肿瘤学杂志２００８年ｌ０月第１３卷笫１ 朔Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｏｃｔ．２００８，Ｖｏ１．１３＿，Ｎｏ．１０ ・８７１・ ＭＴＴ肿瘤药物敏感试验的方法学研究 １００７００北京 北京军区总医院中心实验科 魏文青，赵满仓，刘 晶，焦娟，张艳，付瑶 【摘要】 目的：对ＭＴＴ法肿瘤药物敏感试验的方法进行选择，旨在建立一种ＭＴＴ肿瘤药敏试验的规范化操作流程。 方法：Ｍ．ｒｒ法测定Ｋ５６２细胞对抗癌药卡铂与紫杉醇的敏感性实验及其影响因素。结果：在每孑Ｌ Ｋ５６２细胞数为５×１０ （浓度 为５×１０ 个／ｍ１）、药物作用时间４８ｈ、ＭＴＦ ２０ｔｒｌ作用６ｈ、单波长５７０ｎｍ处测ＯＤ值时，药物对肿瘤细胞的抑制率较高，实验效 果较好。结论：规范化的ＭＴＦ肿瘤药敏试验可以为临床医师开展和实现化疗个体化提供较为可靠的实验依据。 【关键词】肿瘤；化学治疗；Ｋ５６２细胞株；Ｍ１Ｔｒ法 中图分类号：Ｒ７３０．５３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９—０４６０（２００８）１０—０８７１—０４ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｉ—ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＭＴＴ ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ＷＥｌ Ｗｅｎ—ｑｉｎｇ，ＺＨＡＯ Ｍａｎ—ｅａｎｇ，ＬＩＵ ｉｎｇ，ＪｌｒＡ０ Ｊｕａｎ．ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ，ＦＵ Ｙａｏ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＣｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏ— ｒｙ，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｃｏｍｍａｎｄ，Ｂｅｉｉｆｎｇ １００７００，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ａｎｔｉ—ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ＭＴＹ ａｓｓａｙ ｂｙ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｓｏｍｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ＭＴＴ ａｓｓａｙ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｋ５６２ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｔｏ ａｎｔｉ—ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅ１．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａ ｂｅｔｔｅｒ ｒｅｓｕｌｔ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｗｅｌｌ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ５×１０ Ｋ５６２ ｃｅｌｌｓ，ａｎｔｉ— ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ ｃｏｎｔａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ４８ｈ，２０１ｘｌ Ｍ Ｔｒｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５ｍｇ／ｍ１）ｗａｓ ａｄｄｅｄ ａｎｄ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｆｏｒ ６ｈ，ａｎｄ ｔｈｅ叩一 ｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｔ ５７０ｎｍ ｓｉｎｇｌｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａ ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍ１Ｔｒ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｎｔｉ—ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｉｇｈｔ ｐｒｏｖｉｄｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． 【Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ】Ｔｕｍｏｒ； Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ； Ｋ５６２ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ； ＭＴＴ ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ 化学治疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一。近 为临床工作的开展和实现个性化化疗及临床的推广 应用提供可靠的实验依据。 １材料与方法 年来，化疗药物的敏感试验越来越引起医学工作者 的重视。目前，化疗对某些恶性肿瘤的治疗虽然已 有明显疗效，但对部分患者的治疗效果仍不理想。 即使是同一组织类型、分化程度相同的肿瘤，对同一 药物的敏感程度也存在较大差别。因此，在化疗前 进行药物敏感试验测定显得尤为重要 １－３］。目前国 １．１ 材料ＭＴＦ［溴化一３－（４，５－二甲基一２一噻唑基）一 ２，５一二苯基四氮唑］为美国Ｓｉｇｍａ产品，用０．０１ｍｏｌ／ 内外建立起来测定肿瘤细胞的敏感试验方法较多， 常见的有裸鼠肾包膜下肿瘤移植法、集落法、同位素 掺人法、流式细胞仪法、ＭｒＩＴＩ’法 Ｊ、ＡＴＰ 生物荧光 Ｌ ＰＢＳ配成５ｍｇ／ｍｌ，除菌４℃避光备用；ＲＰＭＩ一１６４０ 培养基，购美国Ｇｉｂｉｃｏ公司；二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）购 自北京化学试剂公司；抗癌药卡铂（ＣＢＰ）、紫杉醇 法等体内外实验方法，这些方法各有其优缺点，到日 前为止，这些检测方法都没有形成标准化，多数实验 室都是根据测定经验进行相应的测试。为此，我们 在众多的实验方法中选择了Ｍ１Ｔｒ方法进行深入的 探讨，并对实验中的药物浓度、细胞浓度、加药时间、 （ＴＡＸ）分别为齐鲁制药有限公司、海口市制药厂有 限公司产品；ＧＫＮ溶液由本室配制；４８孔、９６孔细 胞培养板为天津有机玻璃制品厂产品；ＤＮＭ９６０６型 酶联免疫检测仪为北京普郎产品；Ｋ５６２细胞株由军 事医学科学院动物中心惠赠。 １．２ 实验方法 培养时间进行了选择，旨在建立一种Ｍ１Ｔｒ肿瘤药敏 试验的规范化流程，使其达到相对标准化、合理化， １．２．１实验步骤 将处于对数生长期的Ｉ＜５６２细 胞分别稀释成不同浓度，加人到４８孔细胞培养板 ・８７２・ 志２００８年ｌ０月第１３卷第１０期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏ￣￣，Ｏｃｔ．２００８．ＶｏＩ．１３．Ｎｏ．１０ 中，每孔ｌＯ０１ｘｌ，然后每孔加入抗癌药物２０１￣１，置 紫杉醇浓度为８ｏ￣ｇ／ｍｌ时，Ｋ５６２细胞数浓度为５．０ ３７℃、５％ＣＯ 孵箱中，培养一定时问，加ＭＴｒ溶液， 每孔２０１￣１，继续培养一定时间后，离心１ ０００ ｒｐｍ， ×１０ 个／ｍｌ时，抑制率为（８６．１±５．４）％；卡铂浓度 为１６ｏｐ．ｇ／ｍｌ，Ｋ５６２细胞数浓度为５．