VEGF在肺纤维化肺组织内的表达及其作用研究

[文章编号]1000鄄2200(2018)10鄄1309鄄05·基础医学·

VEGF在肺纤维化肺组织内的表达及其作用研究

孙爱娟1,王中轩2,聂运娟2,钱摇峰3,4

[摘要]目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)在肺纤维化病人及模型小鼠内的表达及其在肺纤维化疾病中发挥的作用。方法:收集临床确诊为肺纤维化的病人及正常供体肺组织,通过免疫组织化学染色检测VEGF和琢鄄平滑肌肌动蛋白(琢鄄SMA)的表达,统计VEGF阳性表达与肺纤维化严重程度的相关性。给予小鼠气管注射博来霉素21d诱导肺纤维化模型,免疫组织化学染色检测模型小鼠肺组织内VEGF和琢鄄SMA的表达水平。给予小鼠气管注射VEGF164抗体后,给予博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型,H&E染色和Masson三色染色比较小鼠肺组织纤维化病理损伤和胶原表达,并进行Ashcroft评分,使用荧光定量PCR比较肺组织内琢鄄SMA和纤连蛋白的表达水平变化,使用试剂盒检测肺组织内羟脯氨酸含量的变化。结果:VEGF在肺纤维化病人和小鼠肺组织内明显的阳性表达,且阳性表达率越高,琢鄄SMA表达水平越高,呈显著的相关性。给予VEGF164抗体阻断小鼠肺组织内VEGF表达后,小鼠肺纤维化病理损伤明显减轻,胶原含量减少,琢鄄SMA和纤连蛋白的mRNA水平降低,羟脯氨酸含量减少。结论:VEGF在肺纤维化病人和小鼠肺组织内呈显著的阳性表达,阻断肺组织内VEGF表达缓解了博来霉素诱导的肺纤维化。

[关键词]肺纤维化;血管内皮生长因子;琢鄄平滑肌肌动蛋白

[中图法分类号]R563.13摇摇摇[文献标志码]A摇摇摇DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000鄄2200.2018.10.011

StudyontheexpressionandeffectofVEGFinthepulmonaryfibrosis

(1.DepartmentofPathology,WuxiPeople忆sHospital,WuxiJiangsu214000;2.MedicalCollege,JiangnanUniversity,

WuxiJiangsu214000;3.MedicalCollege,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240;

4.BengbuMedicalCollege,Bengbu,Anhui230030,China)

[Abstract]Objective:TodeterminetheexpressionofVEGFinpulmonaryfibrosispatientsandmicemodel,anditseffectondisease.Methods:TheexpressionlevelsofVEGFand琢鄄SMAinlungtissueofpulmonaryfibrosispatientsandnormallungtissueweredetectedlyzed.Themicemodelwithpulmonaryfibrosiswasestablishedusingbleomycininjectingtracheaofmicefor21d,andtheexpressiontibody,thepathologicaldamageandcollagenexpressioninlungtissueofpulmonaryfibrosismiceinducedbybleomycinwereanalyzedusingH&EandMassonstaining,thelungtissuewasevaluatedusingAshcroftscore,themRNAlevelsof琢鄄SMAandfibronectininlungtissueweremeasuredbyReal鄄timePCR,andthechangesofhydroxyprolinecontentinlungtissuewasdetectedusingkit.Results:The

[收稿日期]2018-08-01

[作者单位]1.江苏省无锡市人民医院病理科,214000;2.江南大学医学院,江苏无锡214000;3.上海交通大学药学院,上海200240;4.蚌埠[作者简介]孙爱娟(1989-),女,技师.

医学院,安徽蚌埠233030

[通信作者]钱摇峰,博士,博士研究生导师,研究员.E鄄mail:fengqian@sjtu.edu.cn

SUNAi鄄juan1,WANGZhong鄄xuan2,NIEYun鄄juan2,QIANFeng3,4

usingimmunohistochemicalstaining,andthecorrelationofpositiveexpressionofVEGFwithseverityofpulmonaryfibrosiswasana鄄levelsofVEGFand琢鄄SMAinlungtissueofmiceweredetectedusingimmunohistochemicalstaining.AftertreatmentwithVEGF164an鄄

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pressionof琢鄄SMAwascorrelativewithVEGFpositiverate.AfterVEGF164antibodyblockingtheexpressionofVEGFinlungtissue,thepathologicaldamageandcollagenexpressioninlungtissueofpulmonaryfibrosissignificantlyalleviatedanddecreased,themRNAlevelsof琢鄄SMAandfibronectindecreased,andthechangesofhydroxyprolinecontentdecreased.Conclusions:TheexpressionofVEGFrelievethePFinducedbyBLM.

