乳酸菌菌种的分离筛选方法.

乳酸菌菌种的分离筛选⽅法乳酸细菌是⼀类能利⽤发酵糖产⽣⼤量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，⾰兰⽒阳性菌，⽆芽孢，不运动。营养要求⾼，需要提供丰富的肽类氨基酸维⽣素。在琼脂表⾯或内层形成较⼩的⽩⾊或淡黄⾊的菌落。通常⽤作为有益微⽣物的菌种有乳酸乳杆菌、⼲酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸⽚球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖⽚球菌等。

乳杆菌常⽤MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类

时，SL培养基常⽤作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常⽤GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被⽤作乳球菌的分离培养基。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的⼀个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，⽆鞭⽑。粪肠球菌为⾰兰⽒阳性，圆形或椭圆形。

乳酸⽚球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0µm，在直⾓两个平⾯交替形成四联状，⼀般细胞成对⽣，单⽣者罕见，不成链状排列。⾰兰⽒阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落⼩，呈⽩⾊。沿洋菜穿刺线的⽣长物呈丝状。

乳酸菌在⼀般琼脂培养基上形成微⼩菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基⼀般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加⼊醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌⽣长，对乳酸菌⽆害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对⽣成的乳酸量进⾏性能鉴定。乳酸菌⽣长繁殖时需要多种氨基酸，维⽣素及微氧，⼀般菌落⽐较⼩。分离培养基⼀般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进⽣长作⽤。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的⽣长，对乳酸菌⽆害。⼀.筛选⽅法：1.溶钙圈法：

利⽤⼀些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产⽣CaCO3溶解圈，从⽽筛选出这些产酸类细菌，可⽤于乳酸菌的筛选。其中培养基中加⼊CaCO3的作⽤是：①鉴别能产⽣酸的细菌；②中和产⽣的酸，以维持培养基的PH。筛选过程：样品预处理→梯度稀释⾄10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

48h→挑选产⽣溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染⾊，经镜检确认为纯种→挑选⾰兰⽒阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。2.溴甲酚绿指⽰剂法：

培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）

筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变⾊的菌落。⼆.菌种的分离筛选1.培养基：

★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L 预先灭菌碳酸钙5-10g/L PH ⾃然（分离⽤）

★★1.2⽜⾁膏 10g/L 蛋⽩胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁200g/L 葡萄糖10g/L 吐温0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚绿 0.01%PH6.0-6.5（分离⽤）★1.3番茄汁碳酸钙培养基：

酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁100mL 蛋⽩胨7.5g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐温 0.5 mL PH 6.0-6.5 （分离⽤）1.4葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.5

1.5蛋⽩胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13- 15g/L KH2PO4 1.5-2.0g/LMgSO

4 0.3-0.5 g/L MnSO4

0.2-0.25g/L NaAC 3.0-5.0g/L PH 5.5-6.5

1.6蛋⽩胨 0.8- 1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L ⽟⽶浆0.5- 1.0g/L KH2PO4 0.1- 0.3g/L MgSO4

0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/LPH5.5-6.5 （发酵或种⼦培养基）★★1.7 MRS培养基（分离培养计数⽤）

蛋⽩胨 10.0g、⽜⾁膏 10.0g、酵母膏 5.0g、柠檬酸氢⼆铵 2.0g、

葡萄糖 20.0g、吐温 80 1.0mL、⼄酸钠 5.0g、磷酸氢⼆钾 2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰 0.25g、琼脂 18.0g、蒸馏⽔1L, pH6.5。（分离培养基），当MRS培养基冷却⾄45～50℃时,加⼊已灭菌的碳酸钙, 充分混匀,倒平板。1.8 BCP培养基（溴甲酚紫培养基）

乳糖5.0g 蛋⽩胨 5.0g 酵母膏 3.0g 0.5℅溴甲酚紫10ml ⾃来⽔1000mlpH6.5-7.0 （分离⽤）

1.9 BCG⽜乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml⽔中，加⼊1.6℅溴甲酚绿酒精溶液0.07ml，0.075Mpa 20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml⽔中，加酵母膏1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1 Mpa 20min.趁热在⽆菌操作下两者混合均匀，倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。2.分离筛选：

2.1富集培养：取1.0g（1.0ml）于⽆菌细⼝瓶中，加⼊⽆菌麦芽汁液体培养液于瓶⼝处，密闭，25-32℃培养48h。若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，⾰兰⽒阳性，初步定为乳酸菌。以同样⽅法转接2-3次，接种量3-5℅.2.2菌种分离纯化：溶钙圈法：

富集菌液或样品适当稀释⾄10-7，混菌法分离，先加⼊10-12ml MRS培养基或麦芽汁培养基，凝固后再注⼊4-5ml⽔琼脂培养基，制成厌氧环境，30℃或37℃培养2-3天（温度低时间稍长），可出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。挑取透明圈⼤，培养基变黄的菌落，反复划线纯化2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于MRS培养基培养后保存备⽤。或接⼊液体培养基中，25-32℃培养24-48h，然后穿刺于MRS培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中，25-32℃培养48h保存备⽤。2.3性能测定：乳酸菌定性试验：

不同条件下的产酸速率试验：将分离菌种接种于MRS液体培养基中25℃ 37℃温度下培养测不同菌株不同温度的pH。⽅法1.吸取发酵液10ml，注⼊空试管中，加⼊10℅硫酸1.0ml，在加⼊2.0℅⾼锰酸钾约1.0ml，此时乳酸转化成⼄醛。取滤纸⼀条，在含氨的硝酸银

