茶树β-葡萄糖苷酶cDNA克隆和原核表达

·研究论文·

茶树茁-葡萄糖苷酶cDNA克隆和原核表达*

李远华

江昌俊**杨顺利

余有本

（安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点开放实验室，合肥230036）

摘要：对与萜烯类香气前体及与抗病虫害有密切关系的茶树(

)茁-葡萄糖苷酶cDNA进行克隆和原核表

该酶cDNA全长序列为1475bp(GenBank登录号为AF537127)，达。结果表明，与其它植物同源性为40%～60%。α-螺旋构象14.33%、β-折叠构象25.43%，存在多个氨基酸功能结构域。利用pET-32a表达载体构建的重组质粒，转化到大肠杆菌(

能催化葡萄糖苷)菌株BL21zztrxB（DE3）中，诱导产生63kD的融合蛋白，表达产物具有正常的生物学活性，

关键词：茶树；β-葡萄糖苷酶；cDNA；原核表达

键的水解反应；诱导表达结果显示，主要在细胞质中以可溶性蛋白形式进行表达。

茁-glucosidasecDNACloningintheTea(

andItsProkaryoticExpression

LIYuan-HuaJIANGChang-Jun**

YANGShun-LiYUYou-Ben

（KeyLaboratoryofTeaBiochemistryandBiotechnology,MinistryofAgriculture，

AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036,China）

)

The茁-glucosidasegenehasimportanteffectsonthealcoholicaromaprecursorsandinsect-resistance.Thecomplete

cDNAsquenceof茁-glucosidaseoftea(

)wasclonedanditsfulllengthwas1475bp(GenBank,AccessionNo.

AF537127),andshared40%～60%similaritytocorrespondingpartsof茁-glucosidasegenefromotherplantsinnucleotidesequence.Itssecondarystructurecontained14.33%琢-helicalconformation,25.43%茁-sheetconformationandmanyfunctiondomainsofaminoacid.The茁-glucosidasegenewasclonedintothepET-32aexpressionvectorandexpressedhigh-efficientlyin

BL21

(DE3),andthemolecularweightofexpressedfusionproteinwas63kD.Theresultsofemzymaticreactionshowedthatfusionproteinpossesednormalbioactivity,anditcouldcatalyzethedehydrationoftheglycodicbond.Thefusionproteinwasmainlyexpressedbysolubleproteinincytoplasm.

tea(

);茁-glucosidase;cDNA;prokaryoticexpression

（EC3，2，1，21）属于水解酶类，茁-葡萄糖苷酶

存在于自然界多种植物体内，还存在于一些酵母、曲霉菌、木霉菌属及细菌体内。它能水解结合于未端非还原性的茁-D-糖苷键，同时释放茁-D-葡萄糖和相应的配基；此外还能微弱地水解对硝基苯-茁-D-半乳糖和茁-D-木糖苷。在纤维素的糖化作用中，茁-葡萄糖苷酶的功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖[1]。

Liebig茁-葡萄糖苷酶的研究最早在1837年，

李远华:男，1963年生，高级农艺师，博士研究生。

**通讯作者Authorforcorrespondence.E-mail:.收稿日期：2003-12-17接受日期：2004-02-16

andWohler首次在苦杏仁汁中发现了该酶，此后在

微生物体内也发现[2]。茶叶中茁-葡萄糖苷酶的研究可以追溯到1981年，Takeo[3]发现茶叶匀浆液中添加茁-葡萄糖苷酶后能产生芳樟醇和香叶醇，证实茶叶中存在以葡萄糖苷形式存在的单萜烯醇。目前，对茶叶中茁-葡萄糖苷酶的研究已延伸至其活性与品种[4]和加工工艺[5,6]之间的关系上。

Misawa和Nakamura[7]于1989年对瘤胃球菌蛋白茁-葡萄糖苷酶基因在Zymononasmobilis中的表

（2004No.kjl37zd）*基金项目：安徽省教育厅自然科学研究计划重点项目资助。

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626农业生物技术学报

5'-AGAYACAAGTAAGAACCCTGCCTCAA-3';5'特异性引物(5'GSP):