[Keywords]pulmonaryfibrosis;VEGF;琢鄄SMA

inpatientswithpulmonaryfibrosisandbleomycin鄄inducedpulmonaryfibrosismicearepositive,andblockingtheVEGFexpressioncan

positiveexpressionofVEGFinlungtissueofpatientswithpulmonaryfibrosisandbleomycin鄄inducedmicewereidentified,andtheex鄄

摇摇肺纤维化是一种慢性进行性、不可逆转的严重

间质性肺疾病,多发生于中老年人,文献报道其年发病率达到27.9例/10万人,且仍呈增长趋势,病人确诊后平均存活时间仅2~3年[1-2]。肺纤维化的治疗目前仍然是个世界难题,临床上主要采用糖皮质激素、免疫抑制剂等药物或肺移植手术治疗,但预后并不理想[3-4]。随着对肺纤维化研究的深入,靶向治疗药物成为新的方向。其中,血管激酶抑制剂尼达尼布,可同时阻断血管内皮生长因子(VEGF)、成纤细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)三种生长因子的受体而发挥抗肺纤维化的靶向治疗药物。但是,VEGF在肺纤维化中的作用尚存在争议。一部分研究认为VEGF可通过血管重构等功能促进肺纤维化的发展,而另一部分研究则报道VEGF在博来霉素诱导的肺纤维化进程中起着维持组织正常结构的功能,肺纤维化病人灌洗液中细胞因子在肺纤维化中的作用,本研究利用江苏省无锡市人民医院这一全球最大的肺移植中心的病例资源,收集临床肺纤维化病人标本,检测验证VEGF表达与肺纤维化的关系,并在博来霉素诱导的肺纤维化模型中验证这一结果,从而进一步明确VEGF在特发性肺纤维化中的作用。1摇材料与方法

VEGF含量降低[5]。为了探索这一作为治疗靶点的

5211),博来霉素购自于美国BIOTANG公司(RB003),H&E及Masson染色试剂盒购自于南京建成生物技术公司,荧光定量PCR试剂购自于上海硕盟生物技术有限公司,免疫组织化学染色所用(ZA鄄0509),琢鄄平滑肌肌蛋白(琢鄄SMA)抗体购自于1.3摇博来霉素诱导的肺纤维化模型和气管注射VEGF抗体摇小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)使其麻醉后,经气管注射博来霉素溶液(1.4U/kg体质量)或者0.9%氯化钠注射液同时,经气管注射VEGF164抗体(每只小鼠500ng)入肺部,7d后,经气管给予每只小鼠注射500ngVEGF164抗体加强0.9%氯化钠注射液作为对应组的对照,观察饲养至1.4摇病理染色摇将组织脱水、浸蜡制成蜡块后切片,厚度为4滋m。经65~70毅C烤片30min至1h后脱蜡,使用HE染色试剂盒和Masson三色染色试剂盒进行染色;对石蜡切片经过3%过氧化氢灭活内源性酶活性,0.01mol/L枸橼酸钠缓冲溶液进行抗原修复,5%BSA封闭后,加入稀释的VEGF或琢鄄SMA一抗溶液,使用SABC试剂盒进行显色;苏木素1.5摇肺组织荧光定量PCR检测摇使用Trizol消化小鼠肺组织,提取RNA后,将RNA反转录为cDNA后,将逆转录好的cDNA按浓度计算出取200ng的体积作为模板,加入1滋L特定检测引物,10滋L2伊MasterMix(SYBRGreen)和蒸馏水共20滋L反应体系检测琢鄄SMA和纤连蛋白的mRNA水平。琢鄄SMA引物序列:上游引物,5忆鄄GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG鄄3忆,下游引物,5忆鄄CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT鄄3忆;纤连蛋白引物序列:上游引物,5忆鄄TCTGGGAAATGGAAAAGGGGACCTCGGTTGT鄄3忆。

