厦门大学生物化学实验讲义

生物化学实验

厦门大学环境与生态学院

2016.2

目 录

实验室守则 ................................................................................................................................ 1 实验记录及实验报告 ................................................................................................................ 2 实验一 淀粉的提取和水解 .................................................................................................... 4 实验二 总糖与还原糖的测定 ................................................................................................ 6 实验三 粗纤维的测定 ............................................................................................................ 9 实验四 酪蛋白的制备 .......................................................................................................... 12 实验五 粗脂肪的定量测定─索氏提取法 ........................................................................... 14 实验六 蛋白质等电点测定 .................................................................................................. 16 实验七 氨基酸的分离鉴定－纸层析法.............................................................................. 18 实验八 蛋白质含量的测定 .................................................................................................. 21 实验九 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 .................................................................................. 34 实验十 影响酶活性的因素 .................................................................................................. 41 实验十一 碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定 ......................................................... 45 实验十二 凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶.......................................................................... 51 实验十三 DEAE-纤维素柱层析纯化碱性磷酸酶 ............................................................. 51 实验十四 底物浓度对酶活力的影响（米氏常数的测定） ............................................. 56 实验十五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白 ..................................................... 61 实验十六 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点 ..................................... 69 实验十七 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量 ......................................... 74 实验十八 维生素C的定量测定 ......................................................................................... 79 实验十九 猪脾DNA的制备 ............................................................................................... 84 实验二十 DNA的定量测定 ................................................................................................ 87 实验二十一 DNA的琼脂糖凝胶电泳 ................................................................................ 89 实验二十二 RNA的定量测定 ............................................................................................ 92 实验二十三 肌糖原的酵解作用 .......................................................................................... 94 实验二十四 茶叶多糖的提纯与鉴定 .................................................................................. 97

仪器的使用 .............................................................................................................................. 99 附录 ........................................................................................................................................ 101

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实 验 室 守 则

1、遵守课堂纪律，认真进行实验

每个学员应该自觉地遵守课堂纪律，维护课堂秩序，保持室内安静，不大声谈笑。实验过程中要听从教师指导，严格认真地按操作规程进行实验。并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上，完成实验后经教师检查同意，方可离开实验室、实验后要认真写好实验报告，由课代表按期收交给教师，不无故拖延。 2、保持整洁

保持环境和仪器的整齐清洁是做好实验的重要条件，也是每个实验者必须养成的良好的工作习惯。实验台面和试剂药品架上都必须保持整洁，仪器药品放置要有次序，不要把试剂、药品洒在实验台面和地上，废液应倒进水槽内（强酸强碱必须都应倒入废品缸内，不可倒入水槽或随地乱扔。实验完毕需将仪器洗净收好，药品试剂排列整齐。注意保持实验台面干净及实验室整齐清洁。 3、药品使用

使用药品试剂必须注意节约杜绝浪费，要特别注意保持药品和试剂的纯净，药品用后须立即将瓶盖塞紧放回原处，从瓶中取出的试剂，标准溶液等，如未用尽切勿倒回瓶内，避免混杂。 4、仪器使用

各种仪器用具均应注意爱护，细心使用，防止损坏，使用电子天平，分光光度计和离心机等贵重精密仪器，要严格遵守操作规程，发现故障立即报告教师，不要自己动手检修，要爱护国家财产，厉行节约。 5、注意安全

为了有效地维护实验室安全，保证实验正常进行，要求： 1）要严格做到：火着人在，人走火灭；

2）勿使乙醚、丙酮、醇类等易燃液体接近火焰，蒸发或加热此类液体时，必须在水浴上进行，切勿用直火加热；

3）凡比水轻且不与水相混溶之物（如醚、苯、汽油等）着火时，应迅速用湿毛巾覆盖火焰，以隔绝空气使其熄灭，绝不能倒水于其上，以免火焰蔓延，对于易与水混溶之物（如乙醇、丙酮等）着火时，可用火扑灭之；

4）有不少药品是有毒或有腐蚀性的不可用手直接拿药品，不可将试剂瓶直接对准鼻子闻，更不可尝药品味道。用移液管吸取有毒试剂，强酸和强碱时，均应用洗耳球，严禁用口吸取； 5）离开实验室时，要关好水龙头，拉下电闸，认真负责地进行检查，严防不安全事故； 6）每次实验课由班长安排同学轮流值日，值日生要负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性工作。

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实验记录及实验报告

一、实验记录

实验课前应认真预习，将实验名称、目的和要求、原理、实验内容、操作方法和步骤等简单扼要地写在预习报告中。

实验中观察到的现象、结果和数据，应该及时地直接记在预习报告中，绝对不可以用单片纸做记录或草稿。实验记录不要抹擦及涂改，写错时可以准确地划去重写，记录时必须使用钢笔或圆珠笔。原始记录必须准确、简炼、详尽、清楚，从实验课开始就应养成这种良好的习惯。

记录时，应做到正确记录实验结果，切忌夹杂主观因素，这是十分重要的。在实验条件下观察到的现象，应如实仔细地记录下来；在定量实验中观测的数据，如称量物的重量，滴定管的读数，分光光度计的读数等，都应设计一定的表格准确记下正确的读数，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。例如，光密度值为0.050，不应写成0.05。实验记录上的每一个数字，都是反映每一次的测量结果，所以，重复观测时即使数据完全相同也应如实记录下来。总之，实验的每个结果都应正确无遗漏地做好记录。

实验中使用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、分子量准确的浓度等，都应记录清楚，以便总结实验进行校对和作为查找成败原因的参考依据。

如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等，在获得老师允许后，应当重做实验。因为，将不可靠的结果当做正确的记录，在实际工作中可能造成难以估计的损失，所以，在学习期间就应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。

二、实验报告

实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告．按照实验内容可分为定性和定量实验两大类，下面分别列举这两类实验报告的格式，仅供参考。 l、关于定性实验报告 实验（编号）（实验名称） （一）目的和要求 （二）原理 （三）试剂和仪器 （四）操作方法 （五）结果与讨论

一般每次实验课做数个定性实验，实验报告中的实验名称和目的要求应该是针对这次实验课的全部内容而必须达到的目的和要求。在写实验报告时，可以按照实验内容分别写原理、操作方法、结果与讨论等。原理部分应简述基本原理。操作方法（或步骤）可以采用工艺流程图的方式或自行设计的表格来表示（某些实验的操作方法可以和结果与讨论部分合并，自行设计各种表格综合书写）。

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结果与讨论包括实验结果及观察现象的小结、对实验课遇到的问题（和思考题）进行探讨以及对实验的改进意见等。 2、关于定量实验报告 实验（编号）（实验名称） （一）目的和要求 （二）原理 （三）试剂和仪器 （四）操作方法 （五）结果处理 （六）讨论

通常每次实验课只做一个定量实验，在实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂及仪器）和操作的关键环节必须写清楚，对于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格、标准曲线图（以及比较实验组与对照组实验结果的图表）等。（另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析）。讨论部分可以包括：关于实验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象（以及思考题）进行探讨，对于实验设计的认识、体会和建议，对实验课的改进意见等。

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实验一 淀粉的提取和水解

一、目的要求

掌握淀粉提取和水解的原理及操作方法。 二、 原理

多糖是自然界分布最广的糖类，由多个单糖分子缩合而成，具有多种生物学功能，如植物纤维素可构成植物的骨架，而淀粉、糖原则作为营养的存储形式。本实验以地瓜为原料，利用多糖能和水形成胶体溶液的原理，采用过滤、离心等方法提取淀粉。

糖苷键对酸和酶敏感，所以淀粉在酸和体内淀粉酶的作用下被降解成单糖，这种降解过程是逐步进行的，降解的中间产物遇碘曾现不同的颜色：

淀粉 → 红色糊精→ 无色糊精 → 麦芽糖 → 葡萄糖

（紫蓝色） （红色） （无色）

所以根据水解液和碘反应的颜色，可以判断水解是否已完全。本实验中采用酸水解的方法，用过量的酸保证水解完全。

三、试剂与器材

试剂： 6 mol/L盐酸、6 mol/L氢氧化钠 器材：高速组织捣碎机、恒温水浴锅、电磁炉

四、操作方法 （1）淀粉的提取

甘薯去皮切成小块（约0.3×0.3×0.3cm3），准确称取15g，加入60mL 蒸馏水，放入组织捣碎机中捣碎1min（以上步骤可以4组合作）。匀浆液用三层纱布过滤，滤渣用少量水洗，滤液合并后置50oC 恒温水浴中保温30min。轻轻地尽量倾去上层有色溶液，用25 mL蒸馏水重新悬浮白色沉淀，待重新沉淀后再倾去上层溶液，滤纸过滤或用离心机离心（3000 r/m，10 min），再用少量水洗沉淀，3000 r/m离心10 min，连滤纸移至培养皿中置烘箱内烘干（105℃烘干4h）后称重。 （2）淀粉的水解

称取淀粉1.0 g，放在大试管中用少量水调成糊状，再加入15 mL水和6 mol/L盐酸10 mL，搅拌均匀后放在沸水浴上水解半小时，冷却后用6 mol/L氢氧化钠中和至溶液呈中性，然后定容至100 mL，再取10 mL定容到100 mL成为稀释1000倍的总糖水解液。

五、注意事项

（1） 淀粉提取时水浴温度不能超过50℃，否则会因淀粉溶解度增大而减少产量；

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（2） 倾出上清时要尽可能小心，避免沉降的淀粉被震动起来。 （3） 离心机使用时要注意先进行离心管的平衡。

六、思考题

（1）如何选择生化物质实验中的实验材料？有何标准？ （2）材料的破碎方法有哪些？

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实验二 总糖与还原糖的测定

一、目的要求

掌握碱性铜试剂法测定还原糖的原理和操作方法。 二、原理

单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖和蔗糖等属于非还原性糖。利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。

还原糖的测定方法多种，本实验采用间接滴定法。其原理是：在碱性溶液中，二价铜离子被还原糖还原成一价的氧化亚铜，氧化亚铜在酸性环境中与一定量的过量碘起反应， 再用标准硫代硫酸钠滴定剩余的碘，即可算出还原糖的含量。反应方程式是：

三、试剂与器材 1. 试剂

（1） 铜试剂：

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（A）13 g 硫酸铜加水至1000 mL

(B) ①24 g酒石酸钾钠（用以保持铜离子碱性液中不生成Cu(OH)2沉淀）； ②40 g无水碳酸钠

③50 g碳酸氢钠

④36 g草酸钾（用以抑制铜离子的还原）

⑤1.6 g碘酸钾（用以从碘化钾溶液中释放出一定量的自由碘）

制备溶液B时，先用500 mL热水溶化①、②、③，再加④、⑤，然后加水至1000 mL，最后将（A）、（B）等量混合。

（2） 0.005 mol/L硫代硫酸钠：1.24 g硫代硫酸钠和0.1 g碳酸钠加水配成1000 mL。 （3） 1%淀粉：1 g可溶性淀粉溶于100 mL饱和的NaCl溶液中煮沸。 （4） 2%碘化钾：20 g KI 用水溶至1000 mL。 （5） 2 mol/L硫酸：166.6 mL母液溶于水至1500 mL。 （6） 0.5 mg/mL标准葡萄糖：0.5 g葡萄糖加水至1000 mL。

2. 器材

碱式滴定管、电磁炉

四、操作步骤

（1）样品中总糖的水解： 称取淀粉1.0 g，放在大试管中用少量水调成糊状，再加入15 mL水和6 mol/L盐酸10 mL，搅拌均匀后放在沸水浴上水解半小时，冷却后用6 mol/L氢氧化钠中和至溶液呈中性，然后定容至100 mL，再取10 mL定容到100 mL成为稀释1000倍的总糖水解液。 （2）取6只试管，按照下表的次序加入试剂。另取6个小三角烧瓶，按相应的试管顺序编号。

试剂 管号 空 白 试 验 标 准 试 验 总 糖 试验 1 2 1 2 1 2 H2O (mL) 2 2 1 1 标准葡萄糖（mL） 1 1 总糖水解液（mL） 2 2 铜试剂 （mL） 4 4 4 4 4 4 沸 水 浴 中 煮 沸 15 分 钟 用以保持一定的碱性环境环境

（3）各试管冷却后，摇动试管，使试管底部的红色沉淀分散后倾入相应的三角瓶中；

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（4）分别在每个试管中加入2 mL 2％碘化钾溶液和2 mL 2 mol/L H2SO4，以洗涤管中的残留物，并转入相应的三角瓶中，最后再用蒸馏水洗涤试管2次，每次1mL，洗涤液均转入相同的三角瓶中； （5）用0.005 mol/L NaS2O3滴定至碘颜色接近消失时加入淀粉指示剂5滴，继续滴定至蓝色消失为止。 五、计算

按照如下公式计算还原糖的含量：

（V空－V标）/0.5 mg＝（V空－V未知）/ X（X为样品中还原糖的含量）

X 六、注意事项

0.5（V空-V未知）

V空-V标（1）各试管的处理应一致，测定溶液应同时放入沸水中，再同时从沸水浴中取出。 （2）在用碘化钾和硫酸洗涤试管时要洗净，否则会影响滴定结果的准确性。

（3）滴定终点时碘与淀粉反应形成的紫蓝色褪尽，溶液呈现二价铜离子的浅天蓝色，不要误以为终点未到。

七、思考题

(1) 碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优点？

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实验三 粗纤维的测定

一、目的要求

学习和掌握粗纤维的定量测定方法。 二、原理

粗纤维是指不能被稀酸、稀碱所溶解，不能被人体或家畜所消化利用的天然有机物质。其主要

成分为纤维素、残存的半纤维素和木质素。本法是在热的稀酸处理下，样品中的淀粉，果胶质和部分纤维素被水解出去后，再用热的氢氧化钠处理，溶解除去蛋白质、部分半纤维素和部分木质素，并使脂肪皂化而去除。然后用乙醇或乙醚处理除去单宁、色素、残余脂肪、蜡、部分蛋白质和戊糖，所得的残渣，扣除灰分（金属氧化物），即为粗纤维。

三、试剂与器材

1. 试剂：1.25% 硫酸、1.25％氢氧化钠、正辛醇、95％乙醇 2. 器材：干燥箱、粗纤维测定仪

四、操作方法 1. 操作前的准备

(1) 将仪器放置于工作台上，工作台就近应有水池和水嘴。将三个烧瓶放置于仪器顶部的电加热板上，并将顶部小孔中伸出的写明酸、碱、蒸馏水的橡胶管套在相应的烧瓶底部的水嘴上。三个烧瓶的位置从左至右相应为酸、碱、蒸馏水。然后将进出水嘴（位于机箱左下侧）分别套上橡胶管，5个水嘴分别为：靠前的两个为进水嘴，靠后的上面两个为出水嘴，靠后的下面一个为抽滤出水嘴，应用橡胶管引入水池。

(2) 将样品用粉碎机粉碎，全部通过18目筛后，放入密闭容器。

(3) 样品中若脂肪含量大于10％，则必须脱脂，脂肪含量若小于10％可不脱脂。

(4) 将坩锅用蒸馏水洗尽，使其不带任何杂质，并将其置于恒温箱内（温度在100oC左右）烘30分钟左右然后移入干燥器内冷却至室温，并将其编号，再置于干燥器内备用。

(5) 将电源线一头插入仪器右下侧的电源插座中，另一头插入交流220V的电源插座中，实验室的电源插座必须用三脚插座，且必须有可靠接地。

(6) 在仪器顶部的酸、碱、蒸馏水烧瓶中分别加入已配制好的酸、碱、蒸馏水，应基本加满。将瓶盖盖上。

(7) 在坩锅内放入l-2 g试样，并将装好试样的坩锅分别放入6个抽滤座中，注意应放置于抽滤座中央的硅橡胶圈上，并使其与上面的消煮管下套中的硅橡胶口对齐，不要将坩锅放偏或放斜，否则将

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会漏液，当六个坩锅均放置准确后稍压下操纵杆柄并锁紧。

(8) 打开进水开关。将面板上预热调压旋钮和消煮调压旋钮逆时针旋到底，打开电源开关，调整定时器的设定时间为30 min，以后使用时可不必调节。

(9) 开启酸、碱、蒸馏水预热开关，调节预热调压旋钮，将其调到顺时针最大，这时左边电压表显示电压为220V左右。

(10) 等酸、碱、蒸馏水沸腾时，将预热电压调小至酸、碱、蒸馏水微沸。

(11) 打开加酸开关，分别按l-6号加液按钮在消煮管中加入已沸的酸液200 mL约到消煮管中间刻度线，再在每个消煮管内加2 mL正辛醇。关闭酸预热开关，开启消煮加热开关将消煮调压旋钮调至最大，此时右边电压表显示约220 V左右，待消煮管内酸液再次沸腾后再将电压调至150-170 V左右，使酸液保持微沸，向上打开消煮定时开关，保持酸微沸30 min。

(12) 将消煮加热开关关闭，将消煮定时开关向下关闭，将消煮调压旋钮逆时针旋到底，打开l-6号抽滤开关，打开抽滤泵开关，将酸液抽掉。抽完酸液后，先关闭抽滤泵开关，再关闭抽滤开关。打开蒸馏水开关，再按下l-6号加液按钮，在消煮管中加入蒸馏水后再抽干，连续2-3次，直至用试纸测试显中性后关闭加蒸馏水开关。在抽滤过程中若发现坩锅堵塞时，可关闭抽滤泵，开启反冲泵用气流反冲，直至出现气泡后关闭反冲泵，打开抽滤泵继续抽滤。洗涤完毕后关闭所有抽滤开关及泵开关。

(13) 打开加碱开关，分别在消煮管中加入微沸的碱溶液200 mL后关闭加碱开关，再在每个消煮管中加入2滴正辛醇后重复第11后半部分和第12步的操作，进行碱消煮、抽滤和洗涤。

(14) 以上工作完成以后，用吸管分别在消煮管上口加入25 mL左右95％乙醇，浸泡十几秒钟后抽干。 (15) 将操纵杆手柄稍用力下压后拉出定位装置，使升降架缓慢上升复位，戴上手套后将坩锅取出，移入恒温箱，在130oC下烘干2小时，取出后在干燥器中冷却至室温，称重后得到试样质量m。 (16) 将称重后的坩锅再放入500oC的高温炉内灼烧1小时，取出后置于于燥器中冷却至室温后称重后得到m。

测定结果按下式计算：

粗纤维%

式中：m1——100oC烘于后坩锅及试样残渣重；

m2——500oC灼烧后坩锅及试样残渣重； m——试样（未脱脂）质量。

m1-m2% m10

蒸馏水烧瓶

图1 粗纤维测定仪

五、注意事项

(1) 样品粒度的大小将影响分析结果，通常将样品研磨成粒度为1mm3左右为宜。 (2) 样品脂肪含量大于10%，应先脱脂，脱脂不足，则分析结果偏高。

六、思考题

(1) 在本测定中哪些因素是影响测定结果的主要因素？ (2) 在测定中为什么必须严格控制实验条件? (3) 用本方法测定的结果为什么称为“粗纤维”？

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实验四 酪蛋白的制备

一、目的要求

1、掌握从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 2、了解等电点沉淀在蛋白质制备中的应用。 二、原理

牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成份。蛋白质中的酪蛋白通过等电点沉淀，再通过离心而获得，糖类小分子由于处于清液中而分离，沉淀物中所含的脂肪通过有机溶剂抽提而去除，最终得到纯白色、晶状酪蛋白。

三、试剂与器材

材料：牛奶（奶粉配制，3％）

试剂：0.2 mol/L HAc-NaAc缓冲液、95%乙醇、乙醚 器材：离心机、水浴锅、pH计

四、操作方法

1. 取10 mL40°C牛奶预热，加入40°C预热的醋酸缓冲液10 mL左右，边加边搅拌，调pH至

4.7，室温冷却，5000 r/min离心5min，得到沉淀。

2. 沉淀于离心管内加入4 mL H2O悬浮，5000 r/min离心5min，得到沉淀。 3. 沉淀于离心管内加入20 mL乙醇，放置5min，微搅动，去脂肪。

4. 漏斗过滤(或5000 r/min离心5min)上述悬浮液，在漏斗中加入20 mL乙醇悬浮沉淀，滤干(或

5000r/min离心5min)。

5. 加入20 mL乙醇乙醚混合液（1:1）洗涤，漏斗过滤(或5000 r/min离心5min)，后再加入20mL

乙醚洗涤脂肪完毕，漏斗过滤。

6. 于60°C，带滤纸烘干4h，称重并计算得率。 五、计算

六、注意事项

1、牛奶与缓冲液要预热。 2、缓冲液要缓加缓搅。

实际获得百分率＝

酪蛋白质量（g） 10 mL牛奶

× 100％

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3、在滤纸上样品的脱脂过程要搅动，不得破损滤纸。 4、实验环境要保持空气流通，门窗要开。 七、思考题

(1)在酪蛋白制备时为什么要用醋酸缓冲液调pH到4.8？ (2)乙醚、乙醇作用是什么？

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实验五 粗脂肪的定量测定─索氏提取法

一、目的要求

学习和掌握粗脂肪的定量测定法─索氏提取法 二、原理

脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸结合成的脂类化合物，能溶于脂溶性有机溶剂。

本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30ºC -60 ºC的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪”。

三、材料、试剂与器材 材料：全脂奶粉 试剂：乙醚

器材：粗脂肪测定仪、干燥箱

四、操作方法

1. 操作前准备：抽提筒用蒸馏水洗净，置干燥箱在105 ℃温度下烘1小时，取出移入干燥缸内，冷却后称重编号备用。

2. 样品准备：样品磨碎，称取约1.0g在105 ℃温度下烘30分钟，趁热倒入研钵中，加入约2g脱脂细砂一同研磨。将试样和细砂研到出油状后，全部置入滤纸筒内（筒底塞一层脱脂棉，并在105 ℃温度下烘30分钟），用脱脂棉蘸少量乙醚揩净研体上的试样和脂肪，并入滤纸筒内，最后再用脱脂棉塞入上部，压住试样。

3. 移动滑动球，把滤纸筒置入抽提筒内，使磁钢把过滤筒吸住，并观察滤纸筒是否在抽提筒上口对准下压紧圈的园柱孔，两者平面保持良好接触。

4．在抽提筒内注入无水乙醚约50ml，然后将抽提筒移置加热板上，调节位置使抽提筒上口对准下压紧圈的圆柱孔，两者平面保持良好接触。

5. 开启电源，根据所需加热温度调节电加热旋钮到60 ℃，显示屏上直接显示加热温度值。移动滑动球（上滑）使试样置入抽提筒内（此时）滤纸筒底与抽提筒底接触，做到不使滤纸筒脱落，使试样完全浸入溶剂内浸泡）。

6. 从溶剂挥发开始浸泡约0.5 h，然后将纸筒升高5 cm进行抽提，约1 h 后再将滤纸筒提升1cm（最高位置），同时将冷凝管调旋塞完全关闭（即旋塞于柄位置与水平面平行），进行溶剂回收。 7. 将抽提筒从加热板上取出，置入恒温箱内，烘去水份，然后移入干燥缸内冷却后称重，计算含油

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量。

8. 使用完毕关闭电源，并保持机内干净。

五、结果处理

根据下表将实验结果分别填入并计算样品的粗脂肪百分含量： 样品重量（g）

六、注意事项

乙醚为易燃有机溶剂，实验室应保持通风并禁止任何明火。 七、思考题

（1）本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分，可用什么方法进一步处理？ （2）本实验样品制备时烘干为什么要避免过热?

