【CN109897918A】鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法【专利】

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109897918 A(43)申请公布日 2019.06.18

(21)申请号 201910275066.4(22)申请日 2019.04.08

(66)本国优先权数据

201810886680.X 2018.08.06 CN(71)申请人 北京市水产技术推广站

地址 102600 北京市大兴区北京经济开发

区科创十四街99号1幢(72)发明人 张文　徐立蒲　吕晓楠　(74)专利代理机构 天津合正知识产权代理有限

公司 12229

代理人 吕琦(51)Int.Cl.

C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)

(54)发明名称

鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法(57)摘要

本发明公开了一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，该方法包括以下步骤：第一、合成引物与TaqMan探针：根据

上游引CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，

物第1个碱基改为简并碱基W，下游引物第1个碱基改为简并碱基R；根据KHV ORF7基因保守序列，设计1对特异性引物和1条TaqMan探针；分别使用FAM和VIC作为探针报告基团，BHQ1作为探针淬灭基团；第二、确定反应体系及条件：采用20μL反应体系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L～0.8μmol/L之间，QN ROX参考染料0.1μL，模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。

权利要求书1页 说明书7页序列表1页 附图4页

CN 109897918 ACN 109897918 A

权　利　要　求　书

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1.一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一、合成引物与TaqMan探针：根据CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，上游引物第1个碱基改为简并碱基W，下游引物第1个碱基改为简并碱基R；根据KHV ORF7基因保守序列，设计1对特异性引物和1条TaqMan探针；分别使用FAM和VIC作为探针报告基团，BHQ1作为探针淬灭基团；

第二、确定反应体系及条件：采用20μL反应体系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L～0.8μmol/L之间，QN ROX参考染料0.1μL，模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。

2.如权利要求1所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，反应体系确定为：2×Probe PCR Master Mix 10μL，CEV上、下游引物终浓度0.6μmol/L，探针终浓度0.3mol/L，KHV上、下游引物终浓度0.4μmol/L，探针终浓度0.2μmol/L，QN ROX参考染料0.1μL；模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，56℃退火31s，40个循环。

3.如权利要求2所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，根据CEV P4a基因序列对引物序列进行优化后的CEV-R序列为RATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA。

4.如权利要求3所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，根据CEV P4a基因序列对引物序列进行优化后的CEV-F序列为WGTTTTGTAKATTGTAGCATTTCC。

5.如权利要求4所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，探针CEV-Probe序列为FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ1。

6.如权利要求2所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，根据KHV ORF7基因保守序列设计的引物KHV-R序列为CACGGATCTTCTATGCTACA。

7.如权利要求6所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，根据KHV ORF7基因保守序列设计的引物KHV-F序列为TTGTTGTGCGTTGATGTTC。

8.如权利要求7所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，探针KHV-Probe序列为VIC-CTTGACGGCACTCGTCGAGCCGTAGCCC-BHQ1。

9.如权利要求1所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法对CEV和KHV的灵敏度为15copies/μL。

10.如权利要求1所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法与单重实时荧光定量PCR扩增所获得的Ct值的变异系数小于3％。

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鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法

技术领域

[0001]本发明涉及一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，属于鱼类病毒检测技术领域。

背景技术

[0002]鲤和锦鲤是我国具有重要市场价值的品种，随着养殖规模的不断扩大，鱼类疫病也频繁出现。其中，鲤浮肿病毒(Carp edema virus，CEV)和锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus，KHV)都可以感染鲤和锦鲤，对水产养殖产业造成严重危害。CEV是一种线性双链DNA，属于痘病毒，大小约为200nm×400nm。KHV也为双链DNA，属疱疹病毒，是直径167～200nm的二十面体，有囊膜。以上两种病毒均只感染鲤和锦鲤，且引起的临床症状极其相似，包括烂鳃、眼球凹陷、食欲不振、体表出血等，死亡率高达80％～100％。因此，在养殖生产中，当鲤或锦鲤出现凹眼、烂鳃等症状，并有高死亡率时，现场依靠发病症状和流行特点很难区分这两种病毒病，需进一步进行实验室检测。

