Ａｕｇ．２０１３．３３（４） 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ・３ｌ９ ｄｏｉ：１０．３９６９０．ｉｓｓｎ．１６７４—５８１７．２０１３．０４．０１５ 综述・ 卯胞质内单精子注射与转座子介导的转基 因技术 孔彭成 ，王美珊ｚ，朱莲 ，李和平２，蒋满喜 ，陈学进 （１．上海交通大学医学院实验动物科学部，上海２０００２５； ２．东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨１５００４０） ［摘要】 通过卵胞质内单精子注射（ＩＣＳＩ）已经成为治疗人类不育症和小鼠生殖生物学研究的一种 有效手段。ｒ￣＿ＥＬＩＣＳＩ介导的转基因作为一种动物转基因技术，仍然不够完善。但是相比传统的原 核注射技术，该技术最大的优势是可以导入较大片段的外源基因（比如人工酵母染色体ＹＡＣ）。最 近研究者们又发展了一种ＩＣＳＩ与转座子结合的转基因技术，能够高效地生产转基因后代，其效率 几乎可以与慢病毒载体法相媲美，值得在转基因动物研究中加以推广和应用。 ［关键词］卵胞质内单精子注射（ＩＣＳＩ）；转座子；转基因 ［中图分类号】Ｑ９５—３３【文献标识码】Ａ ［文章编号］１６７４．５８１７（２０１３）０４—０３１９—０５ 动物转基冈技术是指运用基冈ｌＴ程等实验技术 手段，对动物基因组进行有目的的遗传修饰，并通过 是随机整合的后代，出生率低…］。而且后代中会产 生大量的嵌合体，因此会影响转基冈在生殖系的传递 及其表达。另外，嵌合体现象多发生于外源基因整 合过程中ｌ】 ，其中只有大约有７０％的嵌合体动物能 动物育种技术使修饰改造的基冈稳定遗传给后代动 物的一种生物技术。２０多年来，动物转基因作为 一种发展迅速且应用广泛的生物技术，对生物科学 将转基因传递给后代；而且转基因后代中通常只有 ５０％的转基因能够正常表达［１０】。另外，猪和牛的卵 母细胞的细胞质是不透明的，需要离心才可以看到原 基础性研究、医学研究及生物制药都产生了巨大的 影响。转基因动物的制作通常包括原核注射…、慢 病毒介导『２１、胚胎干细胞【３］、精子载体法 、转座 核，原核注射技术在这类等动物中应用的难度更大。 慢病毒载体法是首先将目的基因重组到慢病毒 予【５１等方法。这些方法虽然原理不同，但是均可以 把外源基因转入到动物体内。 目前，应用最广泛的转基因方法是原核注射，即 将外源ＤＮＡ注入受精卵的雄原核，最后获得生殖系 遗传的转基冈后代ｌｌｌ ６， 。但是原核注射是一种受多 载体上，然后将重组病毒载体感染包装细胞制成高 滴度的病毒颗粒，最后注射到受精卵的卵周隙， 经胚胎移植制备转基因动物；或注射到卵母细胞 的卵周隙，体外受精后经胚胎移植制备转基因动 种因素影响的转基因技术，成功与否受到线性化ＤＮＡ 大小、浓度，体外操作和培养条件，以及受精卵自 我修复机制的影响［８］。效率不高而且经常会导致载 体拷贝的多重串联ｌ ９＿ 。小鼠受精卵移植后出生的 【收稿日期】２０１３－０１．１８ 【基金项目】国家自然基金（编号：８１１７０７５６／Ｈ０７１３） 物。Ｈｏｆｍａｎｎ等利用慢病毒载体导入法首次成功制 备了绿色荧光蛋白转基因猪［２］。慢病毒载体法的优 点是外源基因的整合率较高Ｉ夕 源基因多属单拷贝整 合；宿主范围广。但是慢病毒载体容量有限，外源 基冈片断长度通常小于１０ ｋｂ，因而转入的基因很 容易缺少其邻近的调控序列，同时慢病毒ＤＮＡ序列 可能会干扰外源基因的表达，以致整合后的表达率 低。且外源基因难以整合到生殖系统，所得转基 因家畜大多为嵌合体。携带外源基因的病毒载体在 导入受体细胞基因组过程中有可能激活基因组ＤＮＡ 【作者简介】孔彭成（１９８７一），男，硕上研究生，从事转基 动物 与发育生物学研究。 Ｅ—ｍａｉｌ：ｋｏｎｇｐｅｎｇｃｈｅｎｇ６１ １＠１６３。ｃｏｍ ［通讯作者】陈学进，教授，长期从事动物繁殖与转基因动物研 。Ｅ．ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｘｕｅｉ＠ｙａｈｏｏ．ｅｏｍ．ｅｎ 序列上的原癌基因或其他有害基因，安全性存疑。 胚胎干细胞法是将经过遗传操作的ＥＳ细胞注 射进囊胚后，这些多能性细胞能够与胚胎形成种系 蒋满喜，助理研究员，长期从事动物转基因和体细 胞核移植研究，Ｅ ｍａｉｌ＂ｍａｎｘｉｊｉａｎｇ２００２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃａ ３２０ 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 嵌合体，冈此通常作为一种载体，把外源ＤＮＡ导 入ＥＳ细胞实现转基因。优点是外源基因的整合率 很高，但是受到ＥＳ细胞建系和培养体系的影响， 维持ＥＳ细胞多能性是决定其成功与否的关键。 精予载体法作为一种运用较早的转基因技术， 以其操作简便，成本低廉而受到人们的极大关注。 Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等［４Ｊ首次利用精予载体法获得转基因小鼠 后，世界各国纷纷投入大量的人力物力进行研究， 使这项技术在理论和实践两方面都取得了长足的发 展。但是目前为止，虽然已有包括牛【１ ３］、猪【１４，１ ５］、 小鼠…在内的多种动物精子载体法相继获得了后 代，但是该方法仍存在一定的缺陷，物种差异性 问题一直没能得到解决。 本文主要针对卵胞质内单精子注射（ＩＣＳＩ）￣转 座予（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）介导的转基冈技术发展现状及其应 用前景作以下综述。 １ ＩＣＳＩ介导的转基因 １９９９年，美国科学家Ｐｅｒｒｙ等ｒｉ６］首次将ＩＣＳＩ技 术应用于动物转基因领域，并成功地获得了转基因 小鼠。ＩＣＳＩ介导的转基【天Ｊ又被称为ＭＩＩ转基因法。 这种技术要求通过冻融或去垢￣ＺＨＴｒｉｔｏｎＸ一１００处理 去掉精予膜，然后再与线性化的目的基因孵育， 精子头部暴露的核周膜能与ＤＮＡ相互作用，可以 作为转基因的载体，然后通过ＩＣＳＩ将精子一ＤＮＡ复 合物注入ＭＩＩ卵子中，外源基因通过ＤＮＡ的自我 修复整合到胚胎基因组。 