抽提桶重（g） 抽提桶及脂肪重（g） 脂肪重（g） 粗脂肪含量（％） 15

实验六 蛋白质等电点测定

一、目的

了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。 二、原理

蛋白质的分子量很大，它能形成稳定均一的溶液，主要是由于蛋白质分子都带有相同符号的电荷，同时蛋白质分子周围有一层溶剂化的水膜，避免蛋白质分子之间聚集而沉降。

蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳离子，在碱性溶液中成阴离子。蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。若再加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，竭力减低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加明显。各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7~4.8，血红蛋白等电点为6.7~6.8，胰岛素是5.3~5.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在pH 12.0~12.4。近年来蛋白质的等电点可以采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。

三、器材及试剂 1．器材：

试管、吸管、移液管、量筒、500mL容量瓶、试管架 2．试剂：

（1）0.01 mol/L醋酸溶液 （2）0.1 mol/L醋酸溶液 （3）1 mol/L醋酸溶液

（4）1 mol/L 氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定） （5）酪蛋白

四、操作步骤 1．制备蛋白质胶液

（1）称取酪蛋白3克，放在烧杯中，加入50 mL 40℃的蒸馏水。

（2）加入50毫升1 mol/L氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。 （3）在烧杯中再加入1 mol/L醋酸溶液50 mL，摇匀，使蛋白质完全溶解为止。

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（4）将溶解好的蛋白溶液转移到500 mL容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。 加入蒸馏水定容至500 mL，得到略现浑浊的、在0.1 mol/L NaAC溶液中的酪蛋白胶体。 2．等电点测定 2．等电点测定

按下表顺序准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，混匀后，在各管中加入蛋白质胶液并立即摇匀。

0.01 mol/L HAC (mL) 0.62 1.25 － － － － － － － 0.1 mol/L HAC （mL） － － 0.25 0.50 1.00 2.00 4.00 － － 1 mol/L HAC （mL） － － － － － － － 0.80 1.60 5.8 5.5 5.2 4.9 4.6 4.3 4.0 3.7 3.4 pH 蛋白质 胶液 (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 分钟 观 察 10 分钟 20 分钟 管号 H2O (mL) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 4.38 3.75 4.75 4.50 4.00 3.00 1.00 4.20 3.40 观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。观察时可用+，++，+++，表示浑浊度。

五、思考题

（1）在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。 （2）在分离蛋白质时等电点有何实际应用意义？

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实验七 氨基酸的分离鉴定－纸层析法

一、目的

通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理

层析法又称色谱法。1903年，科学家发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈。此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography）。虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。

层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。

分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用α表示分配系数。

CS溶质在固定相的浓度α=

CL 溶质在流动相的浓度

一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。

纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。

纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘2厘米），点上样品，干后，在密闭的容器内，待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中的混合物得到分离。这种操作常称单向层析。为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层析。即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶剂系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转90°，再用另一个溶剂系统展层。

物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用Rf表示。

Rf=

若X表示原点到层析点中心的距离。X+Y表示原点到溶剂前沿的距离，则 R f =

原点到层析点中心的距离

原点到溶剂前沿的距离X XYR f值的主要决定因素是分配系数（α）。对于某一物质在一定条件下的α值是固定的。因此R f

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值为其特征常数。

现将影响R f值的因素概括如下：

1、物质结构的影响：极性物质易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此R f低于后者。

—CH2—基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则—CH2—基增加，整个分子的极性就降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值亦随之增加，例如氨基酸的R f值：甘氨酸＜丙氨酸＜亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸＜谷氨酸。

极性基团的位置不同也会引起Rf变化，例如在正丁醇-甲酸-水系统中层析时，α-丙氨酸的R f值大于β-丙氨酸。

2、溶剂的影响：同一物质在不同溶剂中R f值不同，选择溶剂系统时应使被分离物质在适当Rf

值范围内（0.005到0.85之间），并且不同物质的R f至少差别为0.05才能彼此分开。

溶剂的极性大小也影响物质的Rf值。在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的Rf值随着溶剂碳原子数目增加而降低。

3、pH的影响：溶剂系统的pH会影响物质极性基团的解离形式，如对于酸性氨基酸，在酸性时所带净电荷比碱性时少，带电荷越少亲水性越小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。

溶剂的pH还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。对于极性物质如氨基酸来说Rf值增加，非极性物质则减少。若pH不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸（或箱）中用酸或碱的气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。

4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密，有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中含有Ca2+、Mg2+、Cu2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸（0.01 mol/L-1或0.4 mol/L-1HCl）洗涤滤纸将之除去。

5、温度的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。温度变化对Rf值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过±0.5℃。

除上述因素影响Rf值外，样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。 无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作显色剂。

茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会出现白斑，此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。

铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定。用硫酸酮乙醇溶液洗脱层析后的

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显色斑点，借比色法可定量测定氨基酸含量。

三、器材及试剂 1．器材

层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、电吹风、层析滤纸（新华一号） 2．试剂

(1) 展开剂：溶剂系统（24 mL）： 正丁醇－乙酸－水（4：1：3，V/V)

(2) 氨基酸溶液：0.5%的脯氨酸、缬氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。

(3) 显色剂：0.1%水合茚三酮乙醇溶液。0.5%

四、操作步骤

1．将配好的层析液倒入培养皿中，把培养皿放入层析缸中，盖紧缸盖，放置30分钟。

2．取层析滤纸（长18－20厘米，宽14厘米）一张。在垂直于纸的纹路一端距边缘1.5厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2厘米作一记号，作为点样位置（共6点），并用铅笔在点样点下端写出所点氨基酸的名称。

3．点样：用毛细管吸取样品约2cm高，将各氨基酸样品分别点在这六个位置上，用电吹风吹干后再点一次，共点三次。每点在纸上扩散的直径最大不超过5毫米。

4．扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1厘米。当前沿线到达层析纸2/3-3/4处时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，用电吹风热风吹干。

5．显色：用喷雾器均匀喷上0. 1%茚三酮溶液，然后用热风吹干即可显出各层析斑点。 6．用铅笔画出层析斑点并算出Rf值。

五、注意事项

1. 为了防止滤纸被手上的汗液污染，在操作时带手套。

2. 重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风吹干滤纸。

六、思考题

（1）如何用纸层析法对氨基酸进行定性和定量的测定？ （2）纸层析和柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？ （3）请对试验中所用的几种氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。

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实验八 蛋白质含量的测定

目的要求

1. 学习和掌握蛋白质含量测定的原理 2. 掌握测定蛋白质浓度的操作技术

（一）微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量

一、原理

天然有机物(如蛋白质和氨基酸等化合物)的总氮量通常用微量凯氏定氮法( Micro - Kjeldahl Method )来测定。

当被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵，此过程称为消化。由于消化过程进行缓慢，实验中常添加硫酸钾和硫酸铜的混合物来促进，硫酸铜是催化剂，硫酸钾可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。

上述过程的化学反应如下： (1) 消化

有机氮化物(C、H、O、N、P、S)+浓H2SO4→CO2+H2O+NH3↑+SO2+H3PO4 NH3+H2SO4→(NH4)2SO4 (2) 蒸馏

(NH4)2SO4+NaOH→Na2SO4+H2O+NH3↑ (3) 吸收

NH3+H3BO3→NH4HB4O7+H2O (4) 滴定

NH4HB4O7+HCl→NH4Cl+H3BO3

在微量凯氏定氮法中，常用硼酸-指示剂混合液收集氨，氨与溶液中氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度，即指示剂变回原来颜色为止。所用无机酸的摩尔数即相当于样品中氨的摩尔数。本法适用范围约为0.2-1 mg氨。

因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。

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二、试剂和器材 1. 试剂

(1) 浓硫酸（AR），

(2) 粉末硫酸钾-硫酸铜混合物：K2SO4∶CuSO4·5H2O=3∶1、6∶1或10∶1， (3) 40%（W/V)氢氧化钠溶液， (4) 4%（W/V)硼酸溶液，

(5) 0.01 mol/L标准盐酸（用硼砂标定)： 吸取分析纯盐酸（比重1.19，约12 mol/L)8.5 mL，用蒸馏水稀释至1 L，贮于试剂瓶中待标定。准确称取3份干燥的硼砂，每份0.381-0.383 g分别放在150 mL三角瓶中，加入20 mL蒸馏水使其溶解，加入三滴甲基红指示剂（0.1 g甲基红溶于250 mL 水中），用待测的盐酸滴定至橙红色为止，记下盐酸的滴定体积，通过计算即可知道盐酸的准确浓度：

CHCl=

W1000

MrV式中，W为硼砂称量（g)；V为HCl的滴定体积（mL)；Mr为硼砂分子量。

(6) 混合指示剂贮备液：取50 mL 0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200 mL 0.1%甲基红乙醇溶液混合而成，贮于棕色瓶中备用。此指示剂在pH 5.2为紫红色；pH 5.4为暗蓝色（或灰色）；pH 5.6为绿色。变色范围很窄，变色点pH为5.4，故混合指示剂很灵敏。

(7) 标准硫酸铵溶液（0.3 mg氮/ mL)：取141.6 mg分析纯硫酸铵，加水溶解，定容至100 mL。 2. 待测样品：豆浆(市售) 3. 器材

(1) 微量凯氏定氮仪，

(2) 50 mL凯氏烧瓶，100 mL锥型瓶，50 mL酸式滴定管，100 mL量筒，100 mL容量瓶，100 mL烧杯，酒精灯

三、操作方法 3.1 样品的消化

在凯氏烧瓶中加入催化剂约50 mg，用移液管依次加入3 mL均一的豆浆和3 mL浓硫酸（移液管要接近凯氏烧瓶底部，不使样品粘附在瓶口或瓶颈）。另取一支凯氏烧瓶加入3 mL水代替豆浆，其余试剂同上，此为空白。

将凯氏烧瓶放在通风柜内的电炉上加热，火力不要太猛，应以使液体保持微沸状态为宜。瓶内液体逐渐由黄色变为黑色，继而转为淡黄色，最后成清澈淡蓝色溶液，消化即告完全，取出烧瓶，冷却，将瓶内液体转移至50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。 3.2 仪器的装置和蒸洗

按图2装好凯氏定氮仪，再用蒸气进行蒸洗，以除去NH3和其它干扰物质。蒸洗方法如下： 接通冷凝水，打开夹子（J），往蒸馏瓶（B）内加入占球部1/3体积的清水，而后取5 mL蒸馏

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水从小漏斗（A）缓慢地注入反应瓶（F），关上夹子（I），同时加热蒸馏瓶（B），蒸馏反应瓶内的蒸馏水，使其沸腾产生蒸气。产生的气体沿导管上升到冷凝管（C），气体经过冷却从冷凝管末端（G）流入收集瓶。排出反应瓶（F）中的液体，重复蒸洗23次，以便较熟练掌握蒸洗的方法。（反应瓶（F）中的液体排出的方法：样品蒸馏完毕后，继续加热使其沸腾，移开酒精灯，关上夹子（I），稍等片刻，由于蒸馏瓶（B）中的蒸气较反应瓶（F）中的多，所以冷却后蒸馏瓶（B）中的压力比反应瓶（F）的低，反应瓶（F）内的废液迅速地从出样口（H）抽出到反应瓶外，随即自加样小漏斗（A）往反应瓶（F）中较快地倒入一些冷蒸馏水，关上夹子（I），稍等片刻，反应瓶（F）内的液体又迅速地从出样口（H）抽出，然后打开夹子（K）排出蒸馏瓶中的热水，关上夹子（K），打开夹子（J），往蒸馏瓶（B）中加入1/3球部体积的清水，即可进行下一次蒸馏）。仪器的安装和蒸洗过程中，应很好地掌握几个夹子的开关关系，避免漏气是实验成败的关键步骤。

图2 微量凯氏定氮仪装置图 A．小漏斗 B．蒸馏瓶 C．冷凝管 D．入水口 E．出水口 F．反应瓶 G．冷凝管末端 H．出样口 I、J、K. 夹子

3.3 标准硫酸铵的测定

(1) 吸取10 mL 4%硼酸溶液注入三角烧瓶，加入2滴指示剂，将其倾斜地放在冷凝管末端（G）下，使管末端插入溶液内。

(2) 用移液管准确吸取5 mL标准硫酸铵溶液置于小漏斗（A），小心打开夹子（I），使其缓慢流入反应瓶（H），用12 mL蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶（H）。

(3) 量取5 mL 40% NaOH溶液，置小漏斗（A），小心打开夹子，使其缓慢流入反应瓶（H），同样用

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12 mL蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶（H），关上夹子（I），避免蒸馏过程中氨散失。

(4) 加热蒸馏瓶（B）使反应瓶内液体开始沸腾，立即收集氨，当三角瓶中溶液由紫红色变成鲜绿色开始记时，蒸馏5 min后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约1 cm，继续收集2-3 min，最后用蒸馏水把末端剩余的氨全部洗到三角瓶中，即算蒸馏完毕。排出废液，量取5 mL蒸馏水蒸洗反应瓶一次，就可以进行第二份标准硫酸铵溶液的蒸馏工作。

(5) 将收集的各瓶蒸馏液分别用0.0100 mol/L标准盐酸溶液滴定至蓝色消失，使溶液呈淡桔红色为止。

用标准硫酸铵溶液连续测定三次，三次测定的终点颜色应一致，滴定数据差值不超过0.05 mL。 3.4 样品及空白的测定

将3.1操作所得的消化液在定氮仪上进行含氮量测定，方法与标准硫酸铵溶液测定相同，并进行空白测定。 3.5 结果处理

样品含氮量(mg/mL)=

(AB)C14N

V(AB)C146.25N

V若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则 样品中的蛋白质含量(mg/mL)=

式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数，B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数，V为样品的毫升数，C为盐酸的准确摩尔浓度，14为氮的原子量，6.25为系数，N为样品的稀释倍数。

按上面公式计算每毫升标准硫酸铵溶液的含氮量（mg/mL）和每毫升豆浆中蛋白质含量（mg/mL）。

四、 注意事项

(1) 如果测定的样品不是纯蛋白，测定的总氮量中很可能包含非蛋白氮，若要进行比较准确的测定，就必须分别测定样品中的蛋白氮和非蛋白氮。后者的测定是将样品制成匀浆或抽提液，用三氯醋酸或氢氧化铜等蛋白质沉淀剂将蛋白质沉淀，然后按测总氮的方法分析上清液，便得到非蛋白氮。把总氮量减去非蛋白氮量即得蛋白氮量。将蛋白氮量乘以6.25便是蛋白质的含量。

(2) 为保证所有硫酸铵都能转化为氨，需要使溶液呈强碱性，所以要加足量的40%NaOH溶液。加入时应缓慢进行，以免产生剧烈反应导致接受瓶内硼酸溶液的倒吸和氨的损失。碱液加入后，有铜氨离子、氢氧化铜或氧化铜等化合物生成，溶液呈蓝色或褐色，并有胶状沉淀产生，这是正常现象。反之，如果颜色不变，说明碱液可能不够。

(3) 蒸馏时要避免火力不稳，否则会发生样品被倒吸到蒸馏瓶的现象。

(4) 在进行下一次蒸馏时，要先将蒸馏瓶中的热水放掉，加入冷水，否则也会发生样品被倒吸到蒸馏瓶的现象。

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五、思考题

(1) 写出以下各步的化学反应式

a. 蛋白质的消化；b. 氨的蒸馏；c. 氨的吸收；d. 氨的滴定。

(2) 测定标准硫酸铵和空白的目的是什么？ (3) 消化时加硫酸钾–硫酸铜混合物的作用是什么？

（二）双缩脲法测定蛋白质浓度

一、实验原理

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用来测定蛋白质的浓度。在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540 nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。本法测定蛋白质范围1-10 mg。

H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3

双缩脲

关于分光光度法测定物质含量的原理介绍如下：

分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的技术。因为分光光度法极为灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分的系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质，因此分光光度法目前已成为生物化学研究中广泛使用的方法之一。

当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液。 入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光

如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射，分散等因素造成的入射光的损失，则

入射光=吸收光+透过光

I0为经过空白校正后入射光的强度；I为透过光的强度。

根据实验得知

I=I0·10-εcL

式中，c表示吸收物质的摩尔浓度；L表示吸收物质的光径，用cm表示；ε表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对光的吸收特性，不同物质的ε数值不同。

所以

I=10-εcL I025

令 T（透射比）=

II，则T%=×100 I0I0∴ T=10— εcL

由上式可得

lg

lg

1= εcL T1为物质的消光值（E）或吸光度（A）。 T

∴ A= εcL

若以A对物质的浓度作图，则得一直线。

上式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比，这就是Beer—Lambert定律。

二、试剂与器材

试剂：双缩脲试剂：溶解1.50 g CuSO4·5H2O和6.0 g NaKC4H4O6·4H2O于500ml水中，在搅拌下加入300 ml 10% NaOH溶解，用水稀释到1升，贮存在冰箱中，备用。 2 mg/mL牛血清白蛋白

三、操作步骤

1.取15支试管，按下表编号、加试剂

试管编号 牛血清白蛋白(mg) 2mg/mL牛血清白蛋白体积(mL) 待测液体积(mL) 蒸馏水(mL) OD540 0 0 0 － 3.0 1 0.6 0.3 － 2.7 2 1.2 0.6 － 2.4 3 2.4 1.2 － 1.8 4 3.6 1.8 － 1.2 5 4.8 2.4 － 0.6 6 6.0 3.0 － 0 样品 － 器材：722型分光光度计、水浴锅

3.0* 0

2.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0 mL，37 oC反应30 min。 3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。

四、结果处理 1.绘制标准曲线

以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。 2.样品的计算

根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。

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五、注意事项

1.须于显色后30 min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 2.样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。

（三）Folin—酚试剂法（Lowry法）测定蛋白质浓度

一、原理

蛋白质含有两个以上的肽键(－CO－NH－)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂（磷钼酸－磷钨酸试剂），蛋白质－铜络合物能还原磷钼酸－磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。

本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10－20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15 min内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素干扰。对双缩脲反应发生干扰的基团，如－CO－NH2、－CH2－NH2、－CS－NH2，在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、巯基化合物等均可干扰Folin-酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。在测试时应排除干扰因素或做空白实验消除。浓度较低的尿素（约0.5%左右）、胍（0.5%左右）、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠－氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须将碳酸钠－氢氧化钠溶液的浓度提高1-2倍。

Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。Folin-乙试剂仅在酸性pH下稳定，但上述还原反应只在pH10的情况下发生，故当Folin-乙试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应能发生。

本法可测定范围是25-250 μg蛋白质。

二、试剂和器材 2.1试剂 (1) 试剂甲：

(A) 4%碳酸钠（Na2CO3）溶液 (B) 0.2 mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液

(C) 2%酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸钠） (D) 1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液

临用前将(A):(B):(C):(D)=50:50:1:1(V/V)混合，此混合液即为试剂甲。混合后的溶液一天内有效。

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(2) Folin-酚试剂（试剂乙）

在1.5 L容积的磨口回流瓶中加入100 g钨酸钠（Na2WO4·2H2O），25 g钼酸钠（Na2MoO4·2H20），及700 mL重蒸水，50 mL 85%磷酸，100 mL浓盐酸充分混合，烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出，接上回流冷凝管以文火回流10 h。回流结束后，加入150 g硫酸锂（LiSO4），50 mL重蒸水及数滴液溴，开口继续沸腾15 min，以除去多余的溴。冷却后溶液呈金黄色（如果仍呈绿色，须再重复滴加溴水的步骤），定容至1 L，过滤，滤液置棕色瓶中保存，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用标准NaOH滴定酸度，以酚酞为指示剂。该试剂的酸度应为2 mol/L左右，将之稀释至相当于1 mol/L酸度使用，即为Folin-酚试剂。

(3) 标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，再根据其纯度配制成500 g蛋白/mL溶液。 2.2 测试样品

血清使用前稀释100倍或约含20-250 g/mL蛋白质的样品溶液。 2.3 器材

(1) 722型分光光度计 (2) 恒温水浴锅 (3) 试管及试管架

(4) 0.5mL，1mL及5mL移液管

三、操作方法

3.1 蛋白浓度标准曲线的制作

取14支试管，分两组按下表平行操作

试管编号 试剂处理 蛋白含量(g) 标准蛋白溶液(mL) 重蒸水(mL) Folin-酚甲试剂(mL) 0 0 0 0.5 1 25 0.05 0.45 2 50 0.10 0.40 3 100 0.20 0.30 各管加入4mL 4 150 0.30 0.20 5 200 0.40 0.10 6 250 0.50 0 混匀，于20-25℃放置10 min Folin-酚乙试剂(mL) 各管加入0.5mL 迅速混匀，30℃(或室温20-25℃)水浴保温30 min，以0号管为空白对照，在650nm处比色 OD650 绘制标准曲线：以OD650值为纵坐标，标准蛋白量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

28

3.2 样品溶液蛋白质浓度测定

取6支试管，分两组，按下表平行操作

试管编组 试剂处理 样品溶液(mL) 重蒸水(mL) Folin-酚甲试剂(mL) 空白管(3) 0 0.5 各管加入4mL 混匀，于室温20-25℃放置10 min 样品管(3) 0.5 0 Folin-酚乙试剂(mL) 各管加入0.5mL 迅速混匀，于30℃(或室温20-25℃)保温30 min OD650 3.3 计算

OD650值对应标准曲线蛋白含量10-3

×样品溶液稀释倍数 蛋白质浓度(mg/mL)= 测定时所用样品溶液mL数

3.4 注意事项

(1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin-酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质反应生成碱性的铜-蛋白质溶液。因此当Folin-酚乙试剂加入后，应立即混匀，使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂破坏之前。

(2) 血清应适当稀释使其蛋白质的含量在标准范围内。

四、思考题

(1) Folin-酚法测定蛋白含量的原理是什么? (2) 有哪些因素会干扰Folin-酚法测定蛋白含量?