[0003]分子生物学方法是实验室最常用的检测CEV和KHV的方法。现有技术中通常采用由英国CEFAS建立、Matras等公布的单重荧光定量PCR法检测CEV，采用SC/T 7212.1-2011行业标准检测KHV，由于CEVD和KHVD临床症状极其相似，往往需要针对同一样品分别检测CEV和KHV这两种病原，耗时较长。实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强和重复性好等优点,已逐渐成为动物病原检测的重要方法。目前，尚未见应用双重实时荧光定量PCR技术同时检测CEV和KHV的相关报道。

[0004]CEV和KHV已经成为危害国内外鲤和锦鲤养殖产业的重要病原。鲤和锦鲤养殖具有重要的经济价值和市场价值，目前，对CEVD和KHVD并没有有效的治疗措施，尽快确诊病原，尽早切断传播途径对降低经济损失有重要作用。[0005]目前，诊断CEV主要依靠分子生物学检测方法，还没有筛选到能够稳定易感CEV的敏感细胞系。Oyamatsu等和英国CEFAS建立的套式PCR都存在漏检现象。英国CEFAS建立的实时荧光定量PCR是目前最适用于检测CEV的方法，更适用于CEV的常规监测。针对KHV的敏感细胞系已有大量报道，例如锦鲤鳍细胞(Koi fin cells，KFC)、鲤鱼脑细胞(Common carp brain cells，CCB)、锦鲤鳃细胞系(The gill of koi，KoG)等，但通常需要传代3～5次，分离培养时间较长，且首次分离成功的很少，故普通PCR检测方法依然是诊断KHV首选，但相对于实时荧光定量PCR法来说，耗时较长，检测操作步骤较多。单重实时荧光定量PCR方法对CEV和KHV的检测已得到较广泛的应用。

发明内容

[0006]本发明为了解决上述问题，提供一种新型的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，该方法能够同时检测CEV和KHV，提高了检测效率，在样品量非常大时具有很大优势。

[0007]本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法包括以

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下步骤：

[0008]第一、合成引物与TaqMan探针：[0009]根据CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，上游引物第1个碱基改为简并碱基W，下游引物第1个碱基改为简并碱基R；根据KHV ORF7基因保守序列，设计1对特异性引物和1条TaqMan探针；分别使用FAM和VIC作为探针报告基团，BHQ1作为探针淬灭基团；[0010]第二、确定反应体系及条件：[0011]采用20μL反应体系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L～0.8μmol/L之间，QN ROX参考染料0.1μL，模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。[0012]优选地，反应体系确定为：2×Probe PCR Master Mix 10μL，CEV上、下游引物终浓度0.6μmol/L，探针终浓度0.3μmol/L，KHV上、下游引物终浓度0.4μmol/L，探针终浓度0.2μmol/L，QN ROX参考染料0.1μL；模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，56℃退火31s，40个循环。[0013]在一个实施例中，根据CEV P4a基因序列对引物序列进行优化后的CEV-R序列为RATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA。[0014]在一个实施例中，根据CEV P4a基因序列对引物序列进行优化后的CEV-F序列为WGTTTTGTAKATTGTAGCATTTCC。[0015]在一个实施例中，探针CEV-Probe序列为FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ1。

[0016]在一个实施例中，根据KHV ORF7基因保守序列设计的引物KHV-R序列为CACGGATCTTCTATGCTACA。[0017]在一个实施例中，根据KHV ORF7基因保守序列设计的引物KHV-F序列为TTGTTGTGCGTTGATGTTC。[0018]在一个实施例中，根据KHV ORF7基因保守序列设计的探针KHV-Probe序列VIC-CTTGACGGCACTCGTCGAGCCGTAGCCC-BHQ1。

[0019]本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法对CEV和KHV的灵敏度为15copies/μL。