０×１０ 个／ｍｌ １５ｒａｉｎ，弃上清，轻轻扣板于滤纸上，吸去多余液体。 每孔加入ＤＭＳＯ ｌＯ０１ｘ］，振荡混匀后，于ＤＮＭ９６０６型 酶标分析仪，在单波长５７０ｎｍ处测其ＯＤ值，计算 结果。 １．２．２药物和细胞浓度的选择用棋盘滴定法筛 选其浓度，将抗癌药卡铂和紫杉醇分别用生理盐水 稀释成浓度为３２０、１６０、８０、４０、２Ｏ、１０、５、２．５、 １．２５ ｍｌ，取２０１ｘｌ加入９６孔培养板中，每一竖排 一个浓度。取对数生长期Ｋ５６２细胞用培养液稀释 成浓度为１．６×１０。、８．０×１０ 、４．０×１０ 、２．０×１０ 、 １．０ Ｘ １０ 、５．０×１０ 、２．５×１０ 和１．２×１０ 个／ｍｌ，制 备成单细胞悬液，吸取１００１￣１加入上述９６孔培养板 中，每个细胞数浓度加一横排。置３７￣Ｃ、５％ＣＯ：孵 箱中培养４８ｈ，然后每￣ｔ，ＪＪｕ入２０ＩＸ］ＭＴ１１溶液，进行 培养６ｈ，离心弃上清，在每￣ｔ，ＪＪＮ入１００１￣１ ＤＭＳＯ，测 其ＯＤ值，计算抑制率。 １．２．３ 培养时间的选择 抗癌药物试验浓度按照 常规剂量血液峰值配制，卡铂为２５ｏ￣Ｌｇ／ｍｌ、紫杉醇 为ｌＯ０１ｘｇ／ｍｌ。选用对数生长期Ｋ５６２细胞，调整细 胞数浓度为５．０×１０ 个／ｍｌ。实验分两组，第一组， 每孔先加２０１ｘｌ药物，再加ｌＯ０１ｘｌ细胞，培养２、４、８、 １６、２４、３２、４Ｏ、４８、５６和６４ｈ后，按照上述１．２．２方 法进行测定；第二组，细胞培养板中每孔先加ｌＯ０ｔｘｌ 细胞，２ｈ后待细胞贴壁后，再加２０１ｘｌ药物，其他培 养条件同第一组。 １．２．４ ＭＴｒ孵育时间的选择按照常规的测定方 法，选取卡铂２５０ ｍｌ、紫杉醇１００ ｎ１１、细胞数浓 度５．０×１０ 个／ｍｌ，加入每孑Ｌ细胞培养板中，分别于培 养２、４、８、ｌ６、２４、３２、４０、４８、５６和６４ｈ后再加入ＭＴｒ 溶液，并于加ＭＴＩ＂溶液后２、４、６、８、１２和２４ｈ离心弃 上清，加１００ ＤＭＳＯ，测其ＯＤ值，计算抑制率。 １．３ 实验结果计算抑制率＝（１一药物ＯＤ值／对 照ＯＤ值）Ｘ １００％；抑制率≥３０％判定药物敏感试 验为阳性，反之为阴性。 １．４统计学分析将实验数据输人计算机用Ｅｘｃｅｌ 建库经ＳＡＳ ６．１２版软件进行分析，采用方差分析和 ｔ检验。 ２结果 ２．１ 药物和细胞浓度的选择经棋盘滴定法筛选， 时，抑制率为（３０．９±３．８）％。见图１、图２。 １０ｏ ８Ｏ ６０ ４Ｏ ２０ Ｏ １．２５ ２．５ ５．０ ｌ０ ２０ ４０ ８０ １６０ ３２０ ６４０ 药物浓度（￣ｇ／ｍ１） 系列１～８：Ｋ５６２细胞数浓度分别为１．６ Ｘ １０ 、８．０ Ｘ １０ 、４．０ Ｘ １０ 、２．０ Ｘ １０ 、１．０×１０ 、５．０ Ｘ １０ 、２．５×１０ 、１，２×１０ Ｊ￣／ｒｎｌ 图１ 紫杉醇对Ｋ５６２细胞的抑制率 ３５ ３０ ２５ ２Ｏ 些１５ １０ ０ １－２５ ２．５ ５．０ １０ ２０ ４Ｏ ８０ ｌ６Ｏ ３２０ ６４Ｏ 药物浓度ｆ￣Ｌｇ／ｍ１） 系列１～８：Ｋ５６２细胞数浓度分别为１．６ Ｘ １０ 、８．０×１０ 、４．０× １０ 、２．０×１０ 、１．０ Ｘ１０ 、５．０ Ｘ１０ 、２．５ Ｘ１０ 、１．２×１０ 个／ｍｌ 图２卡铂对Ｋ５６２细胞的抑制率 ２．２ 培养时间的选择 配制卡铂浓度为２５ｏ￣．ｇ／ ｍｌ、紫杉醇为ｌＯ０￣Ｌｇ／ｍｌ，选用对数生长期Ｋ５６２细 胞，调整细胞数浓度为５．０×１０ 个／ｍｌ进行分组实 验。一组先加肿瘤细胞，然后再加抗肿瘤药物，设为 贴壁组。另一组是先加抗肿瘤药物，然后再加肿瘤 细胞，设为先加药组，观察两者的区别。结果显示： 培养刚开始时，贴壁组的抑制率略高于先加药组， ８ｈ后两组的抑制率基本一致。随培养时间的延长， 抑制率呈上升趋势，两组均在培养时间为４８ｈ时，抑 制率达最高值。４８ｈ后抑制率呈下降趋势。故选择 药物作用时间为４８ｈ。见表１。 ２．１．３ Ｍ１Ｔｒ孵育时问的选择 药物浓度卡铂 ２５ｏ￣ｇ／ｍｌ、紫杉醇ｌＯ０１￣ｇ／ｍｌ；细胞数浓度５．０ Ｘ １０ 个／ｍｌ，培养４８ｈ后加入Ｍ１Ｔｒ，设置Ｍ１Ｔｒ培养时间点 为２、４、６、８、ｌ２和２４ｈ，测定抑制率。结果显示，ＭＴｒ 孵育６ｈ内，抑制率呈上升趋势，６ｈ达最高，然后呈 平缓。