（四）考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度

一、原理

考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）测定蛋白浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465 nm变成595 nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law），因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2 min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1

29

h左右，因此测定过程快速，且不需要严格的时间控制。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5 g/mL时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10-100 g蛋白质，微量测定法测定范围是1-10 g蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

此方法干扰物少，研究表明：NaCl、KCl、MgCl2、乙醇、(NH4)2SO4不干扰测定。强碱性缓冲剂在测定中有一些颜色干扰，可以通过适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris、乙酸、-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA、微量的去污剂（如Triton X-100，SDS）和玻璃去污剂均有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

由于该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。

二、试剂和器材 2.1试剂

(1) 标准蛋白质溶液

结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白OD1cm=6.6测定蛋白质含量，再用0.15 mol/L NaCl或蒸馏水配制成1 mg/mL，0.1 mg/mL蛋白溶液。 (2) 考马斯亮蓝试剂

考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)磷酸。 2.2 待测样品

未知蛋白质溶液，要求蛋白浓度范围为0.1-5 mg/mL，若浓度过高时，需用0.15 mol/L NaCl溶液或蒸馏水适当稀释。 2.3 器材

(1) 722型分光光度计 (2) 微量进样器

(3) 移液管（0.1 mL及5 mL） (4) 试管及试管架

三、操作方法

3.1 标准法制作标准曲线

取14支试管，分两组按下表平行操作。

1%30

试管编号 标准蛋白含量(g) 1 mg/mL标准蛋白溶液(mL) 蒸馏水(mL) 考马斯亮蓝试剂(mL) 0 0 0 0.10 1 10 0.01 0.09 2 20 0.02 0.08 3 30 0.03 0.07 5 mL 4 40 0.04 0.06 5 50 0.05 0.05 6 60 0.06 0.04 摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色 OD595nm 以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 3.2 微量法制作标准曲线

取12支试管，分两组按下表平行操作。

试管篇号 标准蛋白含量(g) 0.1 mg/mL标准蛋白溶液(mL) 蒸馏水(mL) 考马斯亮蓝试剂(mL) 0 0 0 0.10 1 1 0.01 0.09 2 3 0.03 0.07 1 mL 3 5 0.05 0.05 4 7 0.07 0.03 5 9 0.09 0.01 摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595 nm处比色 OD595nm 以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 3.3 未知样品蛋白质浓度的测定

测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。 3.4 注意事项

(1) 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。

(2) 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

四、思考题

(1) 与其它测定蛋白质浓度的方法相比，考马斯亮蓝染色法测定有何优点？

（五）紫外分光光度法测定蛋白质浓度

一、原理

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（OD280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

31

利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）得到广泛应用。此法的缺点是：(1)对于测定那些与标准蛋白质酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。根据蛋白质和核酸的吸收高峰不同，并利用这一性质，通过计算可以适当校正核酸的干扰作用。

二、试剂和器材 2.1 试剂

(1) 标准蛋白溶液；准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，用重蒸水配制成浓度为1 mg/mL的溶液。

(2) 待测蛋白质样品溶液；用重蒸水适当稀释。 2.2 器材

(1) 752型紫外分光光度计 (2) 移液管 (3) 试管和试管架

三、操作方法 3.1 标准曲线法 3.1.1 标准曲线的绘制

取8支试管，按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。

试管编号 标准蛋白质溶液(mL) 蒸馏水(mL) 蛋白质浓度(mg/mL) OD280 1 0 4.0 0 2 0.5 3.5 0.125 3 1.0 3.0 0.250 4 1.5 2.5 0.500 5 2.0 2.0 0.500 6 2.5 1.5 0.625 7 3.0 1.0 0.750 8 4.0 0 1.00 选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm处分别测定各管溶液的OD280值。以蛋白质浓度为横坐标，OD280值为纵坐标，绘制标准曲线。

3.1.2 样品测定

取适当浓度的待测蛋白质溶液，同样选用光程为1cm的石英比色杯，测定280nm处的光吸收值，并从标准曲线上查出待测定蛋白质的浓度。 3.2 其它方法

(1) 将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm和280nm处分别测定出OD值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。

蛋白质浓度(mg/mL)=1.45 OD280 –0.74 OD260

32

式中OD280和OD260分别是蛋白质溶液在280nm和260nm波长下测得的光吸收值。

此外，也可先计算出的OD280/OD260比值后，从表3.1中查出校正因子“F”值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将“F”值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。

蛋白质浓度(mg/mL)=F××OD280×N

式中OD280为该溶液在280nm下测得的吸光值；d为石英比色杯的厚度(cm)；N为溶液的稀释倍数。 表1 紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子

280/260 1.75 1.63 1.52 1.40 1.36 1.30 1.25 1.16 1.09 1.03 0.979 0.939 0.874 核酸(%) 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 5.00 因子(F) 1.116 1.081 1.054 1.023 0.994 0.970 0.944 0.899 0.852 0.814 0.776 0.743 0.682 280/260 0.846 0.822 0.804 0.784 0.767 0.753 0.730 0.705 0.671 0.644 0.615 0.595 核酸(%) 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 9.00 10.00 12.00 14.00 17.00 20.00 因子(F) 0.656 0.632 0.607 0.585 0.565 0.545 0.508 0.478 0.422 0.377 0.322 0.278 1d注:一般纯蛋白质的光吸收比值(OD280/OD260)约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5

(2) 对于稀蛋白质溶液， 还可用215 nm和225 nm的吸收差来测定浓度。从吸收差△OD与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。

吸收差△OD= OD215 – OD225

式中的OD215和OD225分别是蛋白质溶液在215 nm和225 nm波长下测得的光吸收值。

此法当蛋白质含量在20-100 g/mL的范围内，是服从Beer定律的。氯化钠、硫酸铵以及0.1 mol/L磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。但是0.1 mol/L乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在215 nm波长下的吸收较大，不能应用，必须降至5 mmol/L才无显著影响。由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH的改变而出现高低变化，故采用紫外吸收法时要注意溶液的pH，最好与标准曲线制订时的pH一致。

(3) 如果已知某一蛋白质在280 nm波长处的吸收值OD1cm，则取该蛋白质溶液于280 nm处测定光吸收值后，便可直接求出蛋白质的浓度。 四、 思考题

(1) 简述紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理及优点。

1%33

实验九 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

一、目的

学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。 二、原理

带电质子在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。电泳现象早在19世纪初期就被人们发现了，并用于胶体化学中，但是电泳技术的广泛应用则在20世纪40年代左右。近年来各种类型的电泳技术发展十分迅速。例如，纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。在电泳形式上更是丰富多样，有在溶液中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，也有做成平板的或柱状的。由于与光学系统和自动分部收集器相结合，又组成了等电聚焦仪，等速电泳仪等等，大大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。

各种类型的电泳技术概括如表2：

表2 电泳技术的种类

类 别 名 称 1．Tiselleus式微量电泳 2．显微电泳 不用支持物的电泳技术 3．等电聚焦电泳 4．等速电泳 5．密度梯度电泳 1．纸上电泳 2．醋酸纤维薄膜电泳 3．薄层电泳 4．非凝胶支持物区带电泳 包括常压、高压电泳 （水平式或垂直式） 水平式事垂直式 属自由电泳 形 式 支持物有：淀粉、纤维素粉、玻璃粉、（平板法、柱状法） 硅胶、合成树脂粉末 用支持物的电泳技术 5．凝胶支持物区带电泳 （1）淀粉凝胶 （2）聚丙烯酰胺凝胶 1）圆盘电泳 2）平板电泳 3）SDS-圆盘电泳 （3）琼脂糖凝胶电泳 （4）琼脂凝胶电泳 用 法 1．双向电泳 垂直式（柱状法） 垂直式或水平式 垂直式（测相对分子质量） 平板法或柱状法（如免疫电泳） 34

2．电泳-层析相结合技术 3．交叉电泳法 4．连续纸电泳 任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。例如，氨基酸、蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。

不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度的定义是带电质点在单位电场强度下的泳动速度。即：

u=

vd/tdl==（cm2·V-1·s-1）(厘米2·伏特-1·秒-1) EV/lVt式中：u为泳动度（cm2·V-1·min-1）（厘米2·伏特-1分-1）；

v为质点的泳动速度（cm·s-1或cm·min-1）（厘米·秒-1或分-1）； E为电场强度（V·cm-1）（伏特·厘米-1）； d为质点泳动距离（cm）（厘米）； l为支持物的有效长度（cm）（厘米）； V为加在支持物两端的实际电压（V）（伏特）； t为通电时间（s或min）（秒或分）。

通过测量d、l、V、t便可计算出质点的泳动度。

泳动度首先取决于带电质点的性质，即质点所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。泳动度除受质点本身性质的影响外，还受其他外界因素的影响，如溶液的粘度等。影响泳动速度的主要外界因素还有下列几种：

（一）电场强度（电势梯度）

电场强度是指每cm的电压降，它对泳动速度起着十分重要的作用。例如，纸上电泳的支持物滤纸两端相距20cm，如电压降为200V，则电场强度为200V/20cm=10V·cm-1。电场强度越高，带电质点移动速度越快。根据电场强度的大小，可将电泳分为常压（100~500V）电泳和高压（500~10 000V）电泳。常压电泳的电场强度一般为2~10V·cm-1，电泳分离时间较长，需要几小时至几天；高压电泳的电场强度为20~200V·cm-1，电泳分离时间较短，有时仅需几分钟。常压电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，而高压电泳则用来分离氨基酸、小肽、核苷酸等小分子物质。在生产中有时需要进行快速的中间分析，如果没有高压电泳设备，可以把常压电泳小型化，缩短滤纸两端距离，也可达到高压快速的目的。如将原来两端相距20cm的滤纸改为5cm，外加电压仍为200V，电场强度则变为40V·cm-1，这样就加快了电泳速度。

35

（二）溶液的pH值

溶液的pH值决定带电质点解离的程度，也决定物质质点所带净电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，pH值距等电点越远，质点所带净电荷越多，泳动速度也越快；反之，则越慢。因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个合适的pH值，使各种蛋白质所带净电荷的量差异较大，以利于分离。为了使电泳过程中溶液的pH值恒定，必须采用缓冲溶液。

（三）溶液的离子强度

离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强度越低，质点泳动的速度越快。一般最适合的离子强度在0.02~0.2之间。

在稀溶液中，离子强度的计算方法，是将每一离子浓度乘以其价数的平方，再将所有乘积相加，以2除其和。计算公式如下：

离子强度（I）=

1∑CZ2 2式中：C为离子的摩尔浓度（mol·L-1）； Z为离子的价数。

例如：求0.015mol·L-1Na2SO4溶液的离子强度，则：

离子强度（I）=

1（0.015×2×12＋0.015×22）=0.045 2（四）电渗现象

液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。若质点原来向负极移动，则其表面速度比电泳速度快。若质点原来向正极移动，则其表面速度比电泳速度慢。

因此，在电泳时应尽量避免使用具有高电渗作用的支持物。 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。

本实验采用的醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜。醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少而无“拖尾”现象。快速省时、灵敏度高、样品用量少、操作简单，目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病，肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。

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三、试剂和器材 3.1 试剂

图3 不同pH条件下蛋白质分子在电场中运动状态示意图

(1) 巴比妥－巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07 mol/L)：称取巴比妥1.66 g和巴比妥钠12.76 g，溶于少量蒸馏水后定容至1000 mL。置4℃保存备用。

(2) 染色液：称取0.5 g氨基黑10B，加入蒸馏水40 mL，甲醇50 mL和冰醋酸10 mL混匀，在具塞试剂瓶内贮存。

(3) 透明液：冰醋酸25 mL加95%乙醇75 mL。

(4) 漂洗液：乙醇45 mL，冰醋酸5 mL，蒸馏水50 mL。 (5) 定量洗脱液（0.4 mol/L NaOH溶液） 3.2 测试样品：新鲜血清（无溶血现象） 3.3 器材

(1) 电泳仪和卧式电泳槽 (2) 722型分光光度计

(3) 醋酸纤维薄膜（2 cm  8 cm）和镊子或竹夹子 (4) 培养皿（直径9-10 cm）和点样的玻璃片； (5) 直尺和铅笔；普通滤纸；单面刀片；电吹风 (6) 试管和试管架。

四、操作方法 1.仪器和薄膜的准备

(1) 醋酸纤维薄膜的剪裁和准备

醋酸纤维薄膜分成有光泽面和无光泽面两面，选择无光泽一面，距离边沿1.5 cm处划一条直线，然后把薄膜剪成2 cm  8 cm，将裁好的薄膜无光泽面朝下，漂浮于巴比妥缓冲液上，若漂浮的薄膜在15-30 sec内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，可以用于电泳。让膜自然下沉，待膜完全浸透（约0.5 h）后取出，夹在清洁的滤纸中间轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨光泽面和无光泽面。 (2) 制作滤纸桥

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剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层附着在电泳槽的支架上。使它的一端与支架的前沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液内，然后用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。 (3) 平衡

用平衡装置（或自制的平衡管），使两个电极槽内缓冲液的液面彼此处于水平状态，一般需要平衡15-20 min。注意，平衡后须将平衡装置的活塞关好(或除去平衡管)。 2. 点样

在薄膜无光泽的一面点样。点样在距负极端1.5 cm处（如图4）。点样时，用玻璃片沾上血清，先在滤纸上练习点样，使血清均匀分布在点样区，形成具有一定宽度，粗细匀称的直线，试点熟练之后，开始点在醋酸纤维薄膜上。此步是实验的关键。

图4 醋酸纤维薄膜规格及点样位置示意图

虚线处为点样位置

3. 电泳

用镊子将点样端的薄膜平贴在电泳槽负极支架的“滤纸桥”上（无光泽点样面朝下），另一端平贴于正极，如图5所示。薄膜要紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。

图5 电泳装置剖视示意图

1. 滤纸桥 2. 电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4. 电泳槽膜支架 5.电极室中央隔板

1 如果一个电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，让薄膜平衡10 min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。打开电源开关，调节使每厘米膜宽电流强度为0.3 mA（8片薄膜则为4.8 mA）。通电10-15 min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5 mA（8片共8 mA），电泳时间约50-70 min。电泳结束后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源。 4. 染色

电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5 min，取出后用漂洗液浸洗脱色，每隔10 min

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左右换一次漂洗液，连续更换三次，可使背景颜色脱去，将膜夹于干净的滤纸中，用电吹风的冷风将薄膜吹干。操作中，要注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。 5. 结果判断

一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带（图6）。从正极端起，依次为清蛋白，1球蛋白、2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。

清蛋白 1- 2- - -球蛋白 原点

图6 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱

6. 透明

取一条漂洗清楚的电泳薄膜，待干燥后浸入透明液中约5 min，取出平贴于玻璃板上，使完全干燥，即成透明膜，电泳图谱仍清晰可见，可以长期保存。 7. 定量洗脱法

用洗脱法测定各蛋白质组分的相对百分含量。将电泳图谱（未经透明处理）的各区带剪下，分别浸于盛有0.4 mol/L氢氧化钠溶液的试管中，清蛋白管加入4 mL氢氧化钠溶液，其余每管加2 mL氢氧化钠溶液，摇匀，放入37℃恒温水浴中浸提30 min，每隔10 min充分摇动一次，以便将色泽完全洗脱下来。该溶液颜色较稳定，在室温下24 h内颜色强度无显著变化，然后在620nm波长处比色，测定各管的光吸收值分别为ODA、ODα1、ODα2、ODβ、ODγ。按下列方法计算血清各部分蛋白质所占百分率。

先计算光吸收值总和（简称为T） T=2×ODA+ODα1+ODα2+ODβ+ODγ

再计算血清各部分蛋白质所占百分率(即相对百分含量)。 计算公式 正常值

清蛋白%=

2ODA100 54-73% T α1球蛋白%＝

ODα1TODα2T100 2.78-5.10% 100 6.3-10.6%

α2球蛋白%=

β球蛋白%=

ODβ100 5.2-11.0% Tγ球蛋白%=

五、注意事项

ODγ100 12.5-20.0% T39

(1) 点样好坏是本实验的关键。点样时应将薄膜表面多余的缓冲液吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干样品不易进入薄膜的网孔内，造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。

(2) 点样量不能过大，否则各蛋白区带易拖尾，分离效果不好。点样量应在0.1–5 L范围内为宜。

六、思考题

(1) 简述醋酸纤维薄膜电泳的原理及优点。(2) 点样端为何放在负极？ (3) 实验中应注意哪些事项？

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实验十 影响酶活性的因素

一、实验目的

观察淀粉在水解过程中遇碘后溶液颜色的变化。观察温度、pH、激活剂与抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响。

二、实验原理

人唾液中淀粉酶为α-淀粉酶，在唾液腺细胞内合成。在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，经过一系列被称为糊精的中间产物，最后生成麦芽糖和葡萄糖。变化过程如下：

淀粉→紫色糊精→红色糊精→麦牙糖、葡萄糖

淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分别呈蓝色、紫色与红色。麦芽糖和葡萄糖遇碘不变色。 淀粉与糊精无还原性，或还原性很弱，对本尼迪克特试剂呈阴性反应。麦芽糖、葡萄糖是还原糖，与本尼迪克特试剂共热后生成红棕色氧化亚铜的沉淀。

唾液淀粉酶的最适温度为37-40 ℃，最适pH为6.8。偏离此最适环境时，酶的活性减弱。 低浓度的Cl离子能增加淀粉酶的活性，是它的激活剂。Cu2+等金属离子能降低该酶的活性，是它的抑制剂。

三、器材及试剂 1．器材：

试管、烧杯、量筒、恒温水浴锅、试管夹、试管架 2．试剂：

(1) 唾液淀粉酶液：实验者先用蒸馏水嗽口，然后含一口蒸馏水于口中，轻嗽一、二分钟，吐入小烧杯中，用滤纸过滤，除去稀释液中可能含有的食物残渣。并将该滤液稀释一倍。

(2) 0.5 %淀粉溶液（含0.3%NaCl）；将0.5 g可溶性淀粉与0.3 g氯化钠，混悬于5 mL的蒸馏水中，搅动后缓慢倒入沸腾的95 mL蒸馏水中，煮沸1分钟，冷却后倒入试剂瓶中。

(3) 碘液：称取2 g碘化钾溶于5 mL蒸馏水中。再加1 g碘。待碘完全溶解后，加蒸馏水295 mL，混合均匀后贮于棕色瓶内。

(4) 本尼迪克特（Benedict）试剂：将17.3 g硫酸铜晶体溶入100 mL蒸馏水中，然后加入100 mL蒸馏水。取柠檬酸钠173 g及碳酸钠100 g，加蒸馏水600 mL，加热使之溶解。冷却后，再加蒸馏水200 mL，最后，把硫酸酮溶液缓慢地倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤除去或自然沉降一段时间取上清液。此试剂可长期保存。 (5) 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液 (6) 0.1 mol/L柠檬酸溶液 (7) 1% NaCl溶液

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(8) 1% CuSO4溶液 (9) 0.5% 淀粉溶液 (10) 2% 蔗糖溶液

四、操作步骤： 1．淀粉酶活性的检测：

取一支试管，注入0.5 %淀粉溶液5 mL与稀释的唾液0.5~2 mL。混匀后插入1支玻棒，将试管连同玻棒置于37 ℃水浴中。不时地用玻棒从试管中取出1滴溶液，滴加在白磁板上，随即加1滴碘液，观察溶液呈现的颜色。此实验延续至溶液仅表现碘被稀释后的微黄色为止。记录淀粉在水解过程中，遇碘后溶液颜色的变化。

向上面试管的剩余溶液中加2 mL本尼迪克特（Benedict）试剂，放入沸水中加热10分钟左右，观察有何现象？为什么？ 2. 酶的特异性

酶的特异性是指一种酶只能对一种或一类化合物（此类化合物通常具有相同的化学键）起作用，而不能对别的化合物起作用。如淀粉酶只能催化淀粉水解，对蔗糖的水解无催化作用。

本实验以唾液淀粉酶（含淀粉酶和少量麦芽糖酶）对淀粉的作用为例，说明酶的特异性。淀粉和蔗糖都没有还原性，但淀粉水解产物为葡萄糖，蔗糖水解产物为果糖和葡萄糖，均为还原性糖，能与Benedict试剂反应，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。 (1) 检查试剂

取2只试管，按下表操作。

试剂 剂 管 1 号 2 — 3 2 含0.3％NaCl淀粉溶液/mL 2%蔗糖溶液/mL Benedict试剂/mL 3 — 2 摇匀，沸水浴煮沸2～3min 观察结果 (2)

淀粉酶的专一性实验

取2只试管，按下表操作。

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试剂 剂 管 号 1 1 3 － 摇匀，置37℃水浴保温10min 2 1 － 3 稀释的唾液/mL 含0.3％NaCl淀粉溶液/mL 2% 蔗糖溶液/mL Benedict试剂/mL 2 2 摇匀，沸水浴煮沸2～3min 观察结果

3. pH对酶活性的影响：

酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性，酶活性最高时的pH，称为酶的最适pH，高于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。不同酶的最适pH不同。酶的最适pH不是一个特征性的物理常数，对于一个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。

（1）取3支50 mL锥形瓶，按下表的比例，制备不同浓度的缓冲液：

锥形瓶号 1 2 3 0.2mol/L磷酸氢二钠/mL 5.15 7.72 9.72 0.1M柠檬酸/mL 4.85 2.28 0.28 缓冲液pH 5.0 6.8 8.0 （2）取三支试管，照如下操作： 管 试剂 号 1 2 — — 1 2 — 2 — 1 3 — — 2 1 pH 5.0缓冲液/mL pH 6.8缓冲液/mL pH 8.0缓冲液/mL 含0.3％NaCl0.5%淀粉溶液/mL 以1分钟的间隔，依次加入稀释的唾液1 mL，摇匀 充分摇匀，置37 ℃水浴保温10 min，到达保温时间后，每隔1 min依次取出 KI-I2溶液/滴 观察结果 2 2 2 43

综合以上结果，说明pH对酶活性的影响。 4．温度对酶活性的影响：

对温度敏感是酶的一个重要特性，酶作为生物催化剂，和一般催化剂一样呈现出温度效应，提高温度可以提高酶促反应速度，但另一方面又会加速酶蛋白的变性速度，所以在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。酶反应速度达到最大时的温度称为酶的最适温度。酶的最适温度不是一个常数，它与作用时间的长短有关系。

取3支试管，各加3 mL含0.3 ％NaCl的0.5 %淀粉溶液；另取3支试管，各加1mL淀粉酶液。将此6支试管分为三组，每组中盛淀粉溶液与淀粉酶液的试管各1支，三组试管分别置入0 ℃、37 ℃与100 ℃的水浴中。5分钟后，将各组中的淀粉溶液倒入淀粉酶液中，继续维持原温度条件5 min后，立即滴加2滴碘液，观察溶液颜色的变化。根据观察结果说明温度对酶活性的影响。

5．激活剂与抑制剂对酶活性的影响：

酶的活性受某些物质的影响，能使酶活性增加的称为激活剂，能使酶活性降低的称为抑制剂。很少量的激活剂和抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性，但激活剂和抑制剂不是绝对的，浓度的改变可能使激活剂变成抑制剂。

取3支试管，按下表加入各种试剂。混匀后，置于37 ℃水浴中的保温。从1号试管中用玻棒取．．．．出1滴溶液，置于白磁板上用碘液检查淀粉的水解程度。待1号试管内的溶液遇碘不再变色后，立．．．．．即取出所有的试管，各加碘液2滴，观察溶液颜色的变化，并解释之。 ． 试剂 管 号 1 1 — — 3 1 2 3 1 %NaCl溶液/mL 0.1 %CuSO4溶液/mL 蒸馏水 0.5 %淀粉溶液/mL 稀释的唾液/mL — 1 — 3 1 — — 1 3 1 摇匀，放入37℃恒温水浴中保温10～15 min，取出，冷却 KI-I2溶液/滴 观察结果

五、思考题

（1）本实验中如何通过淀粉液加碘后的颜色的变化来判断酶促反应快慢的？ （2）如何通过加入班氏试剂后生成沉淀多少来反映酶促反应快慢的？

（3）通过本实验，结合理论课的学习，小结出哪些因素影响唾液淀粉酶活性？是如何影响的？

2滴 2滴 2滴 44

实验十一 碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定

一、目的要求：

1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤

2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活测定的方法 二、原理

碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase) 广泛存在于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中，ALPase起了极其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适pH在碱性区域，一般在pH9.0-10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活作用。

在酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作中特别注意以下几点：

(1) 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量高的材料，并要考虑到由于所选用材料的动植物种属及其组织的不同，提取的方法也有差异。

(2) 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。在用硫酸铵沉淀酶蛋白时，要注意缓冲液的pH值和温度，盐的溶解度随温度不同而有较大的变化，同时酶的溶解度亦随温度的改变而改变。

(3) 盐析生成的沉淀，要静置20 min以上，使其沉淀完全，再进行分离。可采用离心方法将沉淀物分离出来。

(4) 在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。

(5) 有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯，但是选用的有机溶剂要满足以下几个条件：能与水完全混溶；不与蛋白质发生反应；有较好的沉淀效应；溶剂蒸气无毒，且不易燃。因此，丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。

(6) 在室温下有机溶剂能使大多数酶失活，因此要注意分离提纯实验必须在低温下进行。有机溶剂应预先冷却，操作时注意慢慢加，并充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。析出的沉淀容易在离心时沉降，因此可采用短时间的离心以析出沉淀 ，而且最好立即将沉淀溶于适量的冷水或缓冲液中，以避免酶活力的丧失。

(7) 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，

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提纯步骤才有效。

酶活力的分析：通常是以对-硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在pH 10.1的碳酸盐缓冲液（含2 mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚（pNP）的量。产物pNP在405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405 值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为：在37℃下，以1 mmol/L pNPP为底物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。

蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（Folin-Phenol reagent）显色或双缩脲法。

三、试剂和器材 1. 试剂

(1) 含0.1 mol/L NaCl的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷 (Tris =121.4) 1.214 g, NaCl 5.8 g, 溶于蒸馏水中，加入80 mL 0.1 mol/L HCl, 用蒸馏水定容到1000 mL。 (2) 硫酸铵（分析纯）

(3) 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3 pH10.1缓冲液 分别取(A)液70 mL, (B)液30 mL混匀，用酸度计准确调节pH=10.1。

(A) 0.1 mol/L Na2CO3溶液 取28.6 g Na2CO3·10H2O溶于1000 mL蒸馏水中。 (B) 0.1 mol/L NaHCO3溶液 取8.4 g NaHCO3 溶于1000 mL蒸馏水中。 (4) 20 mmol/L MgCl2：称取1.904 g MgCl2 溶于1000mL蒸馏水中。

(5) 0.5 mol/mL 对硝基苯酚 (pNP＝141.1) 溶液：精确称取17.64 mg 对硝基苯酚，用蒸馏水溶解并定容至250 mL。

(6) 5 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠 (pNPP)：称取371.2 mg pNPP溶于100 mL蒸馏水中。 (7) 0.2 mol/L NaOH：称取4 g NaOH 溶于1000 mL蒸馏水中。 (8) 0.5% NaCl 称取5 g NaCl 溶于1000 mL蒸馏水中。

(9) 0.5 mol/mL 对硝基苯酚 (pNP＝141.1) 溶液：精确称取17.64 mg 对硝基苯酚，用蒸馏水溶解并定容至250 mL。 (10) 正丁醇

(11) 双缩脲试剂参考蛋白质含量测定实验 2. 器材

(1) 高速组织捣碎机 (2) 离心机 (3) 超级恒温水浴锅 (4) 酸度计

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(5) 722分光光度计 (6) 天平、台秤 (7) 透析袋 (8) 磁力搅拌器 (9) 冰箱 (10) 秒表

(11) 50 L 微量进样器 3．材料 新鲜牡蛎

四、操作方法

1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取

(1) 称取100 g牡蛎（蒸馏水洗净），加入150 mL预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5，含0.1 mol/L NaCl），于高速组织捣碎机匀浆1 min，量匀浆液体积，于冰箱4℃放置1 h进行抽取。（留匀浆液10 mL，采用离心或过滤，得到上清液，待测酶的比活力） (2) 缓慢加入20％（v/v）冰冷的正丁醇，边加边搅拌均匀。冰箱放置1－2 h。

(3) 室温离心，4000 r/m 30 min，收集离心上清液，并量体积。（留5 mL上清液，对含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液pH 7.5透析平衡，待测酶的比活力。）

(4) 在正丁醇处理的上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。

(5) 室温离心，4000 r/m 30 min，收集离心上清液，并量体积。（留5 mL上清液，对0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液pH 7.5含0.1 mol/L NaCl 透析平衡，待测酶的比活力。）

(6) 0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 (7) 室温离心，4000 r/m 30 min，收集沉淀物。

(8) 得到沉淀物，溶于20 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透析袋，对预冷的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5（常换透析液），至无SO42-被检测出为止（可用一定浓度BaCl2溶液检验）。

(9) 取出酶溶液，冷冻高速离心（0℃ 25000 r/m 30 min）。

(10) 离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入棕色瓶于4℃冰箱保存。

2. 比活力测定

2.1 对硝基苯酚标准曲线的制作

取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作：

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管 号 pNP含量 (mol) 0.5mol/mL pNP (mL) H2O (mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) 0.2 mol/L NaOH (mL) OD 405 nm

0 0 0 0.8 1 0.05 0.1 0.7 2 0.10 0.2 0.6 3 0.15 0.3 0.5 4 0.20 0.4 0.4 5 0.25 0.5 0.3 6 0.30 0.6 0.2 7 0.35 0.7 0.1 各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各管加入2.0 mL 以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。

2.2 酶活力的测定

取干净的试管12支，编号，1－4号各2支，作为各步的酶样测定管；01－04各一支，作为相应的样品对照；各管按下表加入各溶液，于37℃恒温水浴中预热5 min， 1－4号管分别加入各步酶样100 L，精确反应10 min， 各管加入2 mL 0.2 mol/L NaOH 终止反应并显色，01-04号管先加入NaOH后再分别补加对应的酶液100 L。以01号管调零点，于722分光光度计测定1号管的OD405值，同样分别以02－04号管调零点，于722分光光度计分别测定对应测定管的OD405值，从对照标准曲线求出产物的浓度，算出酶活力。

No. 5 mM pNPP(mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL) 酶液（mL） 0.2 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） 1 2 各0.2mL 各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各0.50mL 混匀，37℃，5分钟 测定管分别加入0.1mL酶液 37℃，精确反应10分钟 各管加入2.0 mL 01-04管分别加入各步酶液0.1mL 3 4 分别以01－04号管调零点，于722分光光度计测定对应测定管的OD405值

2.3 蛋白浓度的测定（双缩脲法）

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上述分离提取的四步酶制剂按一定比例用Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定。

取干净的试管9支，编号，0号一支作为空白试验，加入3.0mL Tris-HCl缓冲液pH 7.5；1－4号各两支，作为各步的酶样测定，各管加入相应的已稀释的酶液3 mL；各管加入双缩脲试剂3 mL，混匀，37 ℃放置30 min。以0号管调零点，于722分光光度计测定各管的OD540nm值，从对照标准曲线求出各样品的蛋白浓度。

3. 结果处理

计算：

Enzyme Activity (U/mL)=BtV1CAV2Protein Concentration (mg/mL) =式中：A稀释倍数，B为由标准曲线求出的pNP mol数（或者通过摩尔消光系数计算出pNP mol数）， C为由标准曲线查得的蛋白mg数，t为反应时间，V1为测定酶活力所用的酶量(mL数)，V2为测定蛋白浓度所用的酶量(mL数)

酶活力（U/mL）

酶的比活力（U/mg）＝

蛋白浓度（mg/mL） 将测定的数据或计算结果填入下表：

步骤 匀浆过滤液 正丁醇处理上清液 0.35饱和(NH4)2SO4上清液 0.7饱和(NH4)2SO4沉淀 溶解透析上清液 DEAE-32酶液 Sephadex G75酶液 Sephadex G200酶液

纯化倍数=各步比活力/第一步比活力 得率%=各步总活力*100/第一步总活力

总体积 蛋白 总蛋白 酶活力 总活力 比活力 纯化 得率 mL mg/mL mg U/mL U U/mg 倍数 % 49

五、注意事项

（1）在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。

（2）测活时可以将待测定的试管置于试管架放入水浴锅中预热及反应。

六、思考题：

(1) 试说明用硫酸铵分级分离酶的方法及应注意的事件。

(2) 用正丁醇处理匀浆液可以有效地使碱性磷酸酶酶蛋白释放，使酶的产量大大提高，这是为什么？ (3) 酶活力测定时，为什么必需先将酶液对缓冲液透析后才测定？

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实验十二 凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶

一、目的要求

1. 学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。 2. 通过凝胶过滤柱层析对碱性磷酸酶进行纯化。 二、原理

该法又称为分子排阻色谱(molecularexclusion chromatography)，分子筛色谱(molec—ularsievechromatography)。它所用的载体为一定孔径的多孔性亲水性凝胶。这种凝胶具有网状结构，其交联度或网孔大小决定了凝胶的分级范围。当把这种凝胶装入一根细的玻璃管中，使不同蛋白质的混合溶液从柱顶流下，由于网孔大小的影响，对不同大小的蛋白质分子将产生不同的排阻现象。比网孔大的蛋白质分子不能进入网孔内而被排阻在凝胶颗粒周围，先随着溶液往下流动；比网孔小的蛋白质分子可进入网孔内，造成在柱内保留时间长。由于不同的蛋白质分子大小不同，进入网孔的程度不同，因此流出的速度不同，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到分离目的(图7)。

在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积称为外水体积V。，不能进人凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi，能全部进入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。＋Vi时出现洗脱峰，介于其间的分子将在洗脱体积为V。＋Ve时，出现洗脱峰（图8）。

图7 凝胶层析原理

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凝胶的种类

用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酸胺和琼脂糖。

1. 交联葡聚糖凝胶：交联葡聚糖商品名为Sephadex，它的原料是细菌分泌的链状葡聚糖。通过交联剂交联而成。交联剂添加越多，孔径越小，吸水量也就越小；反之越大。商品Sephadex以 G值表示不同交联度，G值越大，空穴也越大，G后边的数字表示每克干胶膨时吸水量的10倍，G-25表示每克干胶可吸附2.5g水。

2. 聚丙烯酸胺凝胶：聚丙烯酸胺凝胶是丙烯酸胺和N，N’一次甲基二丙烯酸胺聚合而成。这种凝胶的商品名为 Bio－gel P。其孔穴大小也是随交联增多而减少，并用 P值表示不同的交联度，P值越大，孔径也越大。

3. 琼脂糖凝胶：琼脂糖是从海藻琼脂中分离除去琼脂胶后的中性级分。它是D一半乳糖和脱水L一半乳糖相间重复结合而成的链状化合物。琼脂糖的商品名为 Sepharose或 Bio－gel。琼脂糖凝胶，其机械强度都比葡聚糖凝胶和聚丙烯酸胺凝胶好得多，同时它对生物大分子等高分子的吸附作用也小得多。另外，琼脂糖凝胶适用相对分子质量的范围宽，最大可以到108，这一点是另外两种凝胶所无法达到的。

4. Sephacryl凝胶：Sephacryl是由丙烯基葡聚糖和N，N’一甲叉双丙烯酸胺共价交联而成的硬凝胶。其类型有 Sephacryl－100，S－200，S－300，S－400和 S－500几种，它们都是超细颗粒。Sephacryl在常用溶剂（除化学去垢剂外）中不溶解，稳定性很高。

5. Superdex凝胶：Superdex是最新的凝胶填料，它是将葡聚糖以共价方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。琼脂糖的高交联骨架为珠体提供了较高的物理化学性质，葡聚糖为介质提供了优良的选择性。这类凝胶物理化学性质稳定，刚度强，适合于高流速，且分辨率高。

凝胶柱层析的使用方法

图8 凝胶层析柱洗脱的示意图

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1．凝胶的选择

（1）粒子的大小与孔径选择 凝胶粒子必须分散均匀，能够较快的扩散以及有效地分离。高分子物质必须能够扩散到凝胶内才能起到分子筛的效应，不同型号的凝胶皆有各自的排阻极限。 （2）凝胶必须是惰性的 任何带电荷的凝胶，或对分离物质有亲和力者，都将干扰分离效果。

2．色谱柱装置（图9） 色谱柱的规格要根据分离样品的性质和目的来定。最常用的是内径2.5 cm（2～4cm）。长度为 100 cm（40～100 cm）的玻璃柱。

3．凝胶的处理 为了获得合适的流速和良好的分离，凝胶粒子在使用前需经一定处理，主

要是将凝胶的保存液更换到分离蛋白质的洗脱液中，对于Sephadex系列凝胶在使用前需充分的膨胀与浮选。

4．装柱 取适当长度的色谱柱，底部铺上尼龙筛网或玻璃丝，以不漏粒子为准。

用缓冲液（如 PBS）饱和凝胶粒子，置室温 lh后上柱。气体在低温时易溶于溶液中，室温时易释放出来，也可用超声脱气将气泡赶走。分离时气泡的溢出将干扰分离效果，破坏柱内填料的结构，应予以避免，故样品不宜从冰箱中取出就立即上柱。

自顶端倾注凝胶悬浮液时，应沿直插到管底的玻璃棒缓缓流人，以免产生气泡与漏出粒子。为了防止分层，最好将凝胶悬液放于贮液瓶中，连续加入。

5．柱填充的检查和V。的测定 检查柱子填充是否正确的最好方法是用此柱分离某些有色物质。蓝色葡聚糖一2000是常用的一种物质，它是一种高分子葡聚糖，含有蓝色发色基因，因此可在一次操作中检查柱子的填充状况和测定出滞留容量V。。方法为把0.2％的蓝色葡聚糖一2000溶液（l／50～1／100柱床体积）加到柱子上，洗脱液的离子强度应为0．02或更高。如果用蓝色葡聚精进行实验后获得了一个不好的色谱带，那么就说明凝胶床没有填好。在这种情况下，柱子必须重新装填。 6．加样 在加样时，为了不扰乱凝胶表面，可在顶部放上一层圆形滤纸或尼龙网。样品要有一定的浓度和体积。通常为床柱体积的1％一 10％，浓度不宜超过 1％～4％。 7．洗脱

洗脱剂：洗脱剂多采用低离子强度的盐溶液。

图9 层析柱

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流速：各种类型凝胶对流速要求不一。 8．再生

样品洗脱完毕后．凝胶柱即已再生。一次装柱，可反复使用多次。因此操作简便，重复性高。 9．保存 各型凝胶悬液加防腐剂或灭菌后，可置冰箱保存数月。防腐剂类型很多，最常用的有叠氮化钠0．02％与0.002%洗必泰等，也可用高压蒸汽 0.1MPa30min灭菌。

三、试剂与器材 试剂：

（1）Sephadex G100

（2）0.01mol/l Tris-HCl缓冲液，pH 7.5，含0.1mol/l NaCl：称取三羟甲基氨基甲烷 (Tris =121.4) 1.214 g, NaCl 5.8 g, 溶于蒸馏水中，加入80 mL 0.1 mol/L HCl， 用蒸馏水定容到1000 mL。 （3）蛋白浓度测定试剂 参考蛋白质含量测定实验 （4）测定碱性磷酸酶活力试剂 参考实验十一 （5）牡蛎碱性磷酸酶粗酶液 实验十一制备

器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检测仪、记录仪、恒温水浴锅

四、操作方法

（一）凝胶的选择与处理 1.凝胶及柱的选择

根据待分离蛋白质的分子量选择Sephadex G100。选用1.5 cm×40 cm的柱子。 2.凝胶的处理

凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 （二）装柱

1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。

2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3 cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约3-5 cm处时停止装柱，关闭出水口。 （三）凝胶柱的平衡

通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。 （四）加样

1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪

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2. 打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将碱性磷酸酶粗酶溶液1 mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次。最后在凝胶上方加满洗脱液，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连（图10）。 （五）洗脱

洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.010 mol/LTris-HCl， 以每管3 mL/10 min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。 (六）碱性磷酸酶活力峰收集

对部分收集器收集的洗脱液进行碱性磷酸酶活力测定，做出碱 性磷酸酶的洗脱图谱，收集碱性磷酸酶活力峰，即为经凝胶过 滤柱层析纯化的洗脱液。对合并后的碱性磷酸酶活力峰进行酶 活和蛋白浓度的测定，即可得到其比活力。

五、注意事项

1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成 漏气、漏液。

2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下 装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。

3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。 也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流 动。

六、思考题

（1）在本实验中要注意哪些重要环节？

图10 层析系统连接示意图

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实验十三 DEAE-纤维素柱层析纯化碱性磷酸酶

一、目的要求

1. 学习和掌握离子交换柱层析分离蛋白质的原理与方法。 2. 通过离子交换柱层析对碱性磷酸酶进行纯化。 二、原理

二乙氨基四乙基纤维素（简称DEAE-纤维素）是一种弱碱性阳离子交换剂，其活性基团DEAE的解离常数pK值为9.5－10.5，在pH7.5缓冲液中带正电荷。带阴离子的蛋白质（等电点pI小于7.0）能被交换上去。在某一特定pH溶液中，由于蛋白质的等电点不同，它们所带的净电荷数也不同，与DEAE-纤维素的亲和力也就不一样。带正电荷的蛋白质不能被交换，可随洗脱缓冲液流过层析柱而完全被排阻（此类蛋白质不能被分离）。带负电荷的蛋白质可以被交换，由于不同的蛋白质所带的净电荷量不同，与DEAE的结合能力就不同。可以通过改变洗脱液的酸碱度或盐浓度梯度，削弱其结合能力，把结合的蛋白质分别洗脱下来，达到纯化的目的。