ATGG鄄3忆,下游引物,5忆鄄CACTGAAGCAGGTTT1.6摇羟脯氨酸含量检测摇称取给予博来霉素或者复染、封片并观察拍照。

造模21d收集肺组织标本检测分析。

给药,每次注射VEGF164抗体时,经气管注射福州迈新生物技术开发有限公司(Kit鄄0006)。VEGF抗体购自于无锡傲锐东源生物科技有限公司

1.1摇临床标本和实验动物摇收集江苏省无锡市人民医院病理科存档的肺纤维化及其供体对照肺组织标本的石蜡包埋块各30例。6~8周C57BL/6雄性小鼠,SPF级,20~25g,购于上海斯莱克实验动物0025,小鼠饲养于江南大学实验动物中心,饲养间保7点。本实验所有操作步骤均符合中国国家科学技术委员会对实验动物管理研究的规定并获得了江南大学实验动物伦理委员会的批准。

试剂摇

1.2摇

本研究所使用的体内注射鼠源

持温度在(23依5)毅C,光照时间为早上7点至晚上有限公司,实验动物合格证号:SYXK(沪)2007鄄

VEGF164抗体购自于美国CELLSIGNAL公司(#

Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.蚌埠医学院学报2018年10月第43卷第10期0.9%氯化钠注射液21d后肺组织30~100mg,按照南京建成生物公司羟脯氨酸试剂盒说明书、采用碱水解法测定水解液在550nm处吸光度(OD)值,按照如下公式计算羟脯氨酸含量。羟脯氨酸含量=(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)伊标准品含量(5滋g/mL)伊水解样总体1.7摇统计学方法摇采用方差分析、t检验和Pearson相关性分析。2摇结果积/取样量(mL)

1311

表达,且阳性率与肺纤维化严重程度正相关摇为了检测VEGF与肺纤维化的关系,收集临床确诊为肺纤维化的肺移植组织标本,选择正常供体肺组织标本作为对照。与正常对照组比较,肺纤维化组织内VEGF呈明显阳性表达(见图1A)。肺纤维化进展中,肌成纤维细胞产生的琢鄄SMA是细胞外基质的重要组成部分,其含量的变化在一定程度上反映了肺纤维化的严重程度。结果显示:纤维化肺组织内VEGF阳性率越高,琢鄄SMA表达越多,呈明显的相关性;综合临床病理诊断显示VEGF阳性表达越高,肺纤维化越严重(见图1)。

2.1摇VEGF在肺纤维化病人肺组织内呈显著阳性2.2摇VEGF在肺纤维化模型小鼠肺组织内呈显著阳性表达,且阳性率与肺纤维化严重程度正相关摇采用博来霉素诱导肺纤维化模型,免疫组织化学染色比较给予0.9%氯化钠注射液和给予博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织内VEGF的表达。VEGF在博来霉素诱导的模型小鼠肺组织内也呈显著阳性表达(见图2)。且统计我们造模染色的所有小鼠肺组织后,同样也发现,小鼠肺组织内VEGF阳性率越2.3摇阻断肺组织内VEGF表达可以缓解博来霉素诱导的小鼠肺组织纤维化病理损伤摇为进一步探讨VEGF在肺纤维化中的作用,使用鼠源的VEGF164抗体,通过气管注射入小鼠肺泡内,阻断小鼠肺组织内VEGF的作用后,使用博来霉素诱导肺纤维化模型,检测其病理变化。肺组织切片H&E染色发现,与给予0.9%氯化钠注射液相比,给予博来霉素后小鼠肺组织结构破坏,成纤维细胞聚集,正常肺泡消失或减少,成典型的纤维化病理变化(见图3A),而与野生型小鼠给博来霉素组比较,VEGF抗体+博来霉素组肺纤维化程度降低,Ashcroft评分显示给予高,琢鄄SMA表达越多,肺纤维化程度越严重。

