，需加氮源。pH试纸的测定 （3）通风量进气指针为0.4 6、试剂配置 （1）斐林试剂：

甲液：五水硫酸铜3.5g，亚甲基蓝0.005g，用水溶解并稀释至100ml； 乙液：酒石酸钾钠11.7g，氢氧化钠12.64g，亚铁氢化钾0.94g，用水溶解并稀释至100ml； 0.1%标准葡萄糖溶液：取葡萄糖1g，用少量水溶解，转至1000ml容量瓶中，加入5ml盐酸，用水稀释定容至1000ml，摇匀； 7、斐林试剂的标定

甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加水10ml，从滴定管中预先加入约20ml0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀。于电炉上加热至沸腾，在沸腾的状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液的总体积。同法平行操作3次，取接近两次体积的平均值为V0。 8、还原糖的滴定

甲、乙液各5ml，置于100ml锥形瓶中，加入0.1mlV1发酵液，摇匀后于电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下以每秒一滴的速度加入0.1%标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。记录消耗的标准葡萄糖溶液的总体积V2.

计算公式：还原糖（以葡萄糖计g/100ml）=（V0- V2）×C×1/ V1×100 9、谷氨酸标准曲线的绘制 （1）标准样品的制备：L-谷氨酸纯品梯度稀释溶液：分别称取0.05-0.5g分析纯L-谷氨酸,并分别溶解到100ml蒸馏水中，调节pH5.5-6。

（2）茚三酮试剂的制备：称取0.5g茚三酮溶于100ml丙酮。 （3）pH调节试剂的制备：2moL/L氢氧化钠溶液

（4）标准溶液OD569值的测定：

取20支试管，分别加入3ml配制好的（0. 5-5）g/100ml的L-谷氨酸纯品溶液各两管，每支试管分别沿试管壁加入茚三酮试剂0.5ml，摇匀，迅速置于80℃水浴，3min后，冰浴3min，将分光光度计波长调至569nm处，以蒸馏水为空白对照，用1cm玻璃比色皿比色，测出OD569值。以OD569值为纵坐标，绘制标准曲线。 10、发酵液谷氨酸含量测定

谷氨酸发酵液11400r/min，离心5min，取上清，蒸馏水稀释100倍，调节pH值5.5-6，取3ml预处理好的发酵液加入15mm×150mm试管，调整pH值5.5左右，沿试管壁加入0.5ml茚三酮试剂，混匀，迅速置于80℃水浴，3min后，冰浴3min，将分光光度计波长调至569nm处，以100稀释的空白发酵培养基为空白对照，用1cm玻璃比色皿比色，测出OD569值。从标准曲线上查出相应L-谷氨酸浓度。

五、实验结果及分析

表一 谷氨酸发酵实验记录表 时间/h 温度 pH DO值 通风量 OD600 还原糖含量 谷氨酸含量 时间/h 温度 pH DO值 通风量 OD600 还原糖含量 谷氨酸含量 0 31.8 5.5 4.8 32 35.8 7.0 5.0 4 31.9 6.0 4.8 8 31.8 6.8 5.0 12 31.8 7.0 5.0 14 31.0 7.0 5.0 16 31.9 7.0 5.0 18 31.8 6.8 5.0 11.8 44 35.7 7.0 5.0 10.1 20 31.9 6.8 5.0 12.6 46 36 6.5 5.0 0.99 12.0 22 31.9 7.0 5.0 11.6 48 35.7 6.7 5.0 1.25 11.8 24 31.9 6.8 5.0 11.3 26 31.9 6.5 5.0 28 35.8 6.8 5.0 30 36.0 5.5 281.5 5.0 13.7 214.9 129.8 251.3 253.9 282.1 265.6 263.8 224.0 219.1 231.9 225.5 258 0.288 0.324 0.344 0.293 0.296 0.316 0.705 0.810 0.904 1.004 0.63 12.65 10.23 11.69 15.42 11.0 34 35.8 7.0 5.0 36 35.7 7.0 5.0 38 36.0 6.5 5.0 40 35.7 7.0 5.0 12.6 42 35.8 6.7 5.0 11.3 0.722 0.732 12.21 13.0 270.4 278.9 277.2 278.2 295.3 286.6 273.4 285.2 266.8 0.739 0.728 0.780 0.890 0.602 0.608 0.99 14.45 11.70 12.07 10.9

由上面的记录表中我们可以看到1~26h我们都是保持31~32度的温度进行发酵，期间，在16~18h的时候OD值发生了一次飞跃，从0.316跳到0.705，但是溶氧值、PH值和还原糖的含量都没有发生明显的变化，而在24~26h的时候，OD值发生骤降，但是其他参数的变化不大，这两个转折点分别表示着谷氨酸棒状杆菌进入生长期和衰老期，但是由于谷氨酸棒状杆菌的数量不是很多，因此除了OD值变化较大之外，其他参数变化不大。 此次实验的结果并不理想，以下是在网上查到的关于谷氨酸发酵过程的资料： 在发酵过程中，氧、温度、pH和磷酸盐等的调节和控制如下：①氧。谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。其中谷氨酸棒状杆菌在溶氧不足时产生的是乳酸或琥珀酸。②温度。菌种生长的最适温度为30～32 ℃。当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因此，在发酵后期，可将温度提高到34～37 ℃。③pH。谷氨酸产生菌发酵的最适pH在7.0～8.0。但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产物的积累，培养液的pH会不断变化。如随着氮源的利用，放出氨，pH会上升；当糖被利用生成有机酸时，pH会下降。其中谷氨酸棒状杆菌在pH呈酸性时生成乙酰谷胺酰胺。

根据资料的说明和我们的数据记录表发现导致实验失败的原因可能与温度的调节有关。因为我们是在OD值骤降之后才将温度提升到36度，已知谷氨酸棒状杆菌的最适生长温度为31~32度，提升到36度后棒杆菌的生长繁殖速度降低，因为OD值偏低，后期的数据变化不是很大，呈现不稳定现象。而且关于还原糖的数据时高时低的现象，我们认为是人为的操作问题。因为每次都是由不同的同学对还原糖进行测定，因此后期的还原糖测定可能存在不规范的操作或较大的实验误差。