・中 草药・ 北方园艺２ＯＬＯ（２Ｏ）：１７８～１８０ 猪苓多糖提取工艺的优化 王晶晶，杨春文，张莹莹，董英伟，杜带弟 （牡丹江师范学院，黑龙江牡丹江１５７０１２） 摘要：对猪苓多糖的提取过程进行了研究。结果表明：猪苓多糖的最佳提取工艺为：用乙 醇含量为７Ｏ ９／６，ｐＨ值为６．５的提取液提取；用Ｓｅｖａｇ法去除蛋白效果最好；用氧化脱色法除色素 效果最好；分级沉淀时乙醇浓度为８０％时效果最好。 关键词：猪苓；多糖；提取工艺；优化；乙醇 中图分类号：Ｓ ６４６．２文献标识码：Ａ文章编号：１Ｏ０１一Ｏ０Ｏ９（２Ｏ１０）２０一Ｏ１７８一Ｏ３ 猪苓（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ（Ｐｅｒｓ．）Ｆｒ）属真菌门、担 实验课中“猪苓多糖的提取”是其中一项内容，其目的是 子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、猪苓（地花）属ｎ］。猪苓菌 使学生掌握新兴的生物产品制备技术，提高学生的实践 核在我国已有２ ０００多年的用药历史，其性平味甘，具有 能力及未来的就业机会。但在实际授课中常面临费用 利水渗湿、祛痰解毒的功能ｒ２］，大量近代药理和临床实 高、产品产率低、产品质量差、产品利用率低、后续研究 践证明，其提取物猪苓多糖是一种非特异性细胞免疫刺 匮乏等问题。因此 优化猪苓多糖的提取工艺，并进一 激剂，可以抑制癌细胞生长，目前被广泛用于癌症的辅 步开展对猪苓多糖分离、纯化的研究，形成具有价廉、产 助治疗，在治疗病毒性肝炎、肝硬化、抗辐射和白血病方 量高、品质优的完整的猪苓多糖制备工艺体系，并争取 面也有良好的效果［３］。近年来，已经成为较受欢迎的抗 在未来开设猪苓多糖的药用成分分析和以小白鼠为试 癌、抗肿瘤及保健食品。 验对象的猪苓多糖的抗癌、抗辐射和治疗肝损伤的试验 牡丹江师范学院生物系开设的生物工程下游技术 研究，建立完整的、有深度的、有实际应用价值的试验体 系，是该研究的最终目的。 第一作者简介：王晶晶（１９８０－），女，硕士，讲师，现主要从事生物化 １材料与方法 学及生物修复研究工作。 １．１试验材料 基金项目：牡丹江师范学院科技青年扶持资助项目（ＱＦ２００９０４０）； 猪苓购自牡丹江市天利医药商厦。 牡丹江师范学院科技青年一般资助项目（ＱＹ２０Ｏ９Ｏ５）。 １．２试验方法 收稿日期：２Ｏ１Ｏ—Ｏ７～２９ １．２．１ ｐＨ值和乙醇含量对猪苓多糖粗品提取率的影 Ｓｔｕｄｙ Ｏｉｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｃｒｕｄｅ ＣＭＣａｓｅ ａｎｄ Ｘｙｌａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａ－ｊ’ｕｄａｅ Ｒｅｓｉｄｕｅ ＭＡ Ｈｕａｉ－ｌｉａｎｇ，ＧＯＮＧ Ｚｈｅｒｖｊｉｅ，ＣＨＥＮ Ｈｕａｎ，ＭＩ Ｃｈｕｎ－ｘｉａ，ＹＡＮＧ Ｎａｎ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｕｄａｎｉｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ，ＨｅｉｌｏｎＮｉａｎｇ １５７０１２） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ，ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅｓ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｆｏｒ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｍｅｎｓｕｒａｔｅｄ，ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｔｏ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｎｄ ｘｙｌａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓ ａｎ ｉｎｄｅｘ，ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａ— ｕｄａｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ，ｘｙｌａｎａｓｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａ－ｊｕｄａｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｅｒｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ ２ ｍｉｎｕｔｅｓ ｉｎ ｗａｒｉｎｇ ｂｌｅｎｄｅｒ（１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ），ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｃａｎ ｂｒｅａｋ， ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ；ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ＣＭＣａｓｅ ｗｅｒｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３０￣Ｃ，ｔｉｍｅ １．０ ｈ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ－ ｍａｔｅｒｉａｌ ｒａｔｉｏ ４０：１ ａｎｄ ｔｈａｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｘｙｌａｎａｓｅ ｗｅｒｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２５￣Ｃ，ｔｉｍｅ ２．０ ｈ ａｎｄ ｌｉｑｕｉ－ｄｍａｔｅｒｉａｌ ｒａｔｉｏ ５０：１． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＣＭＣａｓｅ；ｘｙｌａｎａｓｅ；Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａ－ｊ ｕｄａｅ；ｒｅｓｉｄｕｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ １７８ 北方园艺２０１０（２０）：１７８～１８０ 响猪苓多糖的提取方法较多【４蜘，该研究针对实验教 ・中 草药・ 过程中的最适ｐＨ值和保温时间，ｐＨ值分别为７、７．５、 ８、８．５、９，保温时间分别为１、１．５、２、２．５、３ ｈ，保温温度 为５０￣Ｃ。 学采用水煮醇沉法，原因是由于其工艺成本低、设备要 求简单、安全、初步纯化效果较好，适合在实验教学中使 用。将粒径为１～２ ｃｍ的猪苓１００ ｇ放人容器中，加人 大概为猪苓体积１０倍的蒸馏水，煮沸１ ｈ，期间注意调 节ｐＨ值、补水，过滤，量取提取液体积，苯酚一硫酸 法口叩测定多糖含量。将获得的提取液用旋转蒸发仪浓 １．２．４分级沉淀将除去色素的多糖溶于热蒸馏水，加 ９５ 乙醇使醇浓度达到７０％，静置过夜，离心收集沉淀 溶于少量蒸馏水，用去离子水透析２４ ｈ，将多糖溶液分 别加入无水乙醇使醇含量分别为５０ 、６Ｏ 、７０ 、８０ 和９０ ９／６，静置过夜，离心收集沉淀，冷冻干燥，获得除蛋 白和色素后的多糖，确定最适分级沉淀的乙醇浓度。 缩，合并浓缩液，加入９５ 的乙醇，静置２４ ｈ，离心，收集 沉淀，回收乙醇，将沉淀冷冻干燥得猪苓多糖粗品。其 中加入９５ 乙醇使乙醇含量分别为５０ 、６０ 、７０ 、 ２结果与分析 ２．