脑慢性低灌注大鼠海马M1受体、ADAM17水平变化及意义
周 燕,闫福岭,高 亮,刘卫东
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(1淄博市第八人民医院,山东淄博255026;2东南大学附属中大医院)
摘要:目的 观察脑慢性低灌注老龄大鼠模型海马组织M1受体及解整合素)金属蛋白酶17(ADAM17)表达的变化,探讨阿尔茨海默病(AD)与脑慢性低灌注之间的联系。方法 将56只老龄大鼠随机分为A组和B组,各28只。A组永久性阻断双侧颈总动脉,制作脑慢性低灌注模型。B组只进行相应的手术步骤,而不结扎、阻断血流。采用Y型电迷宫分别于术后14、28d检测大鼠学习记忆能力,采用免疫组化法和免疫印迹法检测上述时间点海马组织M1受体和ADAM17的表达。结果 A组术后14、28d学习记忆能力较B组减退,M1受体和ADAM17表达较B组明显下降(P均<0.01)。结论 脑慢性低灌注可损害老龄大鼠学习记忆能力,导致AD发生,其机制可能与海马组织M1受体及ADAM17的表达下降有关。
关键词:阿尔茨海默病;脑低灌注;M1受体;解整合素)金属蛋白酶17
中图分类号:R741 文献标志码:B 文章编号:1002-266X(2009)30-0039-02
阿尔茨海默病(AD)的发病机制迄今不明。近年的研究表明,AD的发病与脑慢性低灌注有[1,2]关。2008年1~8月,我们制作老龄大鼠脑慢性低灌注模型,检测大鼠术后学习记忆能力以及海马M1受体和解整合素)金属蛋白酶17(ADAM17)表达变化,探讨AD发生机制。1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠56只,鼠龄12~14个月,体质量450~550g,由南京市浦口实验中心提供。普通饲料喂养,自由摄食与饮水,自然节律光照。大鼠术前12h禁食,4h禁水。实验动物随机分为A、B组,各28只。A组为低灌注模型组,B组为假手术组。
1.2 脑低灌注模型的建立 A组参考文献方法永久结扎大鼠双侧颈总动脉,建立大鼠脑低灌注模型。B组分离暴露双侧颈总动脉,不结扎、阻断血流。术后均单笼饲养,防止窒息。A组大鼠术后0.5~2h清醒,无追尾及肢体活动障碍,仅表现自发活动减少、反应迟钝、性格执拗。说明造模成功。1.3 模型鼠学习记忆能力及其M1受体、ADAM17检测 ¹大鼠学习记忆能力的检测:两组分别在造模成功后14、28d各取14只大鼠,进行Y型迷宫试验
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次性跑向安全区为正确反应。达到9/10正确反应为/学会0标准,以达标所需电击次数多少表示大鼠
学习记忆功能的优劣。检测均于上午8B00~11B00进行。º大鼠海马M1受体表达的检测:在学习记忆能力检测后,分别处死,取海马组织,其中7只用免疫组化SP法检测M1受体的表达。按试剂盒说明书进行操作。M1受体以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。随机观察10张切片,高倍镜下(@400)每张切片计数4个视野的阳性细胞数,计算其均值。»大鼠海马组织ADAM17表达的检测:另7只用Westernblot法检测ADAM17的表达。按试剂盒说明书操作。图像扫描,采用灰度分析软件分析蛋白条带的相对灰度值,ADAM17相对表达量=AD-AM17条带灰度值/B-actin条带灰度值。
1.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。所有数据以x?s表示,组间比较采用方差分析。P[0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 两组大鼠学习记忆能力的检测 术后14、28d,A组大鼠达到/学会0标准时所需的电击次数分别为(30.22?1.53)、(39.44?2.61)次,明显多于B组的(13.47?1.84)、(12.26?1.77)次(P<0.01)。
