【图片分析】如何应用imageJ进行细胞划痕面积分析？

1、插件安装插件下载地址：http://dev.mri.cnrs.fr/attachments/download/1992/MRI_Wound_Healing_Tool.ijm将下载的插件“MRI_Wound_Healing_Tool.ijm”文件放到安装目录下的macros/toolsets文件夹。2、重启ImageJ，然后点击ImageJ工具栏的>>按钮，可得插件位置；3、单击后在新工具栏中出现两个图标，第一个按钮是打开插件官网的帮助界面，“m”是用来测量的。左键单击第二个按钮“m”开始测量，右键单击“m”设置参数。4、插件内置有两种方法，默认是方差滤波法；（1）打开需要测量的图片，直接左键单击m图标，秒出结果，不过从本次结果来看，红色选区轮廓线离细胞有点距离，细胞划痕面积会偏小。（2）以上为默认参数。如果效果不好，可以根据下面的参数说明进行调参：右键点击“m”按钮设置参数。比如将Variancefilterradius值改小一点，将Threshold改大一点，点击OK；再次点击m图标，这回划痕面积和选区轮廓线也更贴近细胞一点；Variancefilterradius（方差滤波器半径）：要根据图片分辨率来设置，默认是10px，主要是用来识别划痕边缘，越大计算越慢，而且会导致测量得到划痕面积偏小；Threshold（阈值）：将由方差滤波器得到的图像转换为蒙版；如果调小一点选区会更精细，但会丢失掉一部分选区；调大一点，对于划痕区域识别会更准，但对边缘轮廓线会进行近似处理；具体可用查找边缘法中的threshold建立选区的操作体验一下。Radiusopen（空洞半径）：可用来关闭组织中的不属于划痕的空洞，要比需要排除的孔大、比划痕小，这个值默认4一般是偏小的，但是也无所谓，因为下面一个参数会很好地过滤掉空洞。Min.size（划痕最小大小）：可以进一步排除除划痕之外的其他空洞，这个大小可以使用矩形工具对划痕建立选区后进行测量，大概估算而求得；ignorespatialcalibration（忽略标尺校正）：这里没有校正，选不选都无所谓；在做了标尺校正的时候，视情况而定是否需要，一般不勾选。（3）左键点击“m”按钮开始自动检测经过一系列操作，最终会较为准确地识别出划痕，并测得划痕的面积。将划痕的ROI添加到ROIManager中，由此可以自动分析出划痕面积的变化情况。下面是不同参数条件下划痕效果。5、以上是默认的方差滤波法，当然这个软件也内嵌了查找边缘法（find-edges），在method里面改成find-edges，Variancefilterradius和Threshold两个参数在这种方法之下是失效的，不用管它们；6、然后把打开的图片，改成8bit：Image-Type-8bit，点击m图标即可；7、将标注（文字和箭头等）以选区的形式保存到选区管理器（ROIManager）里面，勾选ShowAll，然后利用拼合图层（Flatten[F]）来盖印生成新的图片。注意：会新生成一个添加了标注的图片。02查找边缘法

Image-Type-8bit；转换图片格式Process-EnhanceContrast（选做）增强对比Process->Smooth（选做）加强平滑效果Process->FindEdges找到划痕边缘Process->Filters->GaussianBlur…Sigma设为6，对图片进行模糊处理Image->Adjust->Threshold调整阈值Analyze-Measure1、打开图片之后，转换图片格式Image-Type-8bit(调成灰度图片，此步骤非常重要，必须转换)Tips：ImageJ软件的数据类型有：8位灰度或索引色，16位无符号整数，32位浮点和RGB色彩。由于许多操作是在灰色图像上完成的，因此将图片进行转换是十分必要的，此处将图片转换成8-bit的目的是：将图片调成灰色，加强图像的对比度。2、（选做）Process-EnhanceContrast增强对比勾选Normalize，Saturatedpixels中输入0.5%（如果感觉参数不合适，Ctrl+Z撤销就行，多尝试几次），使得划痕处细胞边缘和背景的分界比较明显即可；这一步会强化细胞和背景的对比，便于后面更准确地选择划痕；如果细胞和背景本身区分度就比较好的话，也可以不做，最后结果差不多；3、（选做）Process-Smooth加强平滑效果这一步其实和上面有一定程度的相悖，这步会使得细胞轮廓又变得模糊，显得更真实，但是第2步增强的颜色对比和边缘对比基本保留了下来；第2步和第3步总的效果跟使用Process-Sharpen，然后Image-Adjust-Brightness/Contrast提高对比度差不多；个人认为第2步和第3步的目的是强化细胞边缘，便于与划痕（背景）区分开来，但往往会造成最后测量的划痕面积稍微偏小；大多数情况下可以不做，直接第4步就行，但是一系列图片中要么都别做，要么都做。不少教程都有这两步，这里稍作说明。4、★Process-FindEdges找到划痕边缘这一步才是最重要的，也是“查找边缘法（FindEdges）”这个方法的名称来源，会通过二值化处理极大加强细胞和背景的对比，如果细胞的轮廓通过第2和第3步的强化，这步会更明显，如果没有强化也没太大关系；5、Process->Filters->GaussianBlur…Sigma设为6，对图片进行模糊处理6、Image-Adjust-Threshold调整阈值通过调节阈值，使得蒙版填满划痕；这一步不能直接用Threshold来构建选区，因为两侧细胞内部可能会存在空洞（下图细胞区域的红色点），这些空洞不属于细胞划痕的面积，要排除在外，但是会被Threshold自动选中。Tips:1.调整阈值目的：将图片转换成灰度图之后，通过设置阈值，使高于阈值的部分凸显出来，方便软件识别并计算其目的区域大小，或方便计数；2.绿框：设置Default为Red，即默认值为红；3.红框：适当调节绿框中的值使细胞的亮度更明显；随后点击Apply进行二值化处理，效果如下：结果使得图片非黑即白；7、选择目的区域二值化处理之后，背景颜色均匀，选择魔棒工具，点击黑色的划痕部分（即细胞划痕区域）得到红色包围的划痕区，如下图：这张图片比较理想，如果两侧细胞长得比较近，有些地方连到一起去了，可能会需要对划痕进行多次测量，然后将面积相加。8、Analyze-MeasureTips:红色框内的数值即为测得的划痕区面积值（面积值的单位是平方像素pixel2）为了计算细胞迁移率，可选择适当的时间点如6，12，24h后细胞图片，再进行上述操作。伤口愈合的百分比=(最初面积-某时间点的面积)/最初面积的比值9、划痕面积轮廓添加到原图上面；Analyze-Tools-ROIManager调出选区管理器或使用快捷键“q”(需提前设置)，选择Add[t]将刚刚用魔棒建立的选区存起来，然后再打开一次原图，选择拼合图层（Flatten[F]）应用到原图上面，即可把选区和本底图片一起盖印生成新的图片；10、还有另外一种方法，直接选择File-Revert即可将图片恢复到原来样子，但是选区还保留；选择Analyze-Tools-ROIManager，勾选ShowAll，然后利用拼合图层（Flatten）来盖印生成新的图片。注意：会新生成一个添加了标注的图片。参考文献：[1].JonkmanJEN,CathcartJA,XuF,etal.Anintroductiontothewoundhealingassayusinglive-cellmicroscopy[J].CellAdhesion&Migration,2014,8(5):440-451.以上分析所用图片为本人实验室实验数据，未经本人同意不得转载，引用。