[0020]本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法与单重实时荧光定量PCR扩增所获得的Ct值的变异系数小于3％。[0021]与现有技术相比，本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法的有益效果在于：灵敏度高、特异性好，与其他病毒无交叉反应；临床试验结果表明，该方法的结果与实验室常规检测结果一致，针对混合感染样品可特异的检出感染病原，适用于实验室对CEV和KHV的常规检测，可为CEVD和KHVD两种常见鱼类疫病的快速诊断提供必要的技术支撑。

附图说明

[0022]图1a是CEV的敏感性曲线。[0023]图1b是CEV的标准曲线。[0024]图2a是KHV的敏感性曲线。

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图2b是KHV的标准曲线。图3是特异性试验曲线。图4是Real-time PCR组内重复性试验获得的目标扩增曲线。

具体实施方式

[0028]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0029]本发明所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：

[0030]第一、合成引物与TaqMan探针：根据Matras等公布的CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，上游引物第1个碱基改为简并碱基W，下游引物第1个碱基改为简并碱基R；根据GenBank中KHV ORF7基因保守序列，应用Primer 6.0软件设计1对特异性引物和1条TaqMan探针；分别使用FAM和VIC作为探针报告基团，BHQ1作为探针淬灭基团(见表1)。引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成。[0031]表一 引物和TaqMan探针序列

[0032]

第二、确定反应体系及条件：[0034]采用20μL反应体系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L～0.8μmol/L之间，QN ROX参考染料0.1μL，模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。[0035]为了确定最佳引物浓度配比和反应程序，本申请采用多种毒株，进行了大量的特异性试验、重复性试验、干扰性试验，并采用本申请建立的双重实时荧光定量PCR方法，检测本实验室鉴定保存的13份CEV阳性样品、7份KHV阳性样品，评价该方法的可靠性。[0036]本申请采用的毒株包括鲤浮肿病毒(Carp edema virus，CEV)、锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus，KHV)、金鱼造血器官坏死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV)、流行性造血器官坏死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis，EHNV)、蛙虹彩病毒(Bohle iridovirus，BIV)、斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus，CCV)，由北京市水产技术推广站鉴定保存，白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)标准品购自中国水产科学研究院黄海水产研究所。

[0037]本申请采用的DNA抽提试剂盒、荧光QuantiNovaTM Probe PCR Kit试剂盒均购自

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QIAGEN公司；DNA扩增试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；AB 7500荧光定量PCR仪购自Life Technologies公司。[0038]制备标准品：

[0039]参照DNA抽提试剂盒说明书，提取鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的DNA，送至北京天成新脉生物技术有限公司，合成CEV P4a基因序列(528bp)和KHV ORF7基因序列(484bp)，分别克隆到pEASY-T1载体和PUC57-Kan载体上，构建CEV-P4a和KHV-ORF7标准质粒，根据质粒浓度计算拷贝数。

[0040]双重实时荧光定量PCR反应条件及引物浓度优化：[0041]浓度为1.5×107copies/μL的质粒CEV-P4a和KHV-ORF7混合液作为标准品，采用20μL反应体系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，应用矩阵法对引物浓度进行最佳配比和筛选，将上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L～0.8μmol/L之间调整，QN ROX参考染料0.1μL，模板2.5μL，DEPC水补足20μL。反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。根据荧光PCR结果曲线和Ct值确定最佳引物浓度配比和反应程序。[0042]敏感性试验与标准曲线的建立：

[0043]对质粒CEV-P4a和KHV-ORF7进行10倍系列稀释，将相同稀释倍数的质粒充分混合作为模板，按照已优化好的双重实时荧光定量PCR反应条件进行扩增，建立标准曲线。[0044]特异性试验：

[0045]分别以3.0×105copies/μL的质粒CEV-P4a或KHV-ORF7作为模板，同时加入CEV和KHV的引物和探针，按照优化好的反应条件进行二重单检的实时荧光PCR扩增，每个样品孔同时收集FAM和VIC两种荧光信号，确定该方法的引物与探针在CEV和KHV之间的特异性。采用本申请建立的方法，对GFHNV、EHNV、CCV等DNA病毒进行特异性验证。[0046]重复性试验：