可选择ＭＴＩ＂孵育时问为６ｈ。见表２。 ｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｏｃｔ．２００８，Ｖｏ１．１３，Ｎｏ．１０ ｈｉｎｅｓｅＣｌｉ：２００８年１０月第１３卷第ｌＯ期 Ｃ・８７３・ 表１ Ｍｑｑ＇法不同培养时间的抑制效果（％，ｎ：３） ２ｈ ４ｈ ＣＢＰ ＴＡＸ ＣＢＰ ＴＡＸ ＣＢＰ ＴＡＸ ＣＢＰ ＴＡＸ ＣＢＰ ＴＡＸ ＣＢＰ ＴＡＸ 注：ｉ：均数；ｓ：标准差 ３讨论 我们对细胞培养液的类型、细胞加样量、药物加样 量、ＭＴＴ加样量、ＤＭＳＯ加样量、显色时间、测定波长 等实验条件进行了优化。 Ｋ５６２接种细胞数浓度为５．０×１０ 个／ｍｌ时，抑 肿瘤组织的异质性较强，不同类型肿瘤对同一 化疗药物敏感性不同，即使同一肿瘤不同个体对同 一种化疗药物敏感性也可能不同，这与肿瘤生物学 制效果最好。通过研究发现，传代细胞所需的接种 细胞数目少于原代培养细胞，用肿瘤患者的外周血 单核细胞（ＰＢＭＣ）或肿瘤细胞接种时，应适当增加 细胞数浓度，一般以５～６×１０ 个／ｍｌ效果最佳。对 于不同类型的细胞，其需要接种细胞的浓度是不一 样的，接种细胞数太多，敏感性降低，而太少则观察 不到差异，所以需要通过实验来确定细胞接种浓度。 培养时问的选择。配制卡铂浓度为２５０￣ｇ／ｍｌ、 紫杉醇为￣ｏｏｗｇ／ｍｌ，选用对数生长期Ｋ５６２细胞，调 特性、患者个体差异、药物本身的毒性反应等因素有 关。因此，在临床上用同一种化疗药物或同一个化 疗方案治疗不同的肿瘤患者，显然带有一定的盲目 性，因此针对不同患者进行肿瘤细胞药物敏感试验 来选择有效化疗药物进行化疗显得十分必要。。’ 。 Ｍ１Ｔｒ法是一种广泛使用的药敏试验方法，８０年 代中期开始用于急性白血病的临床指导用药，取得 了良好的疗效，目前己逐步应用到肺癌、卵巢癌、肝 癌、乳腺癌等实体肿瘤的治疗中，提高了药物的选择 整细胞数浓度为５．０×１０ 个／ｍｌ进行实验。随培养 时间的延长，抑制率呈上升趋势，两组均在培养时问 性，提高了化疗质量和化疗个体化效果 。但在 Ｍ１Ｔｒ的应用过程中，出现了一些实际应用问题，主 为４８ｈ时，抑制率达最高值，４８ｈ后抑制率呈下降趋 势，故选择药物作用时问为４８ｈ。１００～２００￣１的培 养液对于细胞数浓度５．０×１０ 个／ｍｌ的接种细胞， 很难维持６０ｈ，如果营养不够的话，细胞会由增殖期 要表现在ＭＴＦ方法学上尚没有一个公认的统一的 技术顺序，各研究机构采用的药物浓度、药物与细胞 作用时间的选择及敏感标准的设立均各不相同，不 利于资料的积累和比较，限制了它的临床应用。为 此，本实验室就ＭＴＴ方法学进行系统研究，针对其 渐渐趋向Ｇ。期而趋于静止，影响结果，我们采用的 方法是在４８ｈ换含同浓度药物的培养液。 为了观察细胞是否贴壁对实验结果的影响，我 各环节，如受试药物浓度、细胞浓度、加药顺序、细胞 培养时间、ＭＴＩ＂培养时间等进行优化。除此之外， 们设置了先加药组和贴壁组。贴壁组是在细胞贴壁 ・８７４・ ２００８年１０月第１３卷第１Ｏ期Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏ￣．Ｏｃｔ．２００８．Ｖｏ１．１３．Ｎｏ．１０ 后再加入受试药物，其他培养条件一致。研究发现， 培养刚开始时，贴壁组的抑制率略高于先加药组， ８ｈ后二者的抑制率基本一致，表明本实验条件下， 细胞贴壁与否对结果影响不大。 我们研究了ＭＴｒ的孵育时间对结果的影响，结 果表明在孵育６ｈ内，抑制率呈上升趋势，６ｈ达峰 值，然后呈平缓，故可选择孵育时间为６ｈ。 通过系统性方法学研究，我们建立了一种Ｍ ｒＩＴＩ１ 肿瘤药敏试验的规范化操作流程，可以为临床医师 开展和实现个性化疗提供较为可靠的实验依据…ｊ。 参考文献 Ｌｅｔｗｉｎ Ｒ．Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｊ Ｏｎｃｏｌ Ｎｕｒ，２００１， ５（５）：ｌ９５—２００． ［２］ Ｕｎｔｃｈ Ｍ，Ｄｉｔｓｃｈ 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