5'-TCATTAAGGGTGGTCCAACAAAGA-3'。

2004年

达和稳定性进行了研究。目前已从燕麦[8]、蜀黍[9]、旱金莲[10]、长春花[11]、黄檀[12]等植物中进行了茁-葡萄糖苷酶基因的克隆和表达，而对茶树中的茁-葡萄糖苷酶基因研究，国内外至今未见报道。

1材料和方法

1.1材料

（）鲜叶采自安徽农业大茶树

学茶树品种园的农抗早品系。M-MULV逆转录酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶、限制性内切酶、DEPC、琼脂糖和RNasin购自Promega公司；pd（T）18购自AmershamPharmaciaBiotech公司；pMD18-T载体和T4DNA连接酶购自大连宝生物（TaKaRa）公司；Amp、X-gal、IPTG、DNAMarKer和DNA胶纯化回收试剂盒购自上海生物工程公司；3'/5'RACESystemforRapidAmplificationofcDNAEnds购自Gibco公司；pNPG(p-Nitrophenyl-茁-Dgalactopyranoside)、PVPP、异硫氰酸胍和SDS购自Sigma公司；表达大肠杆菌（）菌株BL21trxB（DE3）和载体pET-32a购自Novagen公司；核酸和蛋白质标准分子量购自华美生物工程公司；引物合成和测序由上海生工和大连宝生物（TaKaRa）公司完成；大肠杆菌菌株JM109由本实验室保存；其余试剂为国产分析纯。1.2方法

1.2.1茶树总RNA的提取采用江昌俊等[13]方法。1.2.2茶树茁-葡萄糖苷酶cDNA特异片段的克隆通过GenBank搜索黄檀等植物的茁-葡萄糖苷酶的氨基酸序列，用DNAStar中的MegAlign软件进行同源性比较，选取二处氨基酸保守序列，设计1对简并引物：

primerup：5'-G(G/T)(A/G/T)CC(A/C)AG(T/C)A(T/C)(A/G)

TGGGAT-3'；

primerdown：5'-G(C/T)TCATT(T/A/G)A(G/A)(T/G/A)GT

(A/G)(A/G)TCC-3'。

按照Gibco公司的3'/5'RACE3'/5'RACE扩增：

SystemforRapidAmplificationofcDNAEnds操作手册进行。

1.2.4β-葡萄糖苷酶的原核表达引物设计：根椐克隆的cDNA序列，通过软件分析选择成熟肽片段并设计1对引物。

upprimer:5'-CCGGAATTCAGTTGTATCACCATGTTTGG-3';RⅠdownprimer:5'-CCGCTCGAGTGTCGTGATCAGCAAAAATAG-3'。

Ⅰ（第三PCR反应参照《分子克隆实验指南》

版）。PCR产物用R玉和玉酶切并与pET-32a载体连接转化，采用含有氨苄青霉素(50滋g/mL)和卡那霉素（15滋g/mL）培养基筛选重组体。诱导表达按照Novagen公司pET载体手册进行。目的蛋白的分析，即培养基组分、细胞周质组分、

按细胞质可溶性组分及细胞质不溶性组分，

Novagen公司pET载体手册进行。用12％分离胶和5％浓缩胶进行SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳分析。表达的酶蛋白活性测定参照张正竹[14]方法。

1.2.5β-葡萄糖苷酶cDNA序列分析及蛋白质结构预测运用蛋白质数据库Prosite和Swiss-Prot

序列分中的Garnier法(GOR)预测蛋白质二级结构；

析运用GenBank的Blast-W软件和DNAStar软件包。

2结果和分析

RT-PCR反应、PCR产物纯化、载体的连接、感

方法参照试剂盒说明受态细胞的制备、转化及筛选：

书和《分子克隆实验指南》（第三版）。

用酶切检测：d芋和R玉酶切，1.2%琼脂

糖凝胶电泳检测酶切产物。

1.2.3茶树茁-葡萄糖苷酶基因3'/5'RACE扩增3'/5'RACE引物设计：

3'特异性引物(3'GSP):