三、试剂与器材 1. 试剂

(1) DEAE-纤维素（DE-32）

(2) 0.5 mol/L NaOH (3) 0.5 mol/L HCl

(4) 0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液pH 7.5 取0.2 mol/L Tris溶液50 mL与0.5 mol/L HCl溶液16 mL混合，加入蒸馏水，酸度计调pH为7.5，稀释定容到1000 mL。 (5) 含0.5 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液pH 7.5 (6) 蛋白浓度测定试剂 参考蛋白质含量测定实验

(7) 测定碱性磷酸酶活力试剂 参考实验十一（底物浓度为2 mmol/L pNPP) (8) 0.2 mol/L NaOH

(9) 牡蛎碱性磷酸酶粗酶液 实验十一制备 2. 器材 （1）层析柱 （3）梯度洗脱仪 （5）记录仪 （7）超级恒温水浴锅 （9）移液器

四、操作方法

（一）DEAE-纤维素的预处理

（2）自动部分收集器 （4）核酸蛋白质检测仪 （6）722分光光度计 （8）酸度计

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称取一定量的DEAE-纤维素粉，用蒸馏水浸泡2－4 h，进行浮选，倒去上层水相，加入蒸馏水洗净。用真空泵抽干后，与0.5 mol/L HCl溶液浸泡洗涤0.5 h，抽干，用大量的蒸馏水洗涤到中性；再用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡洗涤0.5 h，抽干，用大量的蒸馏水洗涤到中性；最后用0.5 mol/L HCl溶液浸泡0.5 h，进行改型，抽干，用大量的蒸馏水洗涤到中性；再用0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液pH 7.5洗涤数次，洗至恒定pH，平衡到pH 7.5，浸泡在0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液pH 7.5溶液中，置冰箱备用。 （二）装柱

选择适当大小的玻璃层析柱，洗净，垂直安装在架上，夹紧下流口。加入少量0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液（注意柱的下端必须充满液体，不得有气泡），然后缓慢加入已处理好的DEAE-纤维素溶液，打开出口，流速控制在0.5－1.0 mL/min，逐步补充加入DEAE-纤维素溶液直至离上端约2 cm。接上0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液洗脱瓶，让其平衡2－5 h以上。 （三）准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 （四）样品上柱

夹紧下端出口，取去上端平衡缓冲液，用滴管吸走柱的上端的缓冲液，留下一层约1 mm液层铺盖DEAE-纤维素柱床表面。小心加入牡蛎碱性磷酸酶粗酶样品（注意不要搅动柱床表面），打开下出口，流速控制在0.2 mL/min，使酶样品吸附在纤维素柱上。 （五）洗脱

吸附完毕，接上0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液洗脱瓶，让其淋洗约2－3倍的柱床体积的缓冲液，流速控制在0.3 mL/min，除去不吸附的杂蛋白。然后接上梯度洗脱仪，NaCl的浓度梯度选择在0－0.5 mol/L，洗脱瓶装50 mL 0.01mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液，储备瓶装50 mL含0.5 mol/L NaCl的0.01mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液。洗脱瓶和储备瓶应放置水平，在洗脱瓶内磁力搅拌，使洗脱液的NaCl由储备瓶流向洗脱瓶时，能及时混匀。洗脱液的流速控制在0.3 mL/min左右，部分收集器收集，每管3 mL。 (六）碱性磷酸酶活力峰收集

分别对部分收集器收集的洗脱液进行碱性磷酸酶活力及蛋白浓度的测定。

五、结果处理

将测定结果记录，并加以计算，绘制洗脱图谱，即每管的酶活力和蛋白质浓度与管号（洗脱体积）的关系图。从洗脱图可以找出碱性磷酸酶的活力峰，合并活力峰，测定合并液的酶活力与蛋白质浓度，计算总活力和比活力。分析柱的层析效果，说明过柱层析后的酶的得率及提纯倍数。 五、思考题：

(1) 阐明DEAE-纤维素纯化酶蛋白的原理和方法。 (2) 实验时应如何选择缓冲液？应考虑那些因素？

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实验十四 底物浓度对酶活力的影响（米氏常数的测定）

一、目的要求

1. 学习分光光度法测定的原理和方法

2. 学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。 二、原理

酶的底物浓度与酶促反应速度的关系一般情况下符合米氏（Michaelis-Menten）理论。根据中间产物学说，酶促反应的动力学模型可以表示为：

E + Sk1 ESk-1k2E + P

这里，E、S、ES和P分别表示酶、底物、酶底物中间物和产物；k1、k-1、k2是各步反应的速度常数。按照中间产物学说，可以推导出米氏方程为：

vVm[S]Km[S]

式中：[S]为底物浓度（克分子浓度）；v为初速度（微克分子浓度变化/ min）；Vm为最大反应速度（微克分子浓度变化/ min）；Km 为米氏常数（克分子浓度）。

测定Km和Vm，特别是测定Km是酶学工作的基本内容之一。在酶动力学性质的分析中，米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。Km数值越小，说明酶和底物的亲和力越强；反之，Km值越大，酶和底物的亲和力越弱。

测定Km和Vm，可通过作图法求得。作图方法很多，其共同的特点是先将米氏双曲线方程式转变为一般的直线形式。本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸水解的Km和Vm，采用最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：

1Km11vVm[S]Vm由此即可求Km和Vm值。

然后以1/v对1/[S]作图，可得一条直线（见图11），直线的纵轴上的截距为1/Vm，横轴截距为 -1/Km，

本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm。 反应式：pNPP+H2O pNP+HPO42-

黄色 无色

可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。

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1/v 1/Vm

－1/Km 0 1/[S] 图11 Lineweaver-Burk 双倒数作图 三、 试剂与器材 试剂：

(1) 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3 pH10.1缓冲液 (2) 20 mmol/L MgCl2

(3) 10 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠(pNPP) (4) 0.2 mol/L NaOH (5) 碱性磷酸酶

器材：超级恒温水浴锅、秒表、可调微量取液器、722分光光度计

四、操作方法

1．对硝基苯酚标准曲线的制作

取15支试管编号，0号一支，1－7号各二支，按下列表格操作：

管 号 pNP含量 (mol) 0.5mol/mL pNP (mL) H2O (mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) 0.2 mol/L NaOH (mL) OD 405 nm 0 0 0 0.8 1 0.05 0.1 0.7 2 0.10 0.2 0.6 3 0.15 0.3 0.5 4 0.20 0.4 0.4 5 0.25 0.5 0.3 6 0.30 0.6 0.2 7 0.35 0.7 0.1 各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各管加入2.0 mL 以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。

2. 活力测定

取18支试管，编号。1－6号为测定管各为2支，作平行实验。1′－6′为对应底物浓度的对照管，按下表操作，对照管先加NaOH终止剂后补加酶液。

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No. 1 2 0.60 0.12 0.58 3 0.75 0.15 0.55 4 1.0 0.2 0.5 5 1.5 0.3 0.4 6 3.0 0.6 0.1 底物浓度[S](mmol/L) 0.50 10mmol/L pNPP(mL) 重蒸水（mL） Na2CO3-NaHCO3(mL) MgCl2(mL) 预热 ALPase酶液(L) 反应时间(min) 0.2 mol/L NaOH(mL) 空白管补加酶液 OD405nm 1/OD 1/[S](mmol/L)-1

3．数据处理

0.1 0.6 各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 37℃ 5 min 100 L 精确反应10 min 各管加入2.0 mL 1´-6´对照管补加100 L酶液 2.0 1.67 1.33 1.0 0.67 0.33 各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值（OD405nm）。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量（mol数），计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以molL-1min-1表示）。以1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。本实验以OD405nm为相对速度，以1/OD对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和相对最大反应速度。

五、 注意事项

1. 取液量和反应时间一定要准确。 2. 加酶前后一定要将试剂混匀。 3. 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 4. 测定OD405时要以各自的空白调零点。 5. 移液管或取液器的使用。

6. 如果测定值太小或太大超出量程，要适当调整加酶的体积重新进行实验。

六、思考题

(1) 在测定酶催化反应的米氏常数Km和最大反应速度Vm时，应如何选择底物浓度范围？ (2) 试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。

(3) 为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？

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实验十五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白

一、目的要求

1. 学习电泳原理和技术

2. 学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术 二、原理

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：

(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应、还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。目前常用的多为圆盘电泳(如图12)和板状电泳(如图13)，两者电泳原理完全相同。现以R.J.Davis等(1964)用高pH不连续圆盘PAGE

分离血清蛋白为例，阐明各种效应的原理。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶浓度(T)为3%，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，T=7.0-7.5%，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。将带有2层凝胶的玻璃管垂

图12聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3 直放在电泳槽中，上样后在两个电极槽中加入足够量pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液，接

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通电源即可进行电泳。在此电泳体系中，有2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值，因而形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素，PAGE具有较高的分辨率，就是因为在电泳体系中集样品浓缩效应、分子筛效应及电荷效应为一体。下面就这3种物理效应的原理，分别加以简单说明。

（1）．样品浓缩效应

(a)凝胶孔径不连续性：在上述两层凝胶中，浓缩胶为大孔径；分离胶为小孔胶。在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，蛋白质颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的

区带。

(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在3层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷(简

图13 夹心垂直板电泳槽示意图

称Tris)及HC1。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子。HC1在任何pH溶液中均易解离出氯根(C1-)，它在电场中迁移率快，走在最前面，称为前导离子(leading ion)或快离子。在电极缓冲液中，除有Tris外，还有甘氨酸，其pK1=2.34，pK2=9.7，pI=(pK1+pK2)/2=6.0，它在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根(NH2CH2COO-)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度最小，仅有1`-0.1%，因而在电场中迁移很慢，称为尾随离子(trailing ion)或慢离子。血清中，大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH6.7或8.3时均带负电荷，在电场中，都向正极移动，其有效迁移率(有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)介于快离子与慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带，它们的有效迁移率按下列顺序排列：mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)。若为有色样品，则可在界面处看到有色的极窄区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后再分成多个区带(图14)。

因此，浓缩胶与分离胶之间pH的不连续性，是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。在样品胶和浓缩胶中。要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在快、慢离子界面之间被浓缩。进入分离胶后，慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。

1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形

橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统

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图14电泳过程示意图 为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 A

B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极 窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。 图15 不连续系统浓缩效应示意图 (c)电位梯度的不连续性：电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关，因为电泳速度(υ)等于电位梯度(Ｅ)与迁移率(ｍ)的乘积(υ＝ｍE)。迁移率低的离子，在高电位梯度中，可以与具有高迁移率而处于低电位梯度的离子具有相似的速度(即Ｅ高M慢≈E低M快)。在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形式的。电泳开始后，由于快离子的迁移率最大，就会很快超过蛋白质，因此在快离子后面，形成一个离子浓度低的区域即低电导区。因为

E=

I 其中，Ｅ为电位梯度，Ｉ为电流强度，η为电导率。Ｅ与η成反比，所以低电导区就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质的迁移率与电位梯度的乘积彼此相等时，则３种离子移动速度相同。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。也就是说，在高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个迅速移动的界面(图15)。由于蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。

(2)．分子筛效应

分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。经上述浓缩效应后，各种血清蛋白进入同一孔径的小孔分离胶时，分子迁移速度与分子量大小和形状与其迁移率密切相关，分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。

(3).电荷效应

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虽然各种血清蛋白在浓缩胶与分离胶界面处被高度浓缩，形成一很窄的区带，但进入pH8.9的分离胶中，各种血清蛋白所带净电荷不同，因而迁移率不同。表面电荷多，则迁移快；反之，则慢。

通过以上的三种物理效应：浓缩效应，分子筛效应，电荷效应，就根据各种蛋白质电荷多少，分子量大小及形状，按一定顺序排成一个个圆盘状的区带。

聚丙烯酰胺垂直板电泳是在圆盘电泳的基础上建立的，两者电泳原理完全相同，只是灌胶的方式不同，凝胶不是灌在玻璃管中，而是灌在嵌入橡胶框凹槽中长度不同的2块平行玻璃板的间隙内。垂直板电泳较圆盘电泳有更多的优越性：

(1) 表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清晰。

(2) 在同一块胶板上，可同时进行10个以上样品的电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可用于印迹转移电泳及放射自显影。

(3) 胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅可用于分析，还可用于制备。 (4) 胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于长期保存与扫描。 (5) 可进行双向电泳。

血清蛋白在纸或醋酸纤维薄膜电泳中，只能分离出5-6条区带，而聚丙烯酰胺电泳却可分离出数十条区带，因而，目前PAGE已广泛用于科研、农、医及临床诊断的分析、制备，如蛋白质、酶、核酸、血清蛋白、脂蛋白的分离及病毒、细菌提取液的分离等。

三、试剂和器材 1. 试剂

(1) 凝胶贮液(30 %Acr－0.8 %Bis)：丙烯酰胺(Acr) 30.0 g，甲叉双丙烯酰胺(Bis) 0.8 g，加重蒸水使其溶解后定容至100 mL，置棕色试剂瓶中，4 ℃贮存，一般可保存1个月左右。

Acr及Bis是制备凝胶的关键试剂，应选用分析纯试剂。如试剂不纯，含有丙烯酸或其他杂质，会造成凝胶聚合时间延长，聚合不均匀或不聚合，应将它们分别纯化后方能使用。

Acr及Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，实验表明对小鼠的半致死剂量为170 mg/lkg，操作时应戴手套及口罩，纯化应在通风橱中进行。

Acr的纯化：称70 g Acr溶于1000 mL 50 ℃预热的氯仿中，溶解后趁热过滤。冷却后，置-20 ℃低温冰箱中，则有白色结晶析出，用预冷的布氏漏斗抽滤，收集白色结晶，用预冷的氯仿淋洗几次，真空干燥后置棕色瓶中密封贮存。Acr的熔点为84.5±0.3 ℃。纯Acr水溶液pH应是4.9-5.2，其pH值变化不大于0.4 pH单位就能使用。

Bis的纯化：称12 g Bis，使其溶于1000 mL预热40-50℃的丙酮中，趁热过滤。冷却后，置-20 ℃低温冰箱中，待结晶析出后，用预冷布氏漏斗抽滤，收集结晶，用预冷丙酮洗涤数次，真空干燥后置棕色瓶中密封保存，Bis熔点为185 ℃。

Acr和Bis的贮液在保存过程中，由于水解作用而形成丙烯酸和NH3，虽然溶液放在棕色试剂瓶

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中，4℃贮存能部分防止水解，但也只能贮存1-2个月，可测pH值(4.9-5.2)来检查试剂是否失效。 (2) 分离胶缓冲液(3.0 mol/L pH8.9 Tris-HCl缓冲液)：取1 mol/L HCl 42 mL，Tris(三羟基氨基甲烷)36.6 g，加重蒸水至80 mL使其溶解，调pH8.9，然后用重蒸水定容至100 mL，置棕色瓶，4 ℃贮存. (3) 浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L pH6.7 Tris-HCl缓冲液)：取1 mol/L HCL 48 mL，Tris 5.98 g，加重蒸水至80 mL，调pH6.7，用重蒸水定容至100 mL，置棕色瓶内，4 ℃贮存。 (4) 10%过硫酸铵(AP) (W/V)：称AP 1.0 g，加重蒸水至10 mL，当天配制。

(5) 10% TEMED (N，N，N，N一四甲基乙二胺)：取10 mL TEMED，加重蒸水至100 mL，置棕色试剂瓶中，4 ℃贮存。

(6) Tris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3)：称Tris 6.0 g，甘氨酸28.8 g，加蒸馏水至900 mL，调pH8.3后，用重蒸水定容至1000 mL，置试剂瓶中，4 ℃贮存，临用前稀释10倍。

(7) 样品稀释液：浓缩胶缓冲液25 mL + 蔗糖10 g + 0.05%溴酚兰5 mL，用重蒸水定容至100 mL.置试剂瓶中，4 ℃贮存。

(8) 染色液：称取考马斯亮蓝R-250 50 mg，溶于10 mL冰乙酸，用重蒸水定容至100 mL。 (9) 脱色液：10 %冰醋酸。

(10) 保存液：甘油10 mL，冰乙酸7 mL，加H2O至100 mL。

(11) 1% 琼脂(糖)溶液：琼脂(糖)1 g，加入100 mL已稀释10倍的电极缓冲液，加热溶解，4 ℃贮存备用。 2. 待测样品

新鲜不溶血的人或动物血清。 3. 器材

(1) 垂直板电泳槽 (北京六一仪器厂)

(2) 直流稳压电源 (电压300-600V，电流50-100 mA) (3) 水泵或油泵，真空干燥器

(4) 移液管 (1, 5, 10 mL)，烧杯 (25, 50, 1000 mL)，细长头的滴管，1 mL注射器及10 cm长针头，微量进样器 (10 l)，取液器 (200 l，1000 l)，培养皿 (直径12 cm)，玻璃板 (13×13 cm)，玻璃纸2张

四、操作方法

1. 制备胶板前的准备

将平、凹玻璃板和边条安装在制胶架上。

在制胶架底部的密封槽内加入已融化的1%琼脂(糖)。其目的是封住两块玻璃板底部间的空隙，凝固后的琼脂(糖)中应避免有气泡。在边条与玻璃板的缝隙的外侧也滴加少量的琼脂糖。 待琼脂糖凝固后即可灌胶。

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2. 配胶

本实验采用不连续体系，分离胶浓度7.5 %，浓缩胶浓度为3 %，交联度均为2.7 %，具体操作如表3:

表3 分离胶和浓缩胶的制备

试剂名称 配制10 mL 7.5%分离胶 所需试剂用量/mL 浓缩胶缓冲液(pH6.7 Tris-HCl) 分离胶缓冲液(pH8.9 Tris-HCl) 凝胶贮液 10%TEMED 重蒸水 — 1.25 2.5 0.05 6.15 混匀后，置真空干燥瓶中，抽气10 min 10%过硫酸铵 0.05 0.025* 配制5 mL 3%浓缩胶 所需试剂用量/mL 0.625 — 0.5 0.025 3.825 *浓缩胶的10%过硫酸铵应在分离胶凝固后，灌浓缩胶之前加入。 3. 制备凝胶板

将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。为防止渗漏，在上、下贮槽中加入略低于胶面的蒸馏水。约30-60 min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。用滤纸条吸去多余的水，但不要碰破胶面。虽然凝胶90%以上聚合，但仍有一些残留物存在，特别是AP可引起某些样品(如酶)钝化或引起人为的效应，因此在正式电泳前，先用电泳的办法除去残留物，这称为预电泳。将上、下贮槽的蒸馏水倒去，换上分离胶缓冲液，10 mA电流电泳1 h，终止电泳后，弃去分离胶缓冲液，用注射器取浓缩胶缓冲液洗涤胶面数次。是否进行预电泳则取决于样品的性质。

预电泳后，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板，静置电泳槽，10 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min。

将凝胶板从制胶架中取下安装到电泳槽上，在凹板口边缘与电泳槽之间封一些琼脂糖。加入电极缓冲液，使液面没过凹玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。 4. 加样

图16 不连续凝胶垂直板电泳示意图 1.上槽电极 2下槽电极 3. 上槽电极缓冲液(pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) 4.浓缩胶(T=3%，pH6.7 Tris-HCl缓冲液配制) 5.加样凹槽(内有样品) 6.分离胶(T=7.5%，pH8.9 Tris-HCl缓冲液配制) 7.下槽电极缓冲液(pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) 66

作为分析用的PAGE加样量仅需几微克，2-3 l血清电泳后就能分出几十条蛋白区带。取100 l血清用样品稀释液稀释至1 mL。用微量进样器取25 l上述混合液，通过缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部，由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶解液会自动沉降在凝胶表形成样品层。待所有凹形样品槽内都加到了样品，即可开始电泳。图16为不连续凝胶垂直板电泳示意图。 5. 电泳

将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接(方向切勿接错)，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10 mA。待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA。当溴酚蓝染料迁移至距离硅胶框下缘1 cm时，将电流调回到零，关电源及冷却水。取下凝胶板，用不锈钢铲轻轻将玻璃板撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 6. 固定和染色

为防止胶内已分离成分的扩散，需要进行固定，或浸泡在用7%乙酸液或12.5%三氯乙酸配制的染色液中，同时进行固定和染色，本实验固定和染色同时进行，使染色液没过胶板，染色1-2 h，经常摇动，如水浴加热，可以缩短染色时间。 7. 脱色

用10%乙酸浸泡漂洗数次，直到背景蓝色褪去。如用50℃水浴，则可缩短脱色时间。脱色后血清蛋白质电泳区带见图17。

8. 制备凝胶干板

1mm以上的胶板常用凝胶真空器制备干板。如无此仪器可将脱色后的胶板浸泡在保存液中3-4 h。制干板时在大培养皿上平放一块干净玻璃板(13×13 cm)，倒少许保存液在玻璃板上，使其均匀涂开，取一张预先用蒸馏水浸透的玻璃纸平铺在玻璃板上，赶走气泡，小心取出凝胶板平铺在玻璃纸上，赶走两者间的气泡。再取另一张蒸馏水浸透的玻璃纸覆盖在凝胶板上，赶走气泡，将四边多余的玻璃纸紧紧贴于玻璃板的背面。

图17 聚丙烯酰胺凝胶电泳血清蛋白质区带分布图 平放于桌上自然干燥1-2 d，完全干后除去玻璃板，即可得到平整、透明的干胶板，此干板可长期保存，便于定量扫描。

五、 注意事项

(1) 凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。凝胶浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。凝胶浓度小，孔径大，移动颗粒穿过网孔阻力小。凝胶浓度与被分离物分子量关系如表4。