2.2 两组M1受体、ADAM17表达结果 见表1。3 讨论
AD以记忆减退、认知功能障碍为主要临床表现。信号转导功能失调被认为是AD发病的重要原
39,检测大鼠学习记忆能力。随机变换安全区与
电击区的位置,观察动物学会逃离电击区而进入安全区的反应能力。以大鼠在足底通电后10s内一
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通讯作者
山东医药2009年第49卷第30期
表1 两组大鼠海马组织M1受体阳性细胞数及
ADAM17阳性表达量比较(x?s)
组别A组
术后14d 术后28dB组 术后14d 术后28d
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APP加工处理的非淀粉源途径,导致AB产生增加。本研究结果表明,A组大鼠海马组织M1受体阳性细胞明显减少,提示脑持续低灌注大鼠发生胆碱能系统损害。ADAM17表达下降,大鼠的学习记忆能力也表现相应的障碍,且M1受体及ADAM17表达减少随时间的延长变化更为明显,说明M1受体及ADAM17参与了大鼠学习记忆过程。由此推测,脑慢性低灌注作为病理性刺激,可抑制大脑海马中M1受体的表达,影响M1受体与G蛋白的偶联作用,减少对PKC的刺激,导致APP加工处理的非淀粉源途径减少,而增加AB产生及聚集,产生神经毒性作用,损伤脑组织造成AD的发生发展。
总之我们认为,脑慢性低灌注可能作为病理性刺激,抑制大鼠海马M1受体表达,降低ADAM17的表达,大大增加其作用底物APP的量,再经B和C分泌酶的裂解,大量生成AB,导致AD的发生。参考文献:
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(收稿日期:2009-05-22)
M1受体阳性细胞数
(个)
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25.10?2.42
ADAM17
相对表达量0.21?0.00*0.09?0.001.06?0.001.04?0.01
*
18.78?3.1352.33?3.0849.55?3.66
*
注:与B组同时间相比,*P<0.01
因。中枢胆碱能系统功能紊乱在学习和记忆等
认知功能中的重要性已众所周知。临床研究证实,AD患者早期即有脑部低灌注现象,继之出现典型的低代谢和AD特征性临床表现,提示脑缺血是AD发病的重要危险因素。
本研究首先制作脑持续低灌注大鼠模型。造模成功后,应用Y型迷宫对两组大鼠进行学习记忆能力测定,术后14d电击次数较B组明显增加,出现明显的学习记忆障碍;术后28d电击次数继续增加,学习记忆损伤进行性加重。这提示大鼠持久性双侧颈总动脉结扎所诱导的脑慢性低灌注可导致进行性的学习记忆功能障碍。
AD发病机制的主流学说是B淀粉样蛋白(AB)毒性学说
[6]
。B淀粉样前体蛋白(APP)是AB
的前体物质,APP主要经淀粉源途径和非淀粉源途径进行代谢,淀粉源途径通过B、C分泌酶剪切得到完整的AB,而非淀粉源途径是经A-分泌酶裂解,直接破坏了APP内的AB结构,而不产生AB。A-分泌酶的表达减少可促进AB的生成,从而形成老年斑,参与AD的发生
[7]
。
ADAM17是一种重要的A-分泌酶,其表达活性与中枢神经系统信号转导通路中M受体及蛋白激酶C(PKC)的表达有关。M受体在生物信息由细胞外向细胞内传递的过程中起着重要作用,有5种亚型,其中M1受体是存在于大脑皮层及海马的主要亚型,与认知功能密切相关,尤其是短期记忆功能。神经递质与G蛋白相偶联的M受体结合,激活相应信号转导途径,为各种神经递质功能的实现及胞内信号分子网络的交互作用提供分子水平的物质基
[8]
础。研究发现,阻断M受体的药物如东莨菪碱可以导致大鼠和人的记忆功能障碍。Rossner等
[9]
研
究提示M1受体激活PKC,增强APP加工处理的非淀粉源途径。因此,AD的胆碱功能不足可能抑制
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