2.1茶树β-葡萄糖苷酶cDNA克隆

用紫外分光光度法测定提取的茶树总RNA的230，260和280，260/280值在2.0左右，260/230为1.8，说明RNA质量较好。通过甲醛凝胶电泳可以看出有28S、18S和5S3条明显条带，且28S条带的亮度约是18S的2倍，表明提取RNA完整性好。

通过RT-PCR扩增出约210bp的特异性片段

进行3'RACE和5'RACE，（图1,a）。测序验证后，

分别得到约600和900bp的片段（图1,b、c）。2.2β-葡萄糖苷酶cDNA全长序列分析

对测序结果进行序列拼接，可得知β-葡萄糖苷酶cDNA全长为1475bp，该序列与其它植物的同源性为40%～60%。此序列已经在GenBank中登录，登录号为AF537127。

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第6期李远华等:茶树茁-葡萄糖苷酶cDNA克隆和原核表达627

其ORF由1350个核苷酸组成，通过软件分析，

与3'非编码450个氨基酸，5'非翻译区（5'-UTR）

翻译区（3'-UTR）分别由33个和92个核苷酸组成；预测氨基酸序列功能结构域有：4个N-豆蔻酰化位点（NSTK202、NFTK206、NRTQ238和NRSS307），5个

（SNR185、STK202、蛋白激酶C的磷酸化位点TSK247、

TLR270和STR371），2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（SIVE112和TLNE350），5个N-糖基化位点（GGHASK67、GQASGS281、GIRCCR288、GGLCAA317和GQKGSG331）。

体总蛋白的32.2%（图4）。

2.5表达蛋白的存在形式

菌体各组分蛋白SDS-PAGE如图5示，电泳图谱经软件分析表明：融合蛋白主要产生于细胞质中，其中可溶性细胞质蛋白占表达总蛋白的3/5左右，

占表达总蛋白的2/5不溶性细胞质蛋白（内含体）

左右；而培养基和细胞周质中，没有融合蛋白产生。

图2.编码β-葡萄糖苷酶成熟蛋白的cDNA片段的扩增Fig.2.AmplificatiionofcDNAfragmentcodingmature

1,DNAmarker;2,fragment.

图1.扩增产物凝胶电泳结果

Fig.1.AgrosegelelectrophoresisofPCRproduct

a.RT-PCRproduct.1,DNAmarker;2,specialfragment.b.3'RACEproduct.1,DNAmarker;2,3'RACEproduct.c.5'RACEproduct.1,DNAmarker;2,5'RACEproduct.

茁-glucosidase

（M茁-Glc）2.3茶树茁-葡萄糖苷酶成熟蛋白编码

区cDNA片段扩增

PCR扩增结果如图2所示，扩增片段长度约为947bp，与预期结果一致。将此片段插入到pET32a

。(+)中，构建成表达载体pET-2.4β-葡萄糖苷酶的表达分析

用表达载体pET-转化表达宿主菌，并用IPTG诱导其表达，结果可产生分子量约为63kD特异性融合蛋白，而对照(不带外源基因的载体pET-32a)则不表达该蛋白，蛋白质凝胶电泳如图3所示。对照表达的蛋白质分子量为23kD（其中含有6个组氨酸接头和109个氨基酸组成的硫氧还蛋白-TrxA），由此可推算出实际诱导表达的茶树茁-葡萄糖苷酶成熟蛋白的分子量为40kD，与理论值一

表达致。从图3还可以看出，随着诱导时间的延长，

的融合蛋白的量逐渐增加，诱导3h时达到最大。薄层扫描结果表明，诱导3h时表达的融合蛋白占菌

图3.重组质粒表达蛋白的SDS-PAGE电泳Fig.3.SDS-PAGEanalysisofexpressedproducts

1，蛋白质标准分子量；2，pET-32a诱导3h；3，pET-4，pET-pET-pET-诱导0.5h；5，pET-诱导1h；6，pET-诱导0h；诱导2h；7，

诱导3h。1,proteinmarker;2,pET-32ainducedfor3h;3,inducedfor0h;4,pET-inducedfor0.5h;5,pET-inducedfor3h.