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表4 分子量范围与凝胶浓度的关系

分子量范围 蛋 白 质 104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105 核酸(RNA) 104 104–105 105-2×106 适用的凝胶浓度/(%) 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5 15–20 5-10 2-2.6 在操作时，可根据被分离物的分子量大小选择所需凝胶的浓度范围，也可先选用7.5%凝胶(标准胶)，因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。 (2) 安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。 (3) 用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。

(4) 预电泳只能在分离胶聚合后进行。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。

(5) 为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐。

(6) 样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被稀释。

六、思考题

(1) 为什么样品会在浓缩胶中被压缩成层？

(2) 为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的蔗糖溶液？蔗糖及溴酚兰的作用分别是什么？ (3) 碱性PAGE电泳是否可以分离鉴定样品中的所有蛋白质？

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实验十六 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点

一、目的要求

1. 学习和掌握圆盘电泳技术

2. 学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点方法 二、原理

蛋白质是两性电解质，当pH>pI时带负电荷，在电场作用下向正极移动；当pH(1) 易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。

(2) 在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 (3) 分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。

(4) 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。 IEF-PAGE分离蛋白质并测定pI时可先选用pI 3-10的两性电解质载体及同一范围的标准pI蛋白，将其与未知样品同时电泳，固定染色后，就可以pH值为纵轴，迁移距离(cm)为横轴作出pH梯度标准曲线(图18)，根据染色后未知蛋白质迁距离则可得知其pI。为进一步精确测定未知物的pI，还可选择较窄范围的两性电解质进行电泳，以提高分辨率，得到更准确的pI。实验时如无标准pI蛋白质作标定依据，则电泳后立即用表面微电极每隔0.5cm直接测定凝胶的pH值，制作pH梯度曲线，染色后根据迁移距离得知某种蛋白质的pI。

IEF-PAGE操作简单，电泳时间短，分辨率高，只要有一般电泳设备就可进行。其应用范围广，可用于分离蛋白质及测定pI，也可用于临床鉴别诊断、农业、食品研究及动物分类等各种领域。随

图18 标准蛋白质迁移距离与pH的关系 69

着其他技术的不断改进，等电聚焦电泳也不断充实完善，从柱电泳发展到垂直板，又继而发展到超薄型水平板电泳等，还可与其他技术或SDS-PAGE结合，进一步提高灵敏度与分辨率。

三、试剂和器材 1. 试剂

(1) 凝胶贮液(30% Acr－0.8% Bis)：称丙烯酰胺(Acr)30.0 g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8 g，加重蒸水使其溶解后定容至100 mL，置棕色试剂瓶中，4℃贮存。

(2) 10% TEMED(V/V)：取10 mL TEMED，加重蒸水至100 mL，置棕色试剂瓶中，4℃贮存。 (3) 5%过硫酸铵(AP)(W/V)：称AP 0.5 g，加重蒸水至10 mL，当天配制。 (4) 电极缓冲液:

（正极）5%磷酸溶液：量取58.8 mL 85%磷酸，定容至1000 mL。

（负极）2%氢氧化钠溶液：称取20 g氢氧化钠，溶于蒸馏水并定容至1000 mL。 (5) 两性电解质载体pH3-10。

(6) 染色液：称50 mg考马斯亮蓝R-250，加10 mL冰醋酸，定容至100 mL。 (7) 脱色液：10%冰醋酸。

(8) 40%蔗糖溶液：称取40 g蔗糖溶于少量蒸馏水中，定容至100 mL。

2. 待测样品：称取牛血清白蛋白7 mg及牛胰核糖核酸酶5 mg，共溶于1 mL蒸馏水中，置冰箱备用。 3. 器材

(1) 垂直管电泳槽(装置见图12)和玻管(内径5 mm，长度10 cm) (2) 恒压恒流电泳仪 (3) 酸度计

(4) 油泵或水泵和真空干燥器

(5) 微量进样器(50 l或100 l)，取液器(200 l，1000 l)，刀片，镊子，细铜丝，10 cm长针头，2 mL或5 mL注射器，烧杯，

四、操作方法 1. 凝胶柱的制备

预先准备洁净的玻管(0.510 cm)两根，玻璃管的一端插在青霉素或疫苗小瓶的橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)，使其垂直站立在桌面上或管架中。

按表5的配方在小烧杯内配制凝胶溶液(总体积10 mL)。

将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高，静止聚合30 min，待凝胶与水层之间出现折射率不同的界面时，说明已经凝胶聚合，再放置0.5 h，待聚合完全。

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表5 10mL 7.5%凝胶的配制

试 剂 名 称

凝胶贮液 两性电解质载体 10%TEMED 蛋白质混合样品 蒸馏水

混匀后置真空干燥器中抽气10 min

5%过硫酸铵

0.1 体积(mL) 2.5 0.5 0.1 0.2 6.6

2. 电泳

用手指压迫橡皮帽使其变形，让空气进入，小心地拔出玻管。倒出凝胶上层水，用滤纸吸干(不要直接接触胶面)，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定到电泳槽上槽的洞中，安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏。可以在上槽中先加入5%磷酸缓冲液，检验是否漏液。再在下槽中装入2%氢氧化钠溶液，把上槽放在下槽上，避免管下有气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，先调电压至100 V，待电压稳定后再升到300 V，电泳2 h以上至电流降为0，将电压调至0，关闭电源。 3. 剥胶

电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出(剥胶时注意不要损伤凝胶柱表面)。 4. 固定染色

取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色1-2 h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。 5. pH梯度的制作

取另一条凝胶条放在玻板上，用尺贴近凝胶条，用干净的刀片，从凝胶的正极端开始，每隔0.5 cm切下一段，依次放入已编好号并装有1 mL蒸馏水的试管中，浸泡过夜。次日用酸度计分别测定每管浸提液的pH值。以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度曲线。 6. 蛋白质样品等电点的计算

用下式求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：

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固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离

固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度

计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。

五、注意事项

影响等电聚焦电泳的因素有： (1) 支持介质

当用聚丙烯酰胺或琼脂糖作为稳定介质时，有时最后测得pH梯度常与两性电解质载体标明的pH范围有差别，这可能与电内渗有关。因此等电聚焦必须使用无电内渗的高纯度的稳定介质。在IEF-PAGE中，丙烯酰胺纯度极为重要。由于介质不纯，常引起pH梯度阴极漂移，一般约1/3 pH，因而影响分离效果及pI值测定。该电泳中，凝胶只是一种抗对流支持介质，并无分子筛作用，因此凝胶浓度的选择只要形成的孔径有利于样品分子移动就行，一般用5%或7%均可。 (2) 两性电解质载体

两性电解质载体是IEF-PAGE中最关键的试剂，它直接影响pH梯度的形成及蛋白质的聚焦，因此，要选用优质两性电解质载体。在凝胶中，其终浓度一般为1-2%。国内生产的两性电解质载体色黄，导电性略差，但只要控制凝胶中终浓度不超过2%，电泳时电压不要太高，仍可用于分析等电聚焦。为提高分辨率可适当延长电泳时间。

pH梯度的线性依赖于两性电解质的性质，选择哪种pH梯度范围的两性电解质载体，则与被分离蛋白质的pI有关。 (3) 电极溶液

应选择在电极上不产生易挥发物的液体作为电极缓冲液，阴、阳电极溶液的作用是避免样品及两性电解质载体在阴极还原或在阳极氧化，其pH值应比形成pH梯度的阴极略高，比阳极略低。值得指出的是不同厂家合成两性电解质方法的不同，应根据说明书选用有关电极溶液。 (4) 丙烯酰胺的聚合

在采用AP催化的化学聚合时，为防止氧分子存在影响聚合，加AP前应将溶液抽气。此催化系统在碱性条件下容易聚合，在酸性条件下(pH<5)凝胶聚合比较困难，这可能是在酸性条件下，AP不能充分产生出氧原子，使单体成为游离基，因而阻碍凝胶聚合，可在凝胶中加入1%的AgNO3促使凝胶聚合。 (5) TEMED

在中性及碱性pH条件下，加入TEMED可加速凝胶聚合，但在pH<5时则无加速作用。TEMED本身为碱性介质，在pH4.5以上能扩展聚丙烯酰胺凝胶碱性端pH梯度，其扩增幅度与TEMED加入量有关，郭尧君等人实验表明pH3.5-9.5的两性电解质载体可扩展到pH3.5-11的梯度范围。因此加

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入TEMED对碱性蛋白质的分析极为有利，可用于分离细胞色素C、溶菌酶、组蛋白等。 (6) 样品预处理及加样量

实验证实盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲。为防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶小颗粒引起拖尾。对在水或低盐浓度不易溶解的蛋白质可溶于1%甘氨酸或2%两性电解质载体中。

加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250染色，加样量可为50-150 g；如用银染色，加样量可减少到1 g。一般样品浓度以0.5-3 mg/mL为宜，最适当加样体积为10-30 l。

六、思考题

(1) 简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。 (2) 进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意事项有哪些？

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实验十七 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量

一、目的要求

1. 学习电泳原理和技术

2. 学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术

二、原理

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。1967年，Shapiro等人发现，如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。

在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽组分分成单个亚单位；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质–SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4 g SDS/1 g蛋白质。由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度一样，约为18Å，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。由于蛋白质的迁移率与蛋白质的净电荷量(q)成正比，与蛋白质在溶液中的摩尔系数(f)成反比(f由介质的粘滞性、蛋白质分子的大小和形状决定)，而不同的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，并具有相同形状；因此在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数。

目前，用SDS-PAGE研究过的蛋白质已有100余种，均证实此方法测定蛋白质分子量的可靠性。但是不同的凝胶浓度适用于不同的分子量范围。(表6)

表6 聚丙烯酰胺凝胶浓度与分子量范围的关系

蛋白质分子量范围 大于200,000 25,000 – 200,000 10,000 – 70,000 10,000 – 50,000 此表为weber的实验方法，凝胶交联度为2.6%。 凝胶浓度/(%) 3.33 5 10 15 可根据所测未知样品的估计分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率(蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率)最好在0.2-0.8之间均匀分布。现在，市场有高、中、低分子量标准蛋白试剂出售。进行SDS-PAGE时，则可根据已知蛋白质分子量的电泳迁移率和分子量的对数作出标准曲线，

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再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。值得指出的是，每次测定未知蛋白质分子量时，都应同时用标准蛋白质制备标准曲线，而不是利用过去的标准曲线。

现在常用的SDS-PAGE系统有好几种，缓冲液系统有连续和不连续之分，凝胶形状可以是柱状，也可以是平板状。本实验采用的是不连续垂直板电泳，此系统分辨率高，便于电泳样品间的相互比较，是目前科研工作中广泛采用的一个系统。

三、试剂和器材 1. 试剂

(1) 标准蛋白质：可采用厂家生产的不同分子量范围的SDS-PAGE标准蛋白质试剂盒，也可参考常用的标准蛋白质分子量表，从中选择3-5种蛋白质，按照每种蛋白0.5-1 mg/mL溶解液，自己配制标准蛋白质混合试剂。

(2) 凝胶贮液(AcrBis=300.8)、分离胶缓冲液(3.0 mol/L pH8.9 Tris-HCl缓冲液)、浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L pH6.7 Tris-HCl缓冲液)、10% TEMED、10%过硫酸铵(AP)、染色液及脱色液的配制同实验四。 (3) 10%(W/V)SDS溶液：称5 g SDS，加重蒸水至50 mL，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。在低温下易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。

(4) 电极缓冲液(内含0.1%SDS的Tris-Gly缓冲液，pH 8.3)：称Tris 6.0 g，Gly 28 g，加10% SDS 10 mL，加蒸馏水使其溶解后定容至1000 mL。

(5) 样品溶解液：内含1% SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01 mol/L pH6.7 Tris-HCl 缓冲液。(如样品为液体，则应配制2倍样品溶解液，使样品溶解液浓度大一倍，然后等体积混合。)

0.5 mol/L pH6.7 Tris-HCl缓冲液 0.2 mL 10%SDS 1.0 mL 巯基乙醇 0.1 mL 蔗糖 4.0 g 溴酚蓝 2.0 mg H2O 8.7 mL

2. 待测样品

待测的已纯化的蛋白质样品。 3. 器材 同实验十五。

四、操作方法 1. 安装垂直板电泳槽

安装方法见实验十五。 2. 配胶

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根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。按表7的配制方法进行配制。 3. 凝胶板的制作

将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1 cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4 mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30 min后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，用滤纸条吸去多余的水，但不要碰破胶面。用细长头的滴管将混合均匀的浓缩胶加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板。静置电泳槽，10 min左右上胶即可聚合，再放置10-20 min。将凝胶板从制胶架中取下安装到电泳槽上，在凹板口边缘与电泳槽之间封一些琼脂糖。加入pH8.3的Tris-甘氨酸电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。

表7 SDS–不连续体系凝胶的制备

试剂名称 7.5% 凝胶贮液(30%Acr-0.8%Bis) 分离胶缓冲液(pH8.9 Tris-HCl) 浓缩胶缓冲液(pH6.7 Tris-HCl) 10%TEMED 10%SDS 重蒸水 5.00 2.50 — 0.10 0.20 12.10 配制20 mL不同浓度的分离胶 所需试剂用量/mL 10% 6.66 2.50 — 0.10 0.20 10.44 15% 10.0 2.50 — 0.10 0.20 7.10 配制10 mL浓缩胶 所需试剂用量/mL 3% 1.00 — 1.25 0.05 0.10 7.55 混匀后，置真空干燥器中，抽气10 min 10%过硫酸铵 0.10 0.05 4. 样品的处理

根据标准分子量蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，自己配制的标准及未知样品，按0.5–1 mg/mL加样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子(不要塞紧，以免加热时迸出)，在100℃沸水浴中加热3 min，取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可放在-20℃冰箱保存较长时间，使用前在100℃沸水浴中加热3 min，以除去亚稳态聚合。 5. 加样

加样的体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10-15 l(即2-10 g蛋白)，若样品较稀，加样体积可达100 l，但注意样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量进样器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，注意针头不要碰破凹槽胶面，轻轻加入样品。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶解液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。 6. 电泳

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将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，接通冷却水，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源及冷却水。 7. 染色与脱色

电泳结束后，取下凝胶板，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放入大培养皿中，加入染色液染色1-2 h，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。 8. 绘制标准曲线

将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR:

相对迁移率mR=

蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)

以标准蛋白的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。根据未知蛋白质样品相对迁移率可直接从标准曲线上查出其分子量。

五、注意事项

(1) SDS-PAGE有不足之处，尤其是电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白(如糖蛋白)及一些结构蛋白等测出的分子量不太可靠。如组蛋白F1，本身带有大量正电荷，虽然结合了正常量的SDS，仍不能完全掩盖其原有的正电荷，故用SDS-PAGE测得的分子量为35,000，而用其它方法测定的分子量仅为21,000。因此要确定某种蛋白质的分子量时，最好用2种以上的测定方法互相验证。 (2) 在SDS-PAGE测定蛋白质分子量还需要注意以下问题：如果SDS-蛋白质复合物不能达到1.4克SDS/1克蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有3个：（a)二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。(b)溶液中SDS的浓度：溶液中SDS的总量至少要比蛋白质的高3倍，一般常高达10倍以上。(c)溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不超过0.26。因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅取决于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。

六、思考题

(1) 简述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量的原理。

(2) 是否所有的蛋白质用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定得到的分子量都完全可靠？

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实验十八 维生素C的定量测定

一、目的

1．学习维生素C定量测定的一般原理，掌握用2，6-二氯酚靛酚滴定法和碘量法定量测定食物和生物体液中维生素C的基本操作技术。

2．概括了解维生素C的生理意义及其在新鲜水果和蔬菜中的含量。 二、原理

维生素C是人类膳食中必需的维生素之一，如果缺乏维生素C，将导致坏血病发生。因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。抗坏血酸在自然界分布十分广泛，存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特别丰富。

抗坏血酸在机体同具有广泛的生理功能，已知体内许多重要物质的代谢反应都需要抗坏血酸的参与。它是脯氨酸羟基化酶的辅酶，故有增进胶原蛋白合成的作用。机体中许多含疏基的酶，需要依赖于作为还原剂的抗坏血酸的保护，使酶分子的疏基处于还原状态，从而维持其催化活性。由于抗坏血酸的氧化还原作用，它可促进免疫球蛋白的合成，增强机体的抵抗力。同时还能使氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽（简称GSH），而GSH可与重金属结合而排出体外，因此维生素C常用于重金属的解毒。此外，抗坏血酸尚有许多其他生理功能，但其作用机理还不十分清楚。

抗坏血酸是一种不饱和的多羟基内酯化合物，稍有酸味的糖类白色晶体，易溶于水，故属于水溶性维生素。在溶液中其分子内C2和C3之间的烯醇式羟基上的氢极易解离并释放出H+，而被氧化成脱氢抗坏血酸，氧化后仍具有维生素C的生理活性，但它易分解为二酮古洛糖酸，此化合物不再具有维生素C的生理活性。维生素C有很强的还原性，在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，易被氧化而破坏。还原型和氧化型抗坏血酸可以互相转变，在生物组织中自成一氧化还原系统。

由于维生素在营养学和临床方面的重要意义，故对食物和生物材料中维生素含量的测定是十分必须的。抗坏血酸的定量测定方法很多，有2，6-二氯酚靛酚（简称DCIP）滴定法、碘滴定法、2，4-二硝基苯肼法、Folin试剂比色法、紫外吸收法等。

方法一 2，6-氯酚靛酚滴定法

一、原理

维生素C测定广泛采用的是DCIP滴定法，它具有简便、快速、比较准确等优点，适用于许多不同类型样品的分析。缺点是不能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量，易受其他还原物质的干扰。如果样品中含有色素类物质，将给滴定终点的观察造成困难。

在酸性环境中，抗坏血酸（还原型）能将染料2，6-DCIP还原成无色的还原型

2，6-DCIP，而抗坏血酸则被氧化成脱氢抗坏血酸。氧化型的2，6-DCIP在中性或碱性溶液中

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呈蓝色，但在酸性溶液中则呈粉红色。因此，当用2，6-DICP滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸未被全部氧化前，滴下的2，6-DCIP立即被还原成无色，一旦溶液中的抗坏血酸全部被氧化时，则滴下微量过剩的2，6-DCIP便立即使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。依据滴定时2，6-DCIP标准溶液的消耗量（mL），可以计算出被测样品中抗坏血酸的含量。氧化型2，6-DCIP与还原型抗坏血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中进行反应。即先将样品溶于一定浓度的酸性溶液中或经抽提后，再用2，6-DCIP标准溶液滴定至终点。

食物和生物材料中常含有其他还原物质，其中有些还原物质可使2，6-DCIP还原脱色。为了消除这些还原物质对定量测定的干扰，可用抗坏血酸氧化酶处理，破坏样品中还原型抗坏血酸后，再用2，6-DCIP滴定样品中其他还原物质。然后从滴定未经酶处理样品时

2，6-DCIP标准溶液的总消耗量中，减去滴定非抗坏血酸还原物质2，6-DCIP标准溶液的消耗量，即为滴定抗坏血酸实际所消耗的2，6-DCIP标准溶液的体积，由此可以计算出样品中抗坏血酸的含量。另外，还可利用抗坏血酸和其他还原物质与2，6-DCIP反应速度的差别，并通过控制样品溶液在PH1—3范围内，进行快速滴定，可以消除或减少其他还原物质的作用，一般在这样的条件下，干扰物质与2，6-DCIP的反应是很慢的或受到抑制。

生物体液（如血液、尿等）中的抗坏血酸的测定比较困难，因为这些样品中抗坏血酸的含量很低，并且存在许多还原物质的干扰，同时还必须预先进行脱蛋白处理。在生物体液中含有巯其、亚硫酸盐及硫代硫酸盐等物质，它们都能与DCIP反应，但反应速度比抗坏血酸慢得多。样品中巯基物质对定量测定的干扰，通常可以藉加入对-氯汞苯甲酸（简称PCMB）而得到消除。

本实验采用2，6-二氯酚靛酚滴定法，以新鲜水果、蔬菜和生物体液为分析材料，进行抗坏血酸含量测定。

二、器材及试剂 1．材料

松针、新鲜蔬菜（辣椒、青菜、西红柿等）、新鲜水果（桔子、柑子、橙、柚等）、生物体液（血清、血浆等）

2. 器材

天平、 容量瓶、锥形瓶、组织捣碎机、滴定管、抽滤装置 2．试剂：

(1) 2%草酸溶液：草酸2g，溶于100 mL蒸馏水。

（2%草酸液可用4%偏磷酸—醋酸溶液代替） (2) 1%草酸溶酸：溶1g草酸于100 mL蒸馏水。

(3) 标准抗坏血酸溶酸：准确称取50.0 mg纯抗坏血酸，溶于1%草酸溶液，并稀至500 mL。贮棕色瓶、冷藏，最好临用时配制。

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(4) 1%HCl溶液。

(5) 0.1%2，6-二氯酚靛酚溶液：溶250 mg 2，6-二氯酚靛酚于150 mL含有52 mg NaHCO3热水中，冷却后加水稀释至250 mL，滤去不溶物，贮棕色瓶内，冷藏（4℃约可保存一至三周）。每次临用时稀释10倍，并以标准抗坏血酸溶液标定。

(6) 对-氯汞苯甲酸（简称PCMB）溶液（2 mg·mL-1）称取100 mg PCMB溶于50 mL 0.05 mol·L-1 NaOH溶液中，过滤后滤液保存备用。（分析尿液样品用） (7) 抗坏血酸氧化酶（-20℃保存）