小鼠和人的ＩＣＳＩ技术已经非常成熟，但是对 于其他物种却并非如此。具体原因还不是很清楚， 但是有文献认为１ ，有可能是因为ＩＣＳＩ时带入了精 子膜和精予顶体酶造成的。小鼠和人的精子顶体较 小，注入卵子不会导致其死亡，但是像精子顶体 较大的仓鼠，当注射入完整的精子时就会导致卵子 死亡【ｌ８～０ｌ。因而小鼠ＩＣＳＩ不必去除项体，但是如果 去除顶体，会有利于启动卵子的激活及其胚胎发育。 对于小鼠，精子破膜处理有利于提高精子与 外源ＤＮＡ结合内化效率［２１］，但是对于某些比较困难 的物种，即使冻融的精子成功率也很低【 ］。另外， ＴｒｉｔｏｎＸ一１００作为一种外源物质，ＩＣＳＩ过程中的携入 也埘可能对产生卵子一定的毒性。因此研究人员试 图利用卵磷脂替代ＴｒｉｔｏｎＸ一１００作为破除精子膜的另 一种选择。卵磷脂是细胞膜成分磷脂的水解产物， 冈此无细胞毒性。他们认为，卵磷脂处理的小鼠精了， ＩＣＳＩ后胚胎发育率一定会优于ＴｒｉｔｏｎＸ－１００处理【ｌ８】。之 后的研究也证实了这种假设，精子首先用０．０２％的 卵磷脂处理去膜，再用ＩＣＳＩ介导转基因，结果得到 ６２．５％的出生率和１１＿４％的转基因效率（表１）Ｉ２２】，提 高了小鼠的转基因效率。与冻融精子结合ＩＣＳＩ的 ４．６％相比较，卵磷脂处理能够获得较高的转基因 效率。卵磷脂处理的精子结合ＩＣＳＩ导入较大的外 源基因（＞２００ ｋｂ）时，不但能够提高ＩＣＳＩ卵子的成活， 改善胚胎发育过程，还可以提高获得转基冈后代的几 率。另外，还有研究发现，高浓度ＮａＯＨ处理精了 也可以显著改善小鼠的ＩＣＳＩ转基因效率 ｌ。 总体而言，ＩＣＳＩ介导转基因只有４５．５％的后 代能够正常出生，且平均效率仅为４．６％，而其中 大多数为嵌合体¨ ，。引。但是，与原核注射相比， ＩＣＳＩ转基因最主要的优势是，可以转入较大的 ＤＮＡ片段［２４—２６１。然而，业界观点认为，ＩＣＳＩ转 基因技术的实用性差，目前无法在生产中进行推 广。因此，ＩＣＳＩ介导的转基因技术需要进行进一 步的改进才有可能被广泛认可。 ２转座子介导的转基因 ２００５年，《细胞》杂志［５Ｊ刊出关于ＰＢ（ＰｉｇｇｙＢａｃ） 转座子在哺乳动物细胞和小鼠中高效转座，并成功 培育出带有荧光的转基因小鼠。这是在世界上首次 创立一个高效实用的哺乳动物转座因子系统，为大 规模研究哺乳动物基因功能提供了崭新途径，具体 过程见图１。 ＰＢ转座子在小鼠上的转座效率极高［２９１，是一 种双组件系统，它包括一个含转座酶的辅助质粒和 一个含转座子的供体质粒［３５１。但是转座酶ＤＮＡ通 过非同源方式整合到基因组中会对基冈组造成损 伤，因此Ｍｏｉｓｙａｄｉ等将ｐｉｇｇｙＢａｃ转座酶基因的ｃＲＮＡ 和载体质粒一起转入卵子中则克服了这一问题，尽 管ＲＮＡ仍有极小的可能性经反转录后与基因组整 合。这种技术能够精确测定ＤＮＡ和ｃＲＮＡ浓度， 便于确定其转基因的最佳浓度。 另外，他们还将辅助和供体原件共同整合到 一个质粒ｐＭＭＫ．２中进行了简化。这种单一质粒方 法更容易提高转座效率，如果质粒进入了细胞核， 辅助和供体组件亦同时转入。 近年来，利用转座子技术进行转基因动物功能 ３２２ 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｕｇ２０１３．３３（４） １／８，相比之下，如果采用转座予ＩＣＳＩ转基因，其 效率可以显著提高到３８％『３６】。 为了解决转座酶制备过程比较繁琐的问题， Ｓｕｇａｎｕｍａ等【２９】还研发出一种以ＤＮＡ为工具，原位 合成转座酶的方法，简化了其制备过程，为转座子： ＩＣＳＩ转基因技术的发展起到了极大的促进作用。 ４转座子介导的ＩＣＳＩ转基因技术优 势及其应用前景 除小鼠以外，其他动物的ＩＣＳＩ转基因效率都 比较低，因此也导致其无法在所有动物中推广和应 用。然而当需要转入大于５００ ｋｂ的基因时，ＩＣＳＩ 转基冈法就成为了首选途径，当转座子用于转基因， 特别是有关小鼠的研究证明了转座子能够显著提高 ＩＣＳＩ转基因效率（其效率接近逆转录病毒法）之后， 更为ＩＣＳＩ转基因技术提供了一定的发展机会。 另外，对各种转基冈方法的效率进行比较 时，不能仅仅关注转基因动物的出生率，更为重 要的是出生的阳性后代在所有显微注射胚胎中所占 的比例。比如，一种转基因方法所生出的后代百 分之百为转基因，但是需要注射１００枚胚胎才能够 获得一个（只），明显不如出生率仅为５０％，但是 只需注射４个胚胎就能得到一个（只）的转基因方 法。相比而言，两种显微注射转基因方法的效率分 别为１％和２５％。显然转座子：ＩＣＳＩ转基因就属于 后者，而且相关研究也证明，当小鼠ＩＣＳＩ与转座子 转基因技术结合以后，其转基因效率接近于慢病毒 载体法。由此笔者认为，转座子：ＩＣＳＩ转基因作为 一种新型的技术，不但具有高效、安全等优点， 而且一定会在转基因动物将来的研究及其拓展过程 中发挥巨大的作用，因此值得加以推广和应用。 ［参考文献】 ［１】Ｇｏｒｄｏｎ ＪＷ，Ｓｃａｎｇｏｓ ＧＡ，Ｐｌｏｔｋｉｎ ＤＪ， ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒ— ｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ＤＮＡ ［Ｊ】．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９８０，７７（１２）：７３８０—７３８４． 【２］ＨｏｆｍａｎｎＡ，ＫｅｓｓｌｅｒＢ，ＥｗｅｒｌｉｎｇＳ，ｅｔａ１．Ｅｆｉｆｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＥＭＢｏ Ｒｅｐ．２００３．４ ｆｌ１１：１０５４—１０６０． 【３】 Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｌｏｂｅ Ｃ，Ｎａｇｙ Ａ．ＥＳ ｃｅｌｌ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｎｄｉ— ｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ【Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００２，１ ８５：２８５— ３０７． 