inducedfor1h;6,pET-inducedfor2h;7,pET-

2.6表达蛋白活性测定

用β-葡萄糖苷酶专用底物pNPG进行显色反应，并用分光光度计法测定结果如表1所405值，

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628农业生物技术学报

表1茁-葡萄糖苷酶活性测定

2004年

从表1中可以看出，示。表达的融合蛋白和商品化黑曲霉的茁-葡萄糖苷酶都能催化pNPG进行显色反

都在应，反应液均呈黄绿色，且405值基本相同，

0.28左右。由此表明表达的融合蛋白具有较强的生物学活性。从表1中还可以看出，不同超声波处理次

以处理3的效果最好，数对表达酶活性强弱有影响，

茁-葡萄糖苷酶活性最强。

Table1Determinationoftheactivityof茁-glucosidase

样品Samples

黑曲酶β-葡萄糖苷酶β-glucosidasefrom处理1Treatment1处理2Treatment2处理3Treatment3CK1CK2

000.2850.0150.11测定值/

Value0.279

405颜色Color黄绿色Yellow-green黄绿色Yellow-green黄绿色Yellow-green黄绿色Yellow-green无色Noncolor无色Noncolor

处理1，1倍体积菌液经1次超声波；处理2，双倍体积菌液经1次超声波；处理3，1倍体积菌液经4次超声波；CK1，表达的蛋白样品在沸水浴中灭活；CK2，pET-32a空载体。Treatment1,onevolumeofbacteriumsonicatedforonetime;Treatment2,twovolumesofbacteriumsonicatedfortwotimes;Treatment3,onevolumeofbacterium

图4.表达蛋白SDS-PAGE的薄层扫描Fig.4.ScanofexpressedproteinsinSDS-PAGE

sonicatedforfourtimes;CK1,expressedproteinsampledisactivedin

boilingwater;CK2,expressedproteinofpET-32avector.

图5.各部分的表达蛋白SDS-PAGE电泳

Fig.5.SDS-PAGEanalysisofexpressedproductsbydifferent

siteafterIPTGinduction

1、2，细胞不溶组分蛋白；3，蛋白质标准分子量；4，总蛋白；5，

7周质蛋白；6，可溶性细胞质蛋白；8，培养基蛋白。1and2,insolubilitycytoplasm;3,proteinmarker;4,totalcellprotein；5and7,periplasmicfraction;6,solubilitycytoplasm

fraction;8,mediasample.

3讨论

本实验克隆了茁-葡萄糖苷酶全长cDNA序

列，并在大肠杆菌BL21中进行了表达。采用Nova-gen公司开发的表达载体pET-32a以融合蛋白形式进行表达，可以有效防止表达蛋白被细菌蛋白酶降

实验结果表明,表达的茁-解，而且能增加其可溶性。葡萄糖苷酶蛋白比较稳定，主要以可溶性形式存在，且不经Co2+或Ni2+树脂柱子纯化也具有较强的生物学活性。由此说明，本研究所克隆的cDNA全长序列为茶树茁-葡萄糖苷酶cDNA(已在GenBank登录，登号为AF537127)，这为今后通过微生物大量生产价格低廉茁-葡萄糖苷酶奠定了良好的基础。

从表达蛋白的SDS-PAGE分析结果可以推测出，表达的成熟茁-葡萄糖苷酶的分子量约为40kD，与根据cDNA序列所预测蛋白质分子量的理论值基本一致；而且分子量与黑曲霉茁-葡萄糖苷酶的[15]

比较接近（分子量为49kD），而与大豆[16]、日本根霉[17]差别较大。

通过软件预测，茶树中茁-葡萄糖苷酶成熟肽是由其cDNA中第433位至第1380位之间的核苷酸编码的，该段序列是影响其生物学功能的关键区域，但并不包括所有的氨基酸多功能位点。本实验用此片段进行表达的蛋白仍然具有正常的生物学活性，

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第6期李远华等:茶树茁-葡萄糖苷酶cDNA克隆和原核表达

26:909~219CicekM.1469~1478

629

说明这些多功能位点可能对该酶活性影响不大，也可能是不同的软件建立在不同的数学模型上。

Structureandexpressionofadhurrinase

(beta-glucosidase)fromsorghum.PlantPhysiol,1998,116:

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