[0047]将浓度为3.0×105copies/μL的CEV-P4a和KHV-ORF7质粒等体积混合，获得1.5×105copies/μL的质粒混合液作为模板，分为5个标本同时检测。在第4天、第7天重复检测保存于-20℃的模板，通过计算Ct值的标准差(S)和变异系数(CV)验证本申请的方法的批内重复性和批间重复性。[0048]干扰性试验：

[0049]将质粒CEV-P4a和KHV-ORF7按不同浓度进行组合(3.0×107和3.0×101；3.0×101和3.0×107)，分别进行单重和双重荧光定量PCR检测，确定当模板浓度相差较大时CEV和KHV之间的检测是否存在干扰现象。[0050]临床样品检测应用：

[0051]采用本申请建立的双重实时荧光定量PCR方法，检测本实验室鉴定保存的13份CEV阳性样品、7份KHV阳性样品，评价该方法的可靠性。[0052]反应体系及条件的优化：

[0053]通过对引物及探针浓度的筛选及退火温度的优化，最佳反应体系确定为：2×Probe PCR Master Mix 10μL，CEV上、下游引物终浓度0.6μmol/L，探针终浓度0.3μmol/L，KHV上、下游引物终浓度0.4μmol/L，探针终浓度0.2μmol/L，QN ROX参考染料0.1μL.模板2.5μL，DEPC水补足20μL。反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，56℃退火31s，40个循环。

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敏感性试验结果及标准曲线的建立：

[0055]以10倍系列稀释的CEV-P4a或KHV-ORF7质粒混合液(1.5×107～1.5×101copies/μL)作为模板，进行双重实时荧光定量PCR扩增，结果见图1a、图1b、图2a和图2b。图1a和图2a中附图标记1-7表示1.5×107拷贝/μL～1.5×101拷贝/μL，附图标记8表示空白对照。[0056]图1至图4中，阈值：荧光扩增曲线上仪器自动设定或人为设定的一个值，一般是PCR扩增的3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，在PCR扩增的指数期。[0057]Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

[0058]Rn:是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值；[0059]△Rn：是Rn扣除基线后得到的相对荧光值(△Rn＝Rn-基线)；[0060]基线：在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线就是基线。

[0061]本申请的方法最低能检测到的CEV浓度为1.5×101copies/μL，以质粒拷贝数的lg值为横坐标，Ct为纵坐标建立标准曲线，回归方程为：y＝-3.4551x+38.76；该方法最低能检测到的KHV浓度为1.5×101copies/μL，以质粒拷贝数的lg值为横坐标，Ct为纵坐标建立标准曲线，回归方程为：y＝-3.5287x+39.099。结果表明本申请建立的方法对CEV和KHV的灵敏度为15copies/μL。

[0062]特异性实验结果：

[0063]当反应体系中只加入CEV或KHV基因组DNA作为模板，采用本申请建立的方法进行PCR扩增时，结果只得到相应模板的特异性荧光曲线，表明引物及探针在这两种病毒间具有特异性。对GFHNV、EHNV、CCV等阳性核酸的扩增结果显示，这几种DNA病毒、阴性对照以及空白对照均不能产生扩增曲线，呈现阴性结果，见图3，表明本申请建立的双重实时荧光定量PCR法具有良好的特异性。图3中，1为鲤浮肿病毒；2为锦鲤疱疹病毒；3为金鱼造血器官坏死病毒；4为流行性造血器官坏死病毒；5为蛙虹彩病毒；6为斑点叉尾鮰病毒；7为白斑综合征病毒；8为虾肝肠胞虫；9为空白对照。[0064]重复性试验结果：[0065]以1.5×105copies/μL的质粒混合液作为模板，进行批内重复性试验，结果5个平行样品均获得目标扩增曲线，见图4。图4中1～5为1.5×105拷贝/μL CEV；6～10为1.5×105拷贝/μL KHV；11为空白对照。CEV的SD为0.10，CV为0.49﹪；KHV的SD为0.13，CV为0.66﹪，见表2。第4、7天后进行批间重复性试验，CEV的SD为0.10，CV为0.52％；KHV的SD为0.13，CV为0.67％，见表3。结果表明，本申请建立的双重实时荧光定量PCR法具有良好的重复性。[0066]表2组内重复性试验