【４】Ｌａｖｉｔｒａｎｏ Ｍ，Ｃａｍａｉｏｎｉ Ａ，Ｆａｚｉｏ ＶＭ，ｅｔ ａ１．Ｓｐｅｒｍ ｃｅｌｌｓ ａｓ ．ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｅｇｇｓ：ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓ— ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９８９，５７（５）：７１７—７２３． ［５］ＤｉｎｇＳ，ＷｕＸ，ＬｉＧ，ｅｔａ１．ＥｆｉｆｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｐｏｓｉｉｔｏｎｏｆｔｈｅｐｉｇｇｙＢａｃ （ＰＢ）￣ａｎｓｐｏｓｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｎａｄ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００５， １２２（３）：４７３—４８３． ［６】Ｇｏｒｄｏｎ ＪＷ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ ＦＨ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｎａｄ ｓｔａｂｌｅ ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｍｏｕｓｅ ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８１，２１４（４５２６）：１２４４—１２４６． 【７】Ｈａｍｍｅｒ ＲＥ，Ｐｕｒｓｅｌ ＶＧ，Ｒｅｘｒｏａｄ ＣＥ Ｊｒ， ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒａｂｂｉｔｓ，ｓｈｅｅｐ ａｎｄ ｐｉｇｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｉｎｊ’ｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３ １５（６０２１）：６８０—６８３． 【８］Ｐｅｒｒｙ ＡＣ．Ｈｉｊａｃｋｉｎｇ ｏｏｃｙｔｅ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ？［Ｊ］．Ｍｏ】Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．２０００．５６（２ Ｓｕｐｐ１）：３ １ ９— ３２４． ［９］ Ｍｕｌｌｅｒ Ｕ．Ｔｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ，ｆｒｏｍ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ，１９９９，８２（１—２）：３—２１． ［１０】Ｗａｌｌ ＲＪ．Ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｉｃｍｉｎｊｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２００１，３（４）：２０９—２２０． ［１１］Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｔ，Ｋｕｒｏｉｗａ Ａ，Ｙａｍａｄａ Ｓ，ｅｔ ａ１．ＦＩＳＨ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １４２ ＥＧＦＰ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎｔｏ ｈｔｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ［ＪＪ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００２，８０（６）：５６４—５７４． ［１２】Ｌｅｗｉｓ—Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｊ，Ｈａｒｖｅｙ Ｍ，Ｗｉｌｂｕｍ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ￣ａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｓａｉｃｉｓｍ ｉｎ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｔ ｖａｒｉｏｕｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，１９９６，４５（１）：３３５． 【１３】Ｆｅｉｔｏｓａ ＷＢ，Ｍｅｎｄｅｓ ＣＭ，Ｍｉｌａｚｚｏｔｔｏ ＭＰ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＤＮＡ ｕｐｔａｋｅ ｂｙ ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｉｎｄｕｃｅ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２０１０，７４（４）：５６３—５６８． 【１４】Ｌａｖｉｒｔａｎｏ Ｍ，Ｆｏｍｉ Ｍ，Ｖａｒｚｉ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｓｐｅｒｍ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｒｔａｎｓｆｅｒ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｇｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｆｏｒ ａ ｈｕｍａｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ，１９９７，２９（８）： ３５０８．