１ ｐＨ值和乙醇含量对猪苓多糖粗品提取率的影响 随着乙醇含量的逐渐增加，猪苓多糖粗品获得率不 断增加，但是差别不大，考虑到实验课中用药量较大，综 ８０ 和９０ ，探讨乙醇含量对猪苓多糖提取率的影响。 有研究表明酸性溶液可使多糖的提取率提高，因此，试 验把提取液的ｐＨ值设为５、５．５、６、６．５、７、８，乙醇含量为 ７Ｏ ，探讨ｐＨ值对猪苓多糖提取率的影响。 １．２．２猪苓多糖粗品中除蛋白的方法多糖中蛋白质 的去除方法一般有Ｓｅｖａｇ法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷 法和蛋白质水解酶法等＿１ 。由于蛋白质水解酶法操作 过于复杂、药品比较昂贵不适于实验教学，因此分别采 用Ｓｅｖａｇ法，三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法对猪苓多糖 粗品中的蛋白质进行处理，探讨最适用于实验教学的 方法。 合经济因素，确定猪苓多糖粗品提取时乙醇含量为 ７Ｏ ，并注意回收乙醇（图１）。 不同ｐＨ值的提取液对猪苓多糖的获得量存在影 响。由图２可知，ｐＨ值为６．５时最高，为６．７０ ｇ。因此 确定，在猪苓多糖粗品提取时采用水煮醇沉酸提取法， 其中乙醇含量为７０ ，提取液ｐＨ值为６．５。 ２．２猪苓多糖粗品中除蛋白的方法 除去多糖中含有的蛋白一般采用Ｓｅｖａｇ法、三氯乙 １．２．３猪苓多糖粗品中除色素的方法除去色素的方 酸法和三氟三氯乙烷法。由图３可知，其中三氟三氯乙 烷法效果最好，但是由于三氟三氯乙烷容易挥发，不适 法一般有活性炭法、ＤＥＡＥ纤维素法和氧化脱色法等， 源于植物的色素大多呈负离子，不能用活性炭脱色，若 多糖与色素结合则易被ＤＥＡＥ纤维素吸附，不能用水洗 脱，因此采用Ｈ ０２氧化脱色法除色素［１ ，并探讨提取 ８ 于大量使用，Ｓｅｖａｇ法收率较高，防降解效果好，因此在 实验教学中采用Ｓｅｖａｇ法除去粗品中的蛋白。 删７ ５ ８ 建６ ０Ｅ ４ ３ 捌 ｅ 瞳 雌 豢２ 蚺ｌ 囊 奚ｚ 。 鞭 蚺 诤０ 己醇含量／％ 遐 耀 ～Ｓｅｖａｇ￣法 三氯乙 三氟三氯 酸法 乙烷法 猪苓多糖中除去蛋白的方法 图１不同乙醇含量对猪苓多糖 粗品获得量的影响 图２提取液的ｐＨ值对猪苓多糖 粗品获得量的影响 图３不同除蛋白方法对猪苓 多糖获得量的影响 ＼ 删 ｂｏ 删 礁 ＪⅡ 罐 啦 ＝ｃ囊； 罐 蟹 № 据 蚺 鞲 攥 图４不同ｐＨ值对除去猪苓多糖中 含有的色素影响 图５不同保温时间对除去猪苓多糖 中含有的色素影响 图６不同乙醇含量对猪苓多糖 纯品分级的影响 １７９ ・中草药・ 北方园艺２ｏｉｏ（２ｏ）：１７８～１８ｏ ２．３猪苓多糖粗品中除色素的方法 除色素的方法，但要注意在保温过程中调节ｐＨ值，控制 不同ｐＨ值和保温时间对猪苓多糖中含有的色素 温度不能过高，以防止多糖降解。 的除去存在影响。由图４、５可知，ｐＨ值为８时，猪苓多 多糖类物质多数为水溶性，其醇溶性随聚合度增加 糖获得量最高为２．６５ ｇ，保温时间为２ ｈ时，获得量最 而降低，因此在多糖的水溶液中加入乙醇，随着乙醇浓 高，为２．２４ ｇ。 度的增加，可获得不同乙醇梯度时析出的沉淀，从而完 ２．４分级沉淀 成多糖的简单分级，各浓度获得的猪苓多糖经凝胶色谱 随着醇浓度梯度的增加，分别得到不同量的沉淀， （ＧＰＣ）鉴定在结构上几乎没有差别，产品若用于进一步 达到多糖的简单分级的目的。由图６可知，在醇浓度达 的应用还需进行红外光谱、气相色谱等鉴定。 到８０ 时，沉淀获得量最高，各浓度获得产品经凝胶色 参考文献 谱（ＧＰＣ）鉴定在结构上几乎没有差别，均为单一成分。 Ｅ１３柳玲玲，朱国胜，刘永翔，等．优质猪苓菌株的初步筛选ＥＪ３．湖北农业 ３讨论 科学，２０１０，４９（１）：９１—９４． 多糖提取过程中一般都采用水提醇沉法，由于提取 ［２３许广波，傅伟杰，赵旭奎，等．我国猪苓研究的进展［Ｊ３．菌物研究， ２００３（１）：５８－６１． 液的酸碱程度对产品获得量存在影响，因此试验对猪苓 ［３３王林丽，吴寒寅，赵旭奎．猪苓的药理作用及临床应用［Ｊ］．