VEGF能减少博来霉素诱导的肺纤维化病理损伤评分(见图3B)。Masson三色染色法通常用来区分胶原纤维和肌纤维,胶原纤维呈蓝色,主要用于反映胶原含量,Masson染色提示给予VEGF+博来霉素处理组的胶原聚集明显比仅给博来霉素组含量减少2.4摇阻断肺组织内VEGF表达可以抑制博来霉素诱导的小鼠肺组织纤维化生化指标摇肺纤维化过程中,肌成纤维细胞聚集增加可以分泌琢鄄SMA和纤连蛋白等,我们检测给予小鼠VEGF抗体阻断肺内VEGF功能后对琢鄄SMA和纤连蛋白含量的影响,发现与仅给予博来霉素组相比,给予VEGF抗体加博来霉素组肺组织琢鄄SMA和纤连蛋白的mRNA水平降低(见图4A)。由于羟脯氨酸是组成胶原的主要成分,使用羟脯氨酸试剂盒检测各组含量变化,发现气管注射VEGF抗体降低博来霉素诱导的羟脯氨酸含量的增加值(见图4B)。3摇讨论(见图3C)。

摇摇肺纤维化是一种高致死率的严重肺部疾病,病

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人确诊后平均存活时间仅2~3年[1],目前尚没有有效的治疗药物,靶向药物成为近几年的研究热点[6]。其中,血管激酶抑制剂尼达尼布,可同时阻断VEGF、FGF、PDGF三种生长因子,2017年9月在我国获批成为抗肺纤维化的靶向治疗药物,用来延缓肺纤维化进程和改善肺功能[7]。但是,由于肺纤维化发病机制和影响因素复杂,靶向药物仍然存在副作用及效果不佳等问题,VEGF作为药物治疗靶点,在肺纤维化中的作用尚存在争议。部分研究[8]认为,VEGF在肺纤维化过程中起着促纤维化作用,抗VEGF治疗可以有效缓解肺纤维化损伤、减少肺

组织内胶原的产生。而也有研究[9]报道,肺纤维化病人的灌洗液中VEGF含量降低,VEGF发挥着保护肺泡结构、促进修复和维持肺组织稳定的作用,VEGF在肺纤维化进程中起着“保卫者冶的作用。鉴于VEGF在肺纤维化中的作用存在争议,本研究利用江苏省无锡市人民医院肺移植中心的病例资源,随机挑选30例临床确诊为肺纤维化的肺移植组织标本,使用免疫组织化学染色检测VEGF的表达,并用琢鄄SMA表达量结合H&E染色的临床诊断发现,VEGF阳性表达率越高,所对应的肺纤维化病人肺组织内琢鄄SMA表达量越高,纤维化程度越严

Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.蚌埠医学院学报2018年10月第43卷第10期重。我们选用动物模型继续探讨VEGF在肺纤维化中的作用。由于特发性肺纤维化病因复杂,危险因素众多,目前已有多种用于特发性肺纤维化研究的造模方法,其中博来霉素诱导肺纤维化模型的病理进程和特点与人类最为接近,在研究细胞因子对肺纤维化的作用中发挥着重要作用

[10]

1313

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Thecurrentstatusofitsepidemiology,diagnosis,andtreatmentin

鼠气管注射博来霉素21d后,收集肺组织,免疫组织化学染色同样也显示,VEGF阳性表达率越高,所对应的肺纤维化病人肺组织内琢鄄SMA表达量越高,纤维化程度越严重。

为了进一步明确VEGF在肺纤维化中的作用,给予VEGF抗体阻断肺组织内VEGF的表达后,发现小鼠肺纤维化损伤减轻,细胞外基质成分减少,以上这些数据证明,VEGF在肺纤维化中表达增加,抑制VEGF表达可以缓解肺纤维化。我们的实验结果证明了VEGF在肺纤维化中的作用是促进而非保护作用,为靶向药物尼达尼布在肺纤维化治疗中的意义提供了一定的理论依据,但是VEGF在肺纤维化进程中的调控作用尚未阐明,我们未来的研究方向将进一步阐明VEGF在肺纤维化中的作用机制,并进一步探讨其在肺纤维化不同阶段,包括早期炎症损伤过程中的作用,探讨早期干预肺纤维化中意义。

VEGF的表达对预防和治疗间质性肺纤维化的临床

[

参

考

文

献

]

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。我们给予小

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(本文编辑摇赵素容)

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