溶液中浸湿，横搭在试管⼝上，将试管徐徐加热⾄沸腾，使⼄醛挥发，若管⼝滤纸变⿊，证明有乳酸⽣成。

⽅法2.纸层析法：展开剂为正丁醇：甲醇：⽔=80：15：5，⽑细⾎管吸取发酵液，多次点样于新华滤纸上，1.5℅标准乳酸为对照，平衡2⼩时后进⾏层析，3℅溴甲酚蓝显⾊计算Rf值。

产酸量测定：5.0ml发酵液于150ml三⾓瓶中，加中性蒸馏⽔10-20ml，酚酞指⽰剂2滴，⽤0.1mol/l氢氧化钠滴定⾄微红⾊。

醋酸量（g/100mL）= 氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3 /样品毫升数 x100

同时，进⾏单因素试验，分别考察醋酸速度，耐⾼温，耐酒精度，耐低酸度等主要⽣产性能，选择优势菌株。3.菌株鉴定：3.1菌落形态：

3.2菌体形态：（⾰兰⽒染⾊观察）染⾊镜检：杆状阳性。3.3乳酸菌运动性检测：半固体穿刺法3.4⽣理⽣化：

3.3.1⽣化试验：产过氧化氢，产硫化氢，葡萄糖产⽣，硝酸盐还原，产⽣吲哚，甲基红，明胶液化，需氧，精氨酸，糖发酵试验。

3.3.2⽣理试验：

乳酸菌产酸能⼒曲线：将筛选的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，25-32℃培养48h，间隔4-6h测定发酵液pH。⾷盐对乳酸菌的影响：在MRS液体培养基中，添加0.0℅ 2.0℅ 4.0℅ 6.0℅氯化钠，菌种分别接种于培养基中，32℃培养48h，测定OD值。溴甲酚绿指⽰剂法：

原理：溴甲酚绿指⽰剂在酸性环境中呈黄⾊，碱性环境呈蓝⾊，分离培养基配制后PH为6.8，加⼊溴甲酚绿指⽰剂呈蓝绿⾊，产酸后菌落周围变成黄⾊，较容易鉴别。培养基：BCG⽜乳营养琼脂

初筛：将样品富集液梯度稀释，适温培养，平板上出现扁平的黄⾊菌落及周围培养基也为黄⾊初定为乳酸菌。

复筛：将典型菌落转接脱脂乳发酵管，若凝固，⽆⽓泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，⾰兰⽒染⾊阳性，连续传代若⼲次培养，挑选出3-4h能凝固的乳管保存备⽤。注：1.乳酸菌筛选常在⼏种培养基同时进⾏：

分别在麦芽汁碳酸钙培养基，番茄汁碳酸钙培养基，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）同时进⾏混菌划线或涂布培养（放厌氧袋），分别25℃ 37℃培养48h。

菌落观察：平板表⾯形成浅⾊（黄⾊或⽩⾊）⼩菌落。麦芽汁碳酸钙培养基表⾯，菌落周围形成透明圈，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）周围使紫⾊的培养基形成黄⾊包围圈。

触酶反应：厌氧菌⼀般⽆触酶（过氧化氢酶），⽤滴管滴加3.0℅过氧化氢于菌落上，若⽆⽓泡产⽣，证明该菌为触酶阴性。将各种特征菌落分别接⼊斜⾯，培养后保存，进⼀步⽣理⽣化试验，以鉴定分别何种乳酸菌。2.菌落鉴定：半固体或双平板琼脂利于乳酸菌的⽣长，菌落出现早。2.1菌落形态观察：乳⽩⾊边缘不整齐，稍呈半球状凸起，实⼼菌落。个体形态：半透明细杆状链状排列，⼤量时呈发丝状堆积。初步认为乳杆菌。

2.2⽣化鉴定：在吲哚试验中，加⼊菌种试管⽆任何变化，为阴性反应。说明该菌不具有分解⾊氨酸产⽣吲哚的能⼒。明胶液化淀粉⽔解氢氧化钾试验均为阴性，说明此菌为乳酸菌。（过氧化氢酶还原硝酸盐）

糖发酵试验：发酵果糖半乳糖葡萄糖乳糖产酸为阳性反应，其余麦芽糖蔗糖棉⼦糖⿏李糖产酸为阴性反应。根据⼿册第九版判断此种乳酸菌为德⽒乳杆菌保加利亚亚种。（纤维⼆糖⽢露醇⼭梨醇七叶苷⽔杨苷）2.3乳酸菌⽣长曲线pH-t测定结果：

三.⼏种乳酸菌筛选举例

1.嗜热链球菌：样品来源：市售酸奶培养基：M17改良培养基，培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选⽅法：常规的稀释涂布和划线分离

2.保加利亚乳杆菌：样品来源：市售酸奶，培养基：⽜⾁浸膏 1.5％，酵母浸膏0.5％，葡萄糖

3.0％，柠檬酸三铵 0.2％，七⽔硫酸镁 0.02％，琼脂 1.5％，pH 5.1。培养温度：42℃，需氧情况：兼性厌氧，筛选⽅法：常规的稀释涂布和划线分离法。

3.双歧杆菌：样品来源：婴⼉新鲜粪便，培养基：MRS培养基、NPNL培养基、TYP培养基、 PTYG培养基，培养温度：37℃，需氧情况：严格厌氧，筛选⽅法：常规的稀释涂布和划线分离法。