中国药业， 多糖粗提过程进行了优化，采用了水煮醇沉酸提取法， ２０００，９（ｉｏ）：５８—５９． 获得了更高的收率。由于在试验教学中用药量较多，因 ［４］苏德龙，史洪波，裴福成，等．正交实验法研究猪苓多糖提取工艺［Ｊ］． 此在粗品收率差别不大的前提下乙醇含量采用了７０ ， 基层中药杂志，２００２，１６（１）：２７—２８． 在实验中对离心后注意回收上清液，用旋转蒸发仪可回 Ｅ５３王贵发，马力，徐楚鸿，等．猪苓多糖的提取与含量测定Ｉ－Ｊ］．医药导 报，２００６（４）：３４６． 收乙醇，降低了实验成本。 ［６］张青．苯酚～硫酸比色法测定多糖含量ＥＪ３．山东食品科技，２００４（７）： 多糖中蛋白的除去一般都利用蛋白在一定条件下 １７—１８． 会变性这一特点，该试验采用Ｓｅｖａｇ法除蛋白，相对于三 ［７３张鑫．液体深层培养猪苓菌丝体及猪苓多糖的研究［Ｄ］．无锡：江南 氟三氯乙烷法虽然收率稍低一些，但是三氟三氯乙烷法 大学，２００８． 所用溶剂容易挥发，具有低毒性，不适合在实验教学中 ［８３陈文强，邓百万，刘开辉，等．猪苓多糖超声提取工艺条件优化［Ｊ］．食 品与生物技术学报，２００８，７（４）：５３—５７． 使用，而三氯乙酸法较Ｓｅｖａｇ法收率低且会引起某些多 －１９３雷萍，孙悦迎，张鑫，等．猪苓发酵菌丝多糖分离提取工艺研究［Ｊ］．中 糖的降解，因此Ｓｅｖａｇ法是最适合用于实验室的提取猪 国食用菌，２００６，５（２５）：４５—４７． 苓多糖的方法。 ［１ｏ３田广文，陈德育，李学俊，等．猪苓多糖苯酚一硫酸法测定条件的优选 源于植物的多糖一般颜色较深，并大多呈负离子， ［Ｊ］．中国农学通报，２００７，２３（７）：７５—７８． 不能用活性炭脱色，用吸附法除色素时若多糖与色素是 ［１１］徐述明．猪苓多糖硫酸酯化及其研究［Ｄ］．武汉：武汉理工大 学，２００６． 结合的则不易被洗脱，因此Ｈ２（）２氧化脱色是最适合的 Ｏｐｔｉｍｉｚｅ ａｎｄ Ｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ－ｊｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｗｅｎ，ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ－ｙｉｎｇ，ＤＯＮＧ Ｙｉｎｇ－ｗｅｉ，ＤＵ Ｄａｉ－ｄｉ （Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ １５７０１２） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ａｍｏｕｎｔｅｄ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏ ７０ ａｎｄ ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ａｃｉｄｉｔｙ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ６．５；ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｓｅｖａｇ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ－ｓｔｒｉｐ ｗｅｒｅ ｂｅｓｔ ｆｏｒ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｉｇｍｅｎｔ；ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ａｍｏｕｎｔｅｄ ｔｏ ８０％ｈａｄ ｂｅｓｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｕｒｎｂｅｌｌａｔｕｓ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ；ｏｐｔｉｍｉｚｅ；ａｌｃｏｈｏｌ １８Ｏ