３５０９． ［１５】Ｌａｖｉｔｒｎａｏ Ｍ，Ｓｔｏｐｐａｃｃｉａｒｏ Ａ，Ｂａｃｃｉ ＭＬ，ｅｔａ１．Ｈｕｍａｎ ｄｅｃａｙ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｉｇｓ ｆｏｒ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｓｐｅｒｍ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ，１９９９，３ｌ（１－２）：９７２—９７４． 【１６］Ｐｅｒｒｙ ＡＣ，Ｗａｋａｙａｍａ Ｔ，Ｋｉｓｈｉｋａｗａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｉｍｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９９．２８４（５４１７）：１１８０—１１８３． ［１７】Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ Ｒ．Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ａｎｄ ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ：ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕ— ｍａｎｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ［Ｊ］．Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ，２００５，１０（２）： ２４７—２８８． ［１ ８】Ｍｏｒｏｚｕｍｉ Ｋ，Ｓｈｉｋａｎｏ Ｔ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ａｃｒｏｓｏｍｅ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｏｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａ— ｔｉｏｎ／ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２００６，１０３（４７）：１７６６１—１７６６６． ｆ ｌ ９】Ｍｏｒｏｚｕｍｉ Ｋ ａｎｄ Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ Ｒ．Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｒｏｓｏｍｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｈａｚａｒｄｏｕｓ ｔｏ ｅｍｂｒｙｏ Ａｕｇ．２０１３．３３（４） 实验动物与比较医学Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３２３ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ］Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００５，１０２（４０）： １４２０９—１４２１４． 【２８］Ｓｚｃｚｙｇｉｅｌ ＭＡ，Ｍｏｉｓｙａｄｉ Ｓ ａｎｄ Ｗａｒｄ ＷＳ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｔｅｒｎａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｄｅｇｒａ－ 【２０】Ｙａｍａｕｃｈｉ Ｙ，Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ Ｒ ａｎｄ Ｈｏｒｉｕｃｈｉ Ｔ．Ｆｕ１ｌ—ｔｅｒｍ ｄｅｖｅｌ－ ｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｇｏｌｄｅｎ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｏｃｙｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓ— ｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００３，６８（５）：１９０３— １９１０． ｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｈｅａｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００２，６７（２）：５３４— ５３９． ［２９】Ｓｕｇａｎｕｍａ Ｒ，Ｐｅｌｃｚａｒ Ｐ，Ｓｐｅｔｚ ＪＦ，ｅｔ ａ１．Ｔｎ５ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ～ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００５，７３（６）： １１５７—１ １６３． ［２ １】ＡｚｅｒＳｄｏ Ｇ，Ｅｓｐｅｒ Ｃ ａｎｄ Ｒｅｓｅｎｄｅ Ｋ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｒｏｚｅｎ—ｔｆｈａｗｅｄ ｇｏａｔ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｅｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ［Ｊ］．