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表3组间重复性试验

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干扰性试验结果：

[0071]将质粒CEV-P4a和KHV-ORF7按不同浓度进行组合进行荧光定量PCR检测，发现当两种模板浓度相差很大时，本申请的方法依然能够检出低浓度模板，且与单重实时荧光定量PCR扩增所获得的Ct值的变异系数小于3％，见表4。[0072]表4干扰性试验结果

[0070][0073]

临床样品应用检测结果：

[0075]采用本申请建立的CEV和KHV双重实时荧光定量PCR法，对经单重PCR检测阳性的13份CEV样品和采用SC/T 7212.1-2011行业标准检测阳性的7份KHV样品进行扩增，结果13份CEV阳性样品在FAM荧光通道均有特异的荧光曲线和Ct值，在VIC荧光通道无扩增曲线和Ct值，且病毒浓度为1.05×102—7.09×104copies/μL。7份KHV阳性样品在VIC荧光通道均有特异性的荧光曲线和Ct值，病毒浓度为3.91×102—3.02×105copies/μL，在FAM荧光通道6份样品无扩增曲线和Ct值；1份样品有特异的荧光曲线和Ct值，且病毒浓度为5.6×104copies/μL。

[0076]本申请根据Matras等公布的CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，合成1对特异性引物和1条TaqMan探针；根据KHV ORF7基因保守序列，设计筛选1对特异性引物和1条TaqMan探针。引物序列间无相互干扰，通过矩阵法筛选出了CEV和KHV的最佳引物和探针浓度组合，优化反应条件，成功建立双重实时荧光定量PCR方法，大大缩短了检测时间，全程约需1.5h，与用单重荧光定量PCR分别检测两种病毒相比，减少1.5h，与普通PCR相比则减少约4h；本申请的方法具有较高的敏感性，可检测到15copies/μL的CEV或KHV；具有良好的特异性，不与其它病毒发生交叉反应；由于扩增产物不需电泳，则有效避免普通PCR方法可能产生的气溶胶污染风险。

[0077]临床样品检测结果表明，有1份KHV阳性样品也为CEV阳性。经查，该样品为2015年由本实验室采集，由于实验室是2016年后开始开展大量CEV相关研究，并未对2016年之前的样品进行CEV复检，因此针对该样品只进行了KHV鉴定。采用单重实时荧光定量PCR对该样品进行扩增，有明显扩增曲线和Ct值，为CEV阳性，表明本申请建立的双重实时荧光定量PCR方法检测结果与实验室常规方法结果一致。通过对临床样品的检测证明CEV和KHV在临床上确实有混合感染的情况发生。在同一样品中两种病原的含量可能相差较大，本申请通过干扰

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性试验，探讨当模板浓度相差较大时，高浓度模板对低浓度模板是否存在干扰现象。结果表明，当两种模板浓度相差很大时，本申请的方法依然能够检出低浓度模板，且与单重实时荧光定量PCR扩增所获得的Ct值的变异系数小于3％。[0078]综上，本申请建立的双重实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性好，与其他病毒无交叉反应；临床试验结果表明，该方法的结果与实验室常规检测结果一致，针对混合感染样品可特异的检出感染病原，适用于实验室对CEV和KHV的常规检测，可为CEVD和KHVD两种常见鱼类疫病的快速诊断提供必要的技术支撑。[0079]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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图1b

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图2a

图2b

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图3

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说　明　书　附　图

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图4

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