三、操作步骤：

1．不同样品用不同方法提取后滴定 (1) 水果汁样品

将果汁充分摇匀后，取5 mL样品放入50 mL容量瓶中，用2%草酸溶液（或4%偏磷酸-醋酸）溶液稀释，并定容至50 mL，混匀后通过快速滤纸过滤（或离心）。取滤液10 mL放入锥形瓶内，立即用已标定过的2，6-DCIP溶液快速滴定至样品液呈现玫瑰色，并保持15－20s不变即为终点，记录所消耗的2，6-DCIP溶液的体积(mL)。样品液中抗坏血酸含量宜在0.1－0.2 mg·mL-1范围内，如果偏高或偏低则可酌情增减样品用量或进行适当稀释。另取10mL蒸馏水作空白对照滴定。样品液和空白对照均至少各做3份，滴定结果取平均值，随时分别做好数据记录。

检测果汁（或其他样品）中干扰物质的存在，可取5 mL新鲜果汁放入50 mL容量瓶中，加少许抗坏血酸氧化酶晶体，轻轻混匀，放置10 min，藉以破坏还原型抗坏血酸。然后再中入2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液释稀至刻度，混匀后过滤，取这种滤液10 mL用 2，6-DCIP进行滴定，记下消耗的DCIP溶液体积（mL）。 (2) 水果样品

将新鲜水果去皮，可食部分切成小块，称取25－50g样品置于匀浆器中或研钵内，加入25 mL 2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液研磨，抽提液倾入100 mL容量瓶中，残渣再加25 mL2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液研磨和抽提两次，每次抽提液均倾入容量瓶中，最后用2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液定容至100 mL。混匀后用快速滤纸过滤（最初数mL滤液弃去）或离心，取滤液或上清液10mL放入50mL锥形瓶内，随即用2，6-DCIP溶液快速滴定至终点，取10 mL2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液作空白对照滴定，样品液和空白对照的各平行做3份。 (3) 蔬菜样品

称取新鲜蔬菜100－200g，洗净后淋干并用纱布拭去其表面水份，切成碎块置于组织捣碎器内，加入100 mL2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液，捣碎1－2min。称取匀将20－50g倾入100 mL容量瓶中，用2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液洗涤匀浆容器数次，洗液均转入容量瓶中，最后稀释至刻度。混匀后用快速滤纸过滤（或离心），弃去最初滤出的滤液。如果样品颜色颜色太深，可采用

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白陶土进行脱色处理。吸取滤液5－10mL放入锥形瓶中，立即用标定过的2，6-DCIP溶液进行快速滴定。同时用2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液作空白对照，分别记下各次滴定所消耗的染料溶液的体积（mL）。 (4) 松针样品

称取松针1g用水洗净，淋干并用滤纸吸去表面水分，放在研钵中，加入适量1% HCl溶液，充分研磨，静置后将上层抽提液倾入100 mL容量瓶中。如此反复研磨抽提2－3次，最后用1% HCl溶液稀释定容至刻度。混匀后过滤或离心，取滤液5 mL放入锥形瓶中，随即用2，6-DCIP溶液滴定。另取5 mL 1% HCl溶液作出空白对照滴定。 (5) 生物体液样品

生物体液中维生素C的含量测定应采用新鲜样品，分析前必须制备成无蛋白质样品。向离心管中先加入4 mL血清（血浆、尿液等），再加入6 mL 2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液，充分混匀，离心（3500rpm）10 min。取上清液8－9 mL放入锥形瓶内，可直接用2，6-DCIP标准溶液进行滴定。样品和空白对照至少平行各做3份，取其平均值。

尿液样品在滴定前还必须用PCMB处理，即取9 mL无蛋白上清液放入离心管中，再加1 mL PCMB溶液（2 mg·mL-1），混匀后放置5－10min。然后离心10 min，取上清液8－9mL放入锥形瓶内，用2，4-DCIP溶液滴定之。

注意：各样品滴定过程宜迅速，一般不超过2分钟。滴定所用的染料不应少于1 mL或多于4 mL，如果样品含抗坏血酸太高或太低时，可酌量增减样液。

2．2，6-二氯酚靛酚溶液的标定

准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0 mL（含0.1 mg抗坏血酸）置100 mL锥形瓶中，加9 mL 1%草酸，用微量滴定管以稀释10倍的2，6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持15秒钟不褪色即为终点。由所用染料的体积计算出1 mL染料相当于多少mg抗坏血酸。 四、计算

抗坏血酸（mg/100g样品）=

VAVBTW×100

T=1 mL染料能氧化抗坏血酸mg数。 W=10 mL样液相当于含样品之g数。

VA为滴定样品时所消耗的染料mL数（平均值）；VB为滴定空白时所消耗染料的mL数。 五、注意事项

（1）2%草酸可抑制抗坏血酸氧化酶，1%草酸因浓度低不能完成上述作用。偏磷酸有同样功效。若样品中含有大量Fe2+可用8%醋酸溶液提取，如仍用偏磷酸或草酸为提取剂，Fe2+可以还原二氯酚靛

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酚，如用醋酸则Fe2+不会很快与染料起作用。故可用4%偏磷酸-醋酸液代替2%草酸液。 （2）如浆状物泡沫很多，可加数滴辛醇或丁醇。 （3）若浆状物不易过滤，可离心取上清液测定。

（4）如滤液颜色太深，滴定时不易辨别终点，可先用白陶土脱色。

（5）样品中某些杂质亦能还原二氯酚靛酚，但速度均较抗坏血酸慢，故终点以淡红色存在15秒钟为准。

六、思考题

（1）提取VC时，加入2%草酸或4%偏磷酸-醋酸液的作用是什么？

（2）如果提取液颜色太深而又无法脱尽，严重影响滴定终点判断时，是否有其它办法能准确判断出终点？（提示：借助仪器）

（3）提取液中的抗坏血酸氧化酶是否会影响本实验结果？能否加热消除该酶的影响？ （4） 简述本法测定VC的利与弊。

方法二 碘量法

一、 原理

维生素C包括氧化型、还原型和二酮古乐糖酸三种。当用碘滴定维生素C时，所滴定的碘被维生素C还原为碘离子。随着滴定过程中维生素C全被氧化，所滴入的碘将以碘分子形式出现。碘分子可以使含指示剂（淀粉）的溶液产生蓝色，即为滴定终点。本法测定的是还原型维生素C的含量。

二、材料、试剂与器材 1. 材料：猕猴桃

2. 试剂： 2 ％ 草酸：称取10g草酸，用蒸馏水定容到500 mL。

2 ％ 淀粉溶液：称取10g淀粉，用蒸馏水定容到500 mL 。

0.02 M 的I2-KI溶液：称取3.32 g碘化钾溶于5 mL蒸馏水中。再加2.5 g碘。待碘完全溶解后，加蒸馏水995 mL，混合均匀后贮于棕色瓶内。

2.5 mg/mL的维生素C：称取2.5 g维生素C用蒸馏水定容到至1000 mL 。

三、操作方法 (1) 样品处理

水果（猕猴桃）称量后去皮，加入一倍体积2％草酸匀浆1 min，用纱布过滤，滤液定容至一定体积。 (2) 滴定

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a 标准维生素C溶液（2.5 mg/mL）的测定

取4 mL Vc溶液于锥形瓶中，加入1 mL淀粉液，用碘液滴定至蓝色出现（30秒中内不褪色），记下碘液体积V标准。 b 样品维生素C的测定

取上述猕猴桃液10 mL锥形瓶中，加入1 mL淀粉液，用碘液滴定至蓝色出现（30秒中内不褪色），记下碘液体积V样品。

(3) 计算 10 mg/V标准=M样品（mg）/V样品

根据猕猴桃重量及滤液体积计算每100 g猕猴桃中的Vc含量。

四、注意事项

(1) 看到淀粉与碘反应产生的蓝色消失较慢时要放慢滴定的速度。 (2) 以显蓝色在30s内不褪色为滴定终点。

五、思考题

（1）简述本法测定VC的利与弊。

（2）为何以显蓝色在30s内不褪色为滴定终点？

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实验十九 猪脾DNA的制备

一、目的要求

掌握从动物组织中提取、分离、纯化、制备DNA的方法。 二、原理

从生物组织提取、分离、纯化，以制备各种用途的核酸材料，是生物化学和分子生物学工作者必需具备的基本实验技能之一。

由于DNA主要集中在细胞核内，通常采用细胞核含量较大的生物组织作为制备DNA的原料。小牛胸腺组织的细胞核含量比例大，因而DNA含量也高；且其脱氧核糖核酸酶DNase活性较低，在制备过程中由于此酶所引起的DNA降解损失较小，是实验室制备DNA的良好原料。

但是，胸腺来源短缺，往往很难及时满足需要。猪脾较易获得，它的细胞核含量也高，可以代替胸腺。用猪腺脏组织制备DNA，其纯度和产率均可达到采用小牛胸腺组织制备DNA时的相似水平，制备流程也基本相似。但是必需指出，在破碎脾脏组织以分离制取细胞核时，以及沉淀析出制取DNA钠盐过程中，一定要严格掌握所规定的操作条件并实行监控，这样可以使产率和质量都较为稳定。

在细胞内核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物——核糖核蛋白（RNP）和脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在的。因而，初步的提取，分离技术即是设法将这两大类的核蛋白分开。

在不同的电解质溶液中，RNP及DNP的溶解度有很大的差别。例如：在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降，当NaCl浓度为0.14 mol/L时，DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的约百分之一。但当NaCl的浓度继续增加时，DNP的溶解度又渐次增大，当NaCl浓度增至0.5 mol/L时，DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当NaCl浓度继续增至1.0 mol/L时，DNP的溶解度则约为其在纯水中的溶解度的两倍了。且随着盐浓度的上升其溶解度仍继续呈增大之趋势。但RNP与之不同，在0.14 mol/L盐溶液中DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大。因此，常常采用0.14 mol/L的盐溶液来提取RNP，以使其与DNP分开。

由于DNP的浓盐溶液中的溶解度比在稀盐溶液中溶解度大很多，所以为了尽量提取DNP，往往先采用浓盐溶液（如1.0 mol/L，甚至1.71 mol/L NaCl），以增大提取收率。

制得核蛋白质，为了提取核酸，需进一步采用适当的试剂和实验方法，使与核酸结合的蛋白质成分变性除去或溶解除去，常用的方法有“氯仿法”和“苯酚法”。

制品中的多糖类杂质过多的，也需用适当的方法除去。

经上述分离，纯化处理后，核酸溶液，再利用其不溶于有机溶剂的性质而使其在适当浓度的亲水性有机溶剂（如：乙醇）中呈絮状沉淀析出。

重复进行上述处理，即可制成所要求纯度的核酸制品。

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提纯后的DNA（或DNA钠盐）呈白色纤维状固体。

三、主要仪器、材料及试剂 1. 仪器： (1) 培养皿 (2) 手术剪刀 (3) 电动组织捣碎机 (4) 离心机 (5) 普通光学显微镜 (6) 冰箱

(7) 具塞磨口玻璃锥形瓶 (8) 弯头滴管 (9) 真空干燥器 (10) 烧杯 2. 材料：

新鲜猪胰脏或肝脏、冰块 3. 试剂：

(1) 0.1 mol/L NaCl+0.05 mol/L柠檬酸钠混合盐提取液（pH7.0）：称取5.8g NaCl和14.7 g柠檬酸钠，用蒸馏水溶解后稀释至1000 mL。

(2) 1.71 mol/L NaCl溶液（10％ NaCl溶液） (3) 氯仿：异戊醇（24：1，V/V）溶液 (4) 95%乙醇 (5) 无水乙醇 (6) 乙醚

四、操作方法

新鲜猪脾或肝脏5g

（1） 剪成小块。

（2） 加入10 mL 0.10 mol/L氯化钠-柠檬酸钠的混合提取液，匀浆（每次5秒，间隔30秒，共4-5次）

（3） 离心沉降（3000 r/m，15 min），收集细胞核沉淀。

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上清液 沉淀（含细胞核）

（弃去） （1）加入30 mL 1.71 mol/LNaCl，充分搅匀。0-5℃冰箱静置2小时。 （2）将上述液体慢慢倒入预冷的11倍体积（330 mL）蒸馏水中，使DNP 析出。冰箱静置1小时。

（3）离心沉降（3000 r/m，10 min），收集DNP沉淀。

上清液 沉淀（DNP）

（弃去） （1）加入20 mL1.71 mol/LNaCl，使DNP重新溶解。

（2）加入20 mL氯仿-异戊醇（24：1），剧烈震荡10 min，使与DNA 结合的蛋白质变性。

（3）离心（3000 r/m，10 min），收集上层水相，中层变性蛋白弃 去，下层有机溶剂回收。

（4）加入20 mL氯仿-异戊醇（24：1），剧烈震荡10 min，继续除 去和DNA结合的蛋白质。收集上层水相。重复此步骤数次至 无明显沉淀生成。

蛋白质沉淀 水相（DNA钠盐溶液）

（弃去） （1）将水相慢慢注入预冷的2倍体积的95%乙醇中。 冰箱静置1小时。

（2）用玻璃棒小心地将纤维状的DNA钠盐沉淀捞出。 （3）加入10 mL H2O溶解沉淀。 DNA (白色纤维状沉淀) 五、注意事项

提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段，所以如果为保证DNA的完整性，各操作步骤均应较温和，避免太剧烈的振荡。

六、思考题

（1）用该方法提取DNA应注意哪些步骤？

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实验二十 DNA的定量测定

一、实验目的

学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的方法。 二、原理

核酸含量的测定方法包括紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法。本实验采用针对DNA的二苯胺法测DNA的含量。在酸性溶液中，DNA与二苯胺共热生成蓝色化合物，该物质在595nm有最大吸收，在40～400 mg/mL范围内其峰值与DNA含量成正比。

三、试剂和器材 1. 试剂

(1) DNA标准液（1000 mL，200 μg/mL）：取DNA钠盐0.2 g以0.01N NaOH溶解至1000 mL溶液。 (2) 样品液：用0.01N NaOH冲稀或用0.05 gDNA溶解至500 mL溶液。 (3) 二苯胺试剂（4000 mL）：40 g二苯胺 + 4000 mL冰乙酸+ 400 mL高氯酸；

先配100 mL 1.6%乙醛(1.6 mL原液加水至100 mL)，临用前2000 mL加20 mL。 2. 器材

可见分光光度计、恒温水浴锅、分析天平

四、操作步骤 1. 标准曲线的制作

取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值，以DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

试管

标准DNA/mL 蒸馏水/mL 二苯胺试剂/mL

0 0 2.0 4

1 0.4 1.6 4

2 0.8 1.2 4

3 1.2 0.8 4

4 1.6 0.4 4

5 2.0 0 4

DNA +

100oC

NH冰醋酸，少量硫酸

蓝色物

60 ℃恒温水浴中保温1 h，冷却，在595 nm波长处比色

光密度值

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2. 样品的测定

取待测样品2 mL，加入二苯胺溶液4 mL，摇匀，60℃保温1 h，然后在595 nm波长出测定光密度值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的DNA的μg数，按下式计算待测样品的DNA的含量。

五、注意事项

其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应尽可能除去。

六、思考题

（1）DNA含量测定的方法有哪些？各有何优缺点？ （2）简述二苯胺法测DNA的基本原理。

DNA%＝

待测样品中测得的DNA的mg数 待测样品液中样品的mg数

X 100

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实验二十一 DNA的琼脂糖凝胶电泳

一、目的

学习利用琼脂糖分离和鉴定DNA的基本原理及操作方法。 二、原理

DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子或片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。不同浓度的琼脂糖凝胶适用于不同分子质量的DNA分子或片段的分离，所需DNA样品量为0.5~1.0g。

琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶染色。溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA含量。

三、试剂与器材 1. 试剂

（1） 琼脂糖：1g 溶于TBE缓冲液中加热配成100 mL。

（2） pH 8.3，Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液）：取一小袋粉末（市售）溶于去离子水中定溶至1000 mL溶液（0.089 mol/L Tris-硼酸，0.002 mol/L EDTA，25℃时pH值8.3）。每组250 mL。 （3） 0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液：取一定量的0.1% 溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。 （4）标准DNA溶液： DNA经限制性核酸内切酶Eco R I 水解，生成的6个DNA片段。 （5） 0.5ug/ml溴化乙啶（EB）染色液：称取5 mg溴乙啶，用无离子水溶解，定容至100 mL。从中取1 mL，用无离子水稀释，定容至100 mL。（有毒，戴手套，在通风柜内进行）。 （6）DNA样品液：DNA经某种内切酶水解后，得到相对分子质量不同的小片段。 2. 器材

水平板型电泳槽、 直流稳压电泳仪、移液器、254nm波长紫外分析仪、凝胶成像系统等。

四、操作步骤 1. 琼脂糖胶液的制备

称取1 g 琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100 mL pH 8.3 Tris-硼酸EDTA缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，于110-115oC加热8-10分钟，琼脂全部融化于缓冲液中。取出摇匀，即为1%琼脂。（也可加溴化乙啶2.5 L）。 2. 凝胶板的制备

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用白色胶布将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或工作台面上（须调水平，将样品槽模板（梳子）插进托盆长边上的凹槽内（距一端约1.5 cm）。梳子底边与托盘表面保持0.5-1 mm的间隙。待琼脂糖冷至65℃左右，取25mL小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开直至在托盘表面形成一层约3 mm厚均匀胶层．液内不存有气泡．室温下静置0.5-l h。待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加入少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。

3. 取下封边的白色胶布。将凝胶连同托盘放人电泳槽平台上．用缓冲液先填满加样槽，防止槽内窝存气泡。接着再倒入大量 pH 8.3 Tris-硼酸-EDTA缓冲液直至浸没过凝胶面2-3 mm。 4. 加样

将酶解后的DNA样品液与溴酚蓝-甘油溶液以4：1的体积比混合，用微量移液器分别加入到凝胶板的加样槽内。每个槽加10 L左右，加样量不宜超过20 L，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。加样时，移液器取液嘴穿过缓冲液小心插入加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内让其集中沉于槽底部。 5. 电泳

加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防上样品扩散，样品进胶后，应控制电压降不高于5V／cm(电压值V／电泳板两极之间距离比)。 6. 染色

将电泳后的胶取出，小心推至0.5 g／mL溴化乙锭染色液中，室温下浸泡染色30 min。 7. 观察与拍照

小心地取出凝胶置于托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，然后再将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长254 nm紫外灯下进行观察，DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带。荧光在4-6小时后减弱，因此，初步观察后，应立即用凝胶成像系统扫描凝胶。

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图 凝胶托盘和样品槽模板

1. 样品槽模板（梳子） 2. 凝胶托盘 3. 凝胶

8. 制作测量分子量标准曲线

用直尺量出通过凝胶成像系统获得的电泳图上各DNA片段的迁移距离，以标准DNA酶解溶液各片段分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上连结各点划出曲线，即为DNA分子量的标准曲线。从标准曲线中即可算出样品DNA各片段的分子量。

五、注意事项

（1）溴化乙锭是DNA诱变剂，配制和使用EB染色液时，应戴乳胶手套，井且不要将该溶液洒在桌面或地面上。凡是沾污过溴化乙锭的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。 （2）为了使DNA完全酶解，需要加入适量、足够的酶液。太少反应不完全，太多则很费．由于每次购进的酶浓度不可能相同，因此，酶和DNA加入的体积不能固定，合适的酶量应该通过预试验来定。

（3）DNA酶解过程中，使用的器具都应干净，并经消毒。配制试剂需用灭菌的双蒸水，还要防止限制性内切酶被污染。

（4）加样量的多少取决于加样槽最大容积。可以采用大小不同样品糟模板以形成容积不同的加样槽。加入样品的体积应略少于加样槽容积。为此，对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。

六、思考题

1. 本实验用什么方法对电泳后核酸进行染色？操作过程中应注意哪些防护？ 2. DNA样品为什么应在加缓冲液后点样？

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实验二十二 RNA的定量测定

一、实验目的

掌握用地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。 二、原理

当RNA与地衣酚试剂在沸水中加热时，RNA被酸降解，所产生的核糖进一步转变为糠醛，它与地衣酚(3，5-二羟基甲苯)在高铁离子的催化下可反应生成绿色物，后者在670nm处有最大吸收峰，在10～100 mg/mL范围内其光密度值与RNA浓度有线形关系。

三、试剂和器材 1. 试剂

(1) 0.1 mg/mL RNA标准液（1000 mL）：取0.1 g加水至1000 mL。 (2) RNA样品液（500 mL）：取0.03 g加水至500 mL。

(3) 地衣酚试剂（2000 mL，分2瓶）：2 g三氯化铁加浓盐酸至2000 mL溶液。 临用前1000 mL加1 g地衣酚。 2. 器材

可见分光光度计、恒温水浴锅

四、操作步骤 1. 标准曲线的绘制

取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值，以DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

试管 标准RNA/mL 蒸馏水/mL 地衣酚试剂/mL

0 0 2.0 2

1 0.4 1.6 2

2 0.8 1.2 2

3 1.2 0.8 2

4 1.6 0.4 2

5 2.0 0 2

混合均匀后，置沸水浴中加热45 min，冷却，在670 nm波长处比色 光密度值

2. 样品的测定

取待测样品1 mL，加蒸馏水1 mL及二苯胺溶液2 mL，沸水浴保温45 min，冷却，然后在670 nm波长出测定光密度值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的RNA的mg数，按下式

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计算待测样品的RNA的含量。

五、注意事项

样品蛋白质含量高时，应先用5％ TCA沉淀蛋白质；有较多DNA样品时也会发生干扰，可在试剂中加适量的CuCl2. H2O， 可减少DNA的干扰。

RNA%＝

待测样品中测得的RNA的g数

待测样品液中样品的g数

× 100

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实验二十三 肌糖原的酵解作用

一、目的

1. 学习并掌握检测糖酵解作用的基本原理和方法。 2. 了解糖酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。 3. 了解有关组织代谢实验操作中应注意的关键问题。 二、原理