Ｓｍａｌｌ Ｒｕｍｉｎａｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００１，４１（３）：２５７—２６３． ［３０］Ｌｉ Ｘ，Ｌｏｂｏ Ｎ，Ｂａｕｓｅｒ ＣＡ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｔｅｍａ１ ａｎｄ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｒ ｆｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎ— ［２２］Ｍｏｉｓｙａｄｉ Ｓ，Ｋａｍｉｎｓｋｉ ＪＭ ａｎｄ Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ Ｒ．Ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｔｒａ— ｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐｉｇｇｙＢａｃ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００１，２６６（２）：１９０—１９８． ［３１】ＷｕＳ，ＹｉｎｇＧ，ＷｕＱ，ｅｔａＩ．Ｔｏｗａｒｄ ｓｉｍｐｌｅｒａｎｄｆａｓｔｅｒｇｅｎｏｍｅ— ｗｉｄｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２００７，３９（７）：９２２— ９３０． ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＩＣＳＩ）ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００９，３２ （２）：４７—６０． ［２３１ Ｌｉ Ｃ，Ｍｉｚｕｔａｎｉ Ｅ，０ｎｏ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｕｓｉｎｇ Ｎａ０Ｈ—ｔｒｅａｔｅｄ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ 【３２］Ｓｕｓｔｅｒ ＭＬ，Ｓｕｍｉｙａｍａ Ｋ ａｎｄ Ｋａｗａｋａｍｉ Ｋ．Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ— ｍｅｄｉａｔｅｄ ＢＡＣ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ａｎｄ ｍｉｃｅ［Ｊ］．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００９，１０：４７７． ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２０１０，８２（２）：３３１－３４０． ［２４】Ｍｏｒｅｉｒａ ＰＮ，Ｇｉｒａｌｄｏ Ｐ，Ｃｏｚａｒ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｉｃｉｆｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｉｎｔａｃｔ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｂｙ ［３３】Ｒｏｓｔｏｖｓｋａｙａ Ｍ，Ｎａｕｍａｎｎ Ｒ，Ｆｕ Ｊ，ｅｌ ａ１．Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｅｄｉ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ［ＪＪ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００４，７ｌ （６）：１９４３—１９４７． ａｔｅｄ ＢＡＣ ｒｔａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｖｉａ ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｊＩｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｚｙｇｏｔｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓｉｓ，２０１３，５１（２）：１３５—１４１． 【３４】Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｈ，Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｙ，Ｋａｗａｋａｍｉ Ｓ，ｅｔ ａ１．ｐｉｇｇｙＢａｃ 【２５】Ｏｓａｄａ Ｔ，Ｔｏｙｏｄａ Ａ，Ｍｏｉｓｙａｄｉ Ｓ，ｅｌ ａＩ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｂｒｅｄ ｎｄ ｈｙｂｒａｉｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｌａｒｇｅ（＞２００ ｋｂ）ｆｏｒｅｉｇｎ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０．１８（４）：７０７—７１４． ［３５】ＳｈｉｎｏｈａｒａＥＴ，ＫａｍｉｎｓｋｉＪＭ，ＳｅｇａｌＤＪ，ｅｔａｌ，Ａｃｔｉｖｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ： ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，２００５，７２（３）：３２９—３３５． ［２６】ＰｅｒｒｙＡＣ，ＲｏｔｈｍａｎＡ，ｄｅｌａｓＨｅｒａｓＪＩ，ｅｔａ１．Ｅｆｉｃｉｆｅｎｔｍｅｔａｐｈａｓｅ ＩＩ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ａｒｃｈｅｔｙｐｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１，１９（１ １）：１０７１—１０７３． ［２７］Ｌｏｉｓ Ｃ，Ｈｏｎｇ ＥＪ，Ｐｅａｓｅ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ，２００７，１６ （３）：３３３．３３９． ［３６］Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ＲＬ，Ｃｈｅｎ ＨＹ，Ｔｒｕｍｂａｕｅｒ ＭＥ，ｅｔ ａ１．Ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔ． ｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｆｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｍｉｃｅ ｂｙ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｎｇ ｅｇｇｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９８５，８２（１３）： ４４３８ ４４４２ ｖｅｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｓｃｉ，２００２，２９５（５５５６）：８６８－８７２． Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｓｐｅｒｍ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＫＯＮＧ Ｐｅｎｇ—ｃｈｅｎｇ ，ＷＡＮＧ Ｍｅｉ—ｓｈａｎ ，ＺＨＵ Ｌｉａｎ ，ＬＩ Ｈｅ—ｐｉｎｇ ，ＪＩＡＮＧ Ｍａｎ—ｘｉ ，ＣＨＥＮ Ｘｕｅ－ｊｉｎ ｆ ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００２５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｌｄｌｆｉｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ，Ｈａｒｂｉｎ １５００４４ ＣｈｉｎａＪ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＩＣＳＩ）ｈａｓ ｂｅｅｎ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｃｌｉｎｉｃｓ ａｎｄ ｉｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ ｏｎ ｍｉｃｅ．Ｍａｎｙ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ｅｎｇａｇｅｄ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｓｔｉｌｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｉｔ ｓｏｍｅｗｈａｔ ｃｕｍｂｅｒｓｏｍｅ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｇｒｅａｔｅｓｔ ａｄｖａｎｔａｇｅ ｏｆ ＩＣＳＩ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ￣ａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｉｓ ｔｈａｔ ｉｔ ａｌｌｏｗｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ＤＮＡ ｒｔｎｓｇｅｎｅｓ（ａｅ．ｇ．，ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｉｆｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）， ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈ ｅｆｉｃｉｆｅｎｃｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ｈｏｓｔｓ，ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｐｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｒｅｃｅｎｔｌｙ， ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ｈａｖｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ （ｔＣＳＩ－Ｔｒ）ｗｉｔｈ ｆｒｅｓｈ ｓｐｅｒｍ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｅｆｉｃｉｆｅｎｃｉｅｓ ｒｉｖａｌ ａｌｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｅｃｈ— ｎｉｑｕｅｓ ｅｘｃｅｐｔ ｔｈａｔ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｓｏ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ｗｏｒｔｈｙ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ＩＣＳＩ；Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