在动物、植物、微生物等许多生物机体内，糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行，本实验以动物肌肉组织中肌糖原的酵解过程为例，通过检测肌糖原的降解作用，阐明糖酵解的生物学机制。肌糖原的酵解作用，即肌糖原在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应最后转变成乳酸的过程。肌肉组织中的肌糖原在磷酸化酶的作用下，释放出非还原端的一个葡萄糖单位并且磷酸化生成葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸在葡萄糖磷酸变位酶的作用下转变为葡萄糖-6-磷酸。由于肌肉中缺乏葡萄糖-6-磷酸磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸不能脱磷酸生成游离葡萄糖，因此肌糖原不能直接分解成葡萄糖而提高血糖含量。葡萄糖-6-磷酸进入糖酵解过程，经过9步反应生成丙酮酸，因为组织无氧，丙酮酸不能进入三羧酸循环和呼吸链，彻底氧化成二氧化碳和水，只能在乳酸脱氢酶的作用下，生成乳酸。该过程可归纳为下列反应总式：

1/n（C6H10O5）n＋H2O→2CH3CHOHCOOH

糖原 乳酸

肌糖原的酵解作用是糖类供给生物体组织能量的一种方式。当机体剧烈运动需要大量的能量，或某些组织供氧不足时，糖原的酵解作用可暂时满足能量消耗的需要。在有氧条件下，组织内糖原的酵解作用受到抑制，而有氧氧化则为糖代谢的主要途径。

糖原酵解作用的实验，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。在用肌肉糜时，必须在无氧的条件下进行；而肌肉提取液，则可在有氧条件下进行。因为催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用（即三羧酸循环）的酶系统，则集中在线粒体中。糖原可用淀粉代替，因二者均为葡萄糖的聚合物（1-4糖苷键），只不过糖原的分支（1-6糖苷键）程度更高而已。

糖原或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成来观察，在除去蛋白质与糖以后，乳酸可以与硫酸共热变成乙醛，后者再与对羟基联苯反应产生紫罗兰色物质，根据颜色的显现而加以鉴定。

该法的特点是比较灵敏，易操作，每毫升溶液含1-5 µg乳酸即产生明显的颜色反应，但若有大量糖类和蛋白质等杂质存在，则严重干扰测定结果，因此，实验中应尽量除净这些物质。另外，测定时所用的仪器应严格地洗涤干净。

三、试剂和器材

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1. 材料 家兔的肌肉 2. 试剂

（1）0. 5%糖原溶液（或0.5%淀粉溶液）、液体石蜡、氢氧化钙（粉末）、浓硫酸、饱和硫酸铜溶液（硫酸铜20℃时的溶解度为20.7 g）。 （2）0.067mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）

A．0.067 mol/L磷酸二氢钾溶液:称取9.078 g KH2PO4，溶于蒸馏水中，于1000 mL容量瓶中定容至刻度；

B．0.067 mol/L磷酸氢二钠溶液:称取11.876g Na2HPO42H2O（或23.849g Na2HPO412 H2O），溶于蒸馏水中，于1000 mL容量瓶中定容至刻度；

将上述A液与B液按1：4的体积比混合，即成pH 7.4的缓冲液。 (3) 1.5%对羟基联苯试剂

称取对羟基联苯1.5 g，溶于100 mL 0.5%的氢氧化钠溶液中，配成1.5%的溶液。若对羟基联苯颜色较深，应用丙酮或无水乙醇重结晶，使其呈白色。此试剂长久放置后会出现针状结晶，应摇匀后使用。

(4) 20%三氯乙酸溶液。

3. 器材

试管及试管架、移液管或移液器、滴管、量筒、玻璃棒、水浴锅、电磁炉、天平、剪刀及镊子、研钵、漏斗或离心机。

四、操作方法

1. 制备肌肉糜：将家兔杀死后，立即剥皮，割取背部和腿部肌肉，在低温条件下用剪刀尽量把肌肉剪碎即成肌肉糜，低温保存备用（临用前制备）。 2. 肌肉的糖酵解：

取4支干净试管，编号后各加入新鲜肌肉糜 0.5g。1、2号管为样品管，3、4号管为空白对照管。向3、4号空白对照管内加入20%三氯乙酸3 ml，用玻璃棒将肌肉糜充分打散，搅匀，以沉淀蛋白质和终止酶的反应。然后分别向4支试管内各加入3ml磷酸缓冲液和 1 ml 0.5%糖原溶液（或0.5%淀粉溶液）。用玻璃棒充分搅匀，加入少许液体石蜡隔绝空气，并将4支试管同时放入37℃恒温水浴中保温。

1.5 h后，取出试管，立即向1、2号管内加入20%三氯乙酸3 ml,混匀。将各试管内容物分别过滤或离心(3000 r/min， 15 min)，弃去沉淀。量取每个样品的滤液5 ml，分别加入到已编号的试管中，然后向每管内加入饱和硫酸铜溶液1 ml，混匀，再加入0.5g氢氧化钙粉末，用玻璃棒充分搅匀后，放置30 min,并不时振荡，使糖沉淀完全。将每个样品分别过滤或离心(3000 r/min， 15 min)，弃去沉

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淀。

3. 乳酸的测定：

取4支洁净、干燥的试管，编号，每个试管加入浓硫酸2 ml，将试管置于冷水浴中，分别用小滴管取每个样品的滤液1滴或2滴，逐滴加入到已冷却的上述浓硫酸溶液中（注意滴管大小尽可能一致），边加边摇动试管，避免试管内的溶液局部过热。

将试管混合均匀后，放入沸水浴中煮5 min，取出后冷却，再加入对羟基联苯试剂2滴，勿将对羟基联苯试剂滴到试管壁上，混匀，比较和记录各试管溶液的颜色深浅，并加以解释。

五、注意事项

1. 对羟基联苯试剂一定要经过纯化，使其呈白色。

2. 在乳酸测定时，试管必须洁净、干燥，防止污染，影响结果。

六、思考题

1. 本实验在37℃保温前是否可以不加液体石蜡？为什么？ 2. 本实验如何检验糖酵解作用的产物？

3. 人体和动植物糖的贮存形式是什么？实验时为什么可以用淀粉代替糖原？

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实验二十三 茶叶多糖的提纯与鉴定

一、目的

1. 学习多糖分离的一般原理和方法。 2. 掌握红外光谱法鉴定多糖的原理和方法 二、原理

多糖是一类由多个单糖分子缩合失水而形成的一类天然大分子化合物。近年来，随着分子生物学和细胞生物学的发展，多糖及其缀合物作为支持组织和能量来源的传统观念早已被突破，而被认为是生物体内除核酸、蛋白质以外的又一类重要的信息分子。因此，具有生物活性的活性多糖的研究日益受到重视。它可以调节免疫功能，促进蛋白质和核酸的生物合成，调节细胞的生长，提高生物体的免疫力，具有抗肿瘤、抗癌和抗爱滋病(AIDS)等功效。

茶叶多糖是从茶叶中提取出来的、与蛋白质结合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白（以下简称TPS）。研究表明，茶叶多糖具有抗血栓、防癌、降血糖、降血脂、降血压、减慢心率、增强机体免疫功能等多种生物活性。

多糖的提取和纯化

多糖组分主要存在于其形成的小纤维网状结构交织的基质中，一般具有溶于水而不溶于醇等有机溶剂的特点，因此通常采用热水浸提后用酒精沉淀的方法对多糖进行提取。影响多糖提取率的因素很多，如：浸提温度、时间、加水量以及脱除杂质的方法等都会影响多糖的得率。

常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。

本实验采用Sevag法（氯仿：正丁醇＝4：1混合摇匀）进行脱蛋白。 多糖的分析鉴定

多糖的分析鉴定一般借助于气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、红外光谱（IR）和紫外光谱（UV）等技术，目前气相（液相）色谱—质谱（GC／HPLC—MS）联用技术已成为分析多糖更为有效的一种手段。

红外吸收光谱图中的吸收峰的数目及所对应的波数是由吸光物质分子结构所决定的，是分子结构的特性反映。因此，可根据吸收光谱图的特征吸收峰，对吸光物质进行定性分析和结构分析。红外光谱分析试样的制备技术又直接影响到谱带的波数、数目和强度。物质不同的聚集状态（气、液、固三种状态），其吸收谱图也有所差异，测定时应加以注意。

本实验利用红外光谱对多糖进行鉴定。多糖类物质的官能团在红外谱图上表现为相应的特征吸收峰，我们可以根据其特征吸收来鉴定糖类物质。O—H的吸收峰在3650-3590cm-1，C—H的伸缩振

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动的吸收峰在2962-2853cm-1，C＝O的振动峰为1510-1670 cm-1之间的吸收峰，C—H的弯曲振动吸收峰为1485-1445cm-1，吡喃环结构的C—O的吸收峰为1090cm-1。

三、试剂与器材 1、材料：粗茶叶

2、仪器：研钵（捣碎机）、200目筛、微波炉、台式离心机、恒温水浴锅、冰箱、电磁炉、Thermo紫外光谱仪、Nicolet380智能型红外光谱仪

3、试剂：蒸镏水、无水乙醇、纤维素酶、中性蛋白酶、Sevage试剂、双氧水、氨水、丙酮、乙醚、KBr

四、实验步骤

1、茶多糖的提取与纯化：

1）取茶叶适量进行研磨，过200目筛，得茶粉。

2）称取茶粉2g于250 mL烧杯，加蒸馏水20 mL，保鲜膜覆盖后置90℃水浴1h， 转移至50 mL离心管，3000 rpm离心10 min。

3） 小心转移上清液至量筒，量取体积，加无水乙醇至乙醇终浓度为75%（即3倍体积的无水乙醇），置250ml离心管以4000 rpm离心20 min。

4）弃上清，沉淀转入50 mL离心管中，加入10mL蒸馏水溶解（总体积约11-12 mL），按1：1加入Sevage试剂除蛋白（总体积约25mL), 剧烈手动振摇2 min，放气，3000 rpm 离心10 min。上层清液用一次性滴管小心吸取转移至100mL三角瓶，弃下层有机相和中间蛋白层。（可以重复加入Sevage试剂除蛋白操作直至无蛋白。）

5）上层清液用氨水调pH 8.0后置于80℃，加入等体积H2O2，保鲜膜覆盖，约半小时后溶液褪色至浅黄色。加3倍体积的无水乙醇，置于250 mL离心管，4000 rpm离心20 min。

6）弃上清，无色沉淀转移至5 mL 离心管，分别依次用适量无水乙醇、丙酮、乙醚采用离心法洗涤沉淀，最后转移沉淀至培养皿内，用冰箱保鲜层吸潮干燥，然后置于干燥箱烘干。

2、茶多糖红外光谱测定：取100 mg烘干的KBr粉末置于玛瑙研钵中，加入1-2 mg烘干的茶多糖样品磨细混匀，在红外干燥灯下烘10 min后，取约80 mg均匀填入模具中，置手压机中加压，当压力达到58.84 Mpa时保压约1 min，按手压机使用方法取出压好的直径为13 mm、厚度为0.1-0.2 mm的透明薄片，置于夹持器中。将夹持器放入预热好的仪器的试样吸收池位置，当起始透光率大于50%即可进行测量，400-4000 cm-1范围内进行红外光谱扫描。反之则应重新压片。

3、取提取的茶多糖干粉配制成100μg/mL浓度的水溶液进行190-600nm范围紫外扫描，观察其紫外光谱特性。

五、注意事项

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1、在使用有机试剂时要注意通风。

2、KBr固体试样经研磨过程会吸水。水份的存在会产生光谱干扰。若有水分存在，试样压成片时易粘附在模具上不易取下，所以研磨后粉末应烘干一段时间。

六、思考题

1. 试比较多种提取多糖的方法各有何优缺点。 2. 多糖的分离方法有哪些？各是什么原理？

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仪器的使用

722型分光光度计操作指南 （1）仪器操作键介绍

 “方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式

 “100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)  “0%T”键：用于自动调整零透射比  “波长设置”旋钮：用于设置分析波长 （2）样品测试操作

① 打开电源开关，使仪器预热20分钟

② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 ③ 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路 ④ 盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零

⑤ 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比 ⑥ 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式 ⑦ 将您的参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中

⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖 ⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零ABS

⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数 （3）实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。

核酸蛋白检测仪操作方法

1、在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。 2、接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。

3、将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100％T档。

4、按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置（即半量程5 mV），数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。

5、把层析柱的出水口接到检测仪比色池进液口，检测器出样口塑料管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为\"0\"厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100％调节光量旋钮，使记录仪指针在满量程10 mV位置时数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A\"挡，缓慢调节A调零旋钮，使记录仪指示在\"0\"位，数字显示为“0\"。

6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能作记录

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仪给出所需样品吸收的图谱。

7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。

注l:记录仪光吸收A读数

当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度)位置时即为0.25A。

注2:数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)

当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。

当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为: A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A

部分收集器的操作方法

1．将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和\"停\";使定时间为零，放开“停”按“快”或“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开\"慢\"和“定”，再按一下\"停\"设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间是否正确，则只需按一下“定”键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键(此键带锁，松开则以分显示)。

2．定位 将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺\"状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺\"状态，第一臂试臂为最内的那根。在\"逆\"状态，第一臂试管为最外的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。

离心机的使用

(1).离心机要置水平位置，以保证旋转轴垂直地球水平面。 (2).使用前应检查套环是否平衡。 (3).离心杯及其外套(离心管套)是否平衡。

(4).样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡，平衡后把它们放置于转子的对称位置。 (5).盖好盖子，打开电源开关，调整离心时间。

(6).启动离心时转速应由小至大，缓慢升速(一般要2~3min)。 (7).达到预定转速后再调整离心时间至预定时间。 (8).离心完成后要调整调速连杆至零位，同时关上电源。 (9).要等到转速为零时才能打开离心机盖，取出样品。

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附 录

一、层析法常用数据表

（一）常用的离子交换纤维素类型

类 型 阳 离 子 交 换 阴 离 子

强 酸 型弱 酸型 强碱型 弱 碱 型 交换剂名称 磷酸纤维素 甲基磺酸纤维素 乙基磺酸纤维素 羧甲基纤维素 三乙基氨基乙基纤维素 二乙基氨基乙基纤维素 氨基乙基纤维素 Ecteola纤维素 缩 写 P SM SE CM TEAE DEAE AE ECTE-OLA 解 离 基 团 －O-P3H2 -O-CH2-CH2-SO3H -O-CH2-COOH –O–CH2–CH2–N(C2H5)3 –O–CH2–CH2–N(C2H5)2 –O–CH2–CH2NH2 –N+(CH2–CH2–OH)3 交换摩尔 (mmol/g) 0.77.4 0.20.3 0.51.0 0.51.0 0.11.1 0.31.0 0.10.5 pK PK112 PK26.06.5 2.2 36 10 0.10.5 7.47.6 （二）常用的凝胶离子交换剂类型

类 型 离子交 换基团 床体积 mL/g 59 3238 分离范围 (Mr) 3×1042×105 3×1042×105 交 换 量 总交换容量 (mmol/g) 血红蛋白 g/g 0.7 2.4 0.2 7.0 0.4 9 0.3 6 强阳离子交换剂 SE–Sephadex C–25 C–50 SP–Sephadex C–25 C–50 弱阳离子交换剂 CM–Sephadex C–25 C–50 强阴离子交换剂 QAM–Sephadex A–25 A–50 –CH2CH2SO3H 2.02.5 CH2CH2CH2SO3H 2.30.3 610 3240 58 3040 3×1042×105 3×1042×105 3×1042×105 3×1042×105 4.50.5 –O–CH2COOH –O–C2H4N+(C2H5)2 –CH2CH(OH)CH3 3.0×4.0 102

弱阴离子交换剂 DEAE–Sephadex A–25 A–50

–C2H4N+(C2H5)2H 59 25–83 3×1042×105 3×1042×105 3.5×0.5 0.5 5 （三）葡聚糖凝胶的技术数据

干颗粒直径 （） 分子量分级的范围 肽及球型 蛋白质 –700 –1500 葡聚糖 (线性分子) –700 –1500 床体积/ 得水值 溶胀最少平衡 柱头压力 (厘米H2O) (mL/g干(mL/g凝时间（小时） 胶) 胶) 分子筛类型 室温 沸水浴 (2.5厘米直径柱) Sephadex G-10 Sephadex G-15 Sephadex G-25 粗级 中级 细级 超细 Sephadex G-50 粗级 中级 细级 超细 Sephadex G-75 超细 Sephadex G-100 超细 Sephadex G-150 超细 Sephadex G-200 40–120 40–120 100–300 (=50–100目) 50–150 (=100–200目) 20–80 (=200–400目) 10–40 100–300 50–150 20–80 10–40 2–3 2.5–3.5 4–6 1.00.1 1.00.1 2.500.2 3 3 6 1 1 2 1 000–5 000 100–5 000 9-11 5.00.3 6 2 1 500–30 000 500-10 000 40–120 10–40 7.50.5 24 3 40–160 3 000–70 000 1 000–50 000 12–15 40–120 10–40 4 000– 1 500 000 10.01.0 48 5 24-96 1 000-100 000 15–20 40–120 10–40 18-22 15.01.5 72 5 9-36 5 000-400 000 1 000-150 000 20–30 40–120 10–40 20-25 20.02.0 72 5 4-16 5 000-800 000 1 000-200 000 30–40 103

（四）聚丙烯酰胺凝胶的技术数据

型 号 排阻下限 （分子量） Bio-Gel-P-2 Bio-Gel-P-4 Bio-Gel-P-6 Bio-Gel-P-10 Bio-Gel-P-30 Bio-Gel-P-60 Bio-Gel-P-100 Bio-Gel-P-150 Bio-Gel-P-200 Bio-Gel-P-300 1 600 3 600 4 600 10 000 30 000 60 000 100 000 150 000 200 000 300 000 分离分级范围 （分子量） 200–2 000 500-4 000 1 000-5 000 5 000-17 000 20 000-50 000 30 000–70 000 40 000–100 000 50 000–150 000 80 000–300 000 100 000-400 000 膨胀后的床体积 (毫升/克干凝胶) 3.8 5.8 8.8 12.4 14.9 19.0 19.0 24.0 34.0 40.0 膨胀所需最少时间 (室温，小时) 2–4 2–4 2–4 2–4 10–12 10–12 24 24 48 48 注：上述各种型号的凝胶生产厂为Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, U. S. A.

（五）琼脂糖凝胶的技术数据

名称、型号 凝胶内琼脂糖百分含量(W/W) 排阻的下限 (Mr) 2.5×105 7×105 2×106 15×106 150×106 0.5×106 1.5×106 5×106 15×106 50×106 150×106 0.3×106 – 3×106 2×106 – 25×106 1×104 – 2.5×105 2.5×104 – 7×105 5×104 – 2×106 2×105 – 15×106 5×105 – 15×107 1×104 – 0.5×106 1×104 – 1.5×106 1×104 – 5×106 4×104 – 15×106 1×105 – 50×106 1×106 – 150×106 Bio-Rad Laboratories California, U. S. A. 分离分级的范围(Mr) 生产厂家 Sepharose-4B Sepharose-2B Sagavac 10 Sagavac 8 Sagavac 6 Sagavac 4 Sagavac 2 Bio-GelA-0.5M Bio-GelA-1.5M Bio-GelA-5M Bio-GelA-15M Bio-GelA-50M Bio-GelA-150M 4 2 10 8 6 4 2 10 8 6 4 2 1 Pharmacia, Uppsala Sweden Seravac Laboratories Maidenhead, England 琼脂糖是琼脂内非离子型的组分，它在0–4℃，pH4–9范围内是稳定的。

（六）各种凝胶所允许的最大操作压

凝 胶 Sephadex G-10 G-15 G-25 G-50 建议的最大静水压(cmH2O) 100 100 100 100 104

Sephadex G-75 Sephadex G-100 Sephadex G-150 Sephadex G-200 Bio-Gel P-2 P-4 P-6 P-10 P-30 P-60 Bio-Gel P-100 Bio-Gel P-150 Bio-Gel P-200 Bio-Gel P-300 Sepharose 2B 4B Bio-Gel A-0.5M A-1.5M A-5M Bio-Gel A-15M Bio-Gel A-50M Bio-Gel A-150M a. 每厘米凝胶长度 50 35 15 10 100 100 100 100 100 100 60 30 20 15 1a 1 100 100 100 90 50 30

105

二、固体硫酸铵添加量与浓度（％饱和度）的关系表 (25°C)

0 10 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 （八）固体硫酸铵添加量与浓度（％饱和度）的关系表 (0°C)

10 20 25 30 56 114 57 134 86 57 176 118 86 30 硫酸铵的最终浓度 33 35 40 45 50 55 60 65 向1升溶液中加入的固体硫铵克数 196 209 243 277 313 351 390 430 137 150 183 216 251 288 326 365 118 137 150 183 216 251 288 326 49 61 93 125 158 193 230 267 19 30 62 94 127 162 198 235 12 43 74 107 142 177 214 31 63 94 129 164 200 31 63 97 132 168 31 63 97 132 33 66 101 33 66 34 70 75 80 90 100 472 406 365 307 273 252 238 205 168 137 101 69 34 516 449 406 348 314 292 278 245 205 176 137 105 70 35 561 494 449 390 356 333 319 285 245 214 176 143 107 72 36 662 592 494 485 449 426 411 375 285 302 214 227 190 153 115 36 767 694 592 583 546 522 506 469 375 392 302 314 275 237 198 115 79 硫胺的起始浓度（％饱和度）

106