ELISA试剂配制及实验流程

ELISA试剂配制及实验流程

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。以双抗体夹心法举例说明。

试剂配制：

(1) 包被缓冲液 + 碳酸盐缓冲液)：

Na2CO3

NaHCO3

加蒸馏水至1000ml。（用时稀释成1x，加%BSA）

(2) 洗涤缓冲液 0.15M PBST)：

%Tween-20

加在PBS缓冲液1000ml中。

PBS缓冲液：

KH2PO4 0.27g

Na2HPO4·12H2O 3.58g

NaCl 8g

KCl

加蒸馏水至1000ml。

(3) 封闭缓冲液：

牛血清白蛋白(BSA) 2% 2g

（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。

(4) 稀释液：

牛血清白蛋白 %

加PBS 缓冲液100ml。

(5) 底物缓冲液：

Na2HPO4(无水L，带12结晶水L) 取

柠檬酸(无水L，带1结晶水L) 取

加蒸馏水至100ml。

(或Na2HPO4·12H2O 1.84g

柠檬酸·H2O 0.51g

加蒸馏水至100ml)

(6) TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：HRP-

TMB(2mg/ml水)

底物缓冲液

30% H2O2

总体积1ml。

TMB, 1mg/ml-DMSO溶解

(7) 或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）：

OPD（干粉） 0.004g

底物缓冲液 10ml

30% H2O2

总体积10ml。

(8) 终止液(2M H2SO4)：

在水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)，边加边摇。

操作步骤：

1. 包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每板的反应孔中加，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。(简称洗涤，下同)。

2. 封闭：加封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。然后洗涤。

3. 加样：加待检样品于反应孔中，置37℃温育1~2小时。然后洗涤。(同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔)。

4. 加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体。置37℃温育1~2小时。然后洗涤。

5. 加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体。37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。

6. 加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。

7. 终止反应：各反应孔中加入2M硫酸。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变

棕色）

8. 结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示。测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。

间接法操作步骤：

1. 包被：用包被液将样品稀释（梯度稀释，比例自己定）， 4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次（5至7次），中间振荡。(简称洗涤，下同)。

2. 封闭：加封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。然后洗涤。

3. 加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体。置37℃温育1~2小时。然后洗涤。

4. 加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体。37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。

5. 加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。

6. 终止反应：各反应孔中加入2M硫酸。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）

7. 结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示。测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。

------罗凯明师兄----------

包被缓冲液（NaHCO3-Na2CO3缓冲液） 量取0.2MNaHCO317mL，0.2MNa2CO38mL溶于75mL双蒸水中

PBS 称取NaCl8.0g,Na2HPO412H2O2.9g，KCl2.0g，KH2PO40.2g溶于1000mL双蒸水中

洗涤液（PBST） 量取Tween-20溶于1000mLPBS中

酶标抗体稀释液 量取4mL新生小牛血清CS溶于96mLPBST中

底物液 称取OPD4mg溶于40mL3%H2O2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中，临用前配制

磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液 量取mL0.1M柠檬酸钠，mL0.2MNa2HPO4，加双蒸水至100mL

明胶封闭液 称取1g明胶溶于100mLPBS中

小牛血清封闭液 量取10mL小牛血清溶于90mLPBS中

酶反应终止液（2MH2SO4） 量取10mL浓H2SO4溶于80mL双蒸水中

ELISA步骤： ----------根哥给的方法-----------

1）实验材料

目的抗原

BSA或其他对照抗原(15uμg/ml)

PBS

96孔ELISA板；

96孔ELISA封板膜；

移液枪

封闭液：5%脱脂牛奶(w/v)-PBS

抗血清

% (v/v) Tween20-PBS

HRP-兔抗鼠多克隆抗体

TMB(A，TMB：称取固体TMB 溶于DMSO 配成1mg/ml液体，避光保存，最好4度用前要检查其状态，若有凝固，可用手温将其融化；B，底物缓冲液为0.1M 醋酸钠-醋酸缓冲液，；使用时用底物缓冲液稀释A液至100μg/ml；50ml缓冲液加入10μl 30% H2O2)。

稀硫酸(1M)

酶标仪

2）实验步骤

(1). 用PBS缓冲液将抗原(目的抗原、BSA或其他对照抗原)稀释至μg/ml。。

(2). 每孔加入100μl抗原稀释液，4℃包被过夜。

(3).以用PBS洗3次(每次每孔200μl，每次洗5min)。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h。

(4). 弃封闭液，以% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔200μl，每次洗5min)，然后用PBS洗3次(每次每孔200μl，每次洗5min)。每孔加入100μl已稀释好的抗血清，37℃孵育2h。

(5). 以% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔200μl，每次洗5min)，然后用PBS洗3次(每次每孔200μl，每次洗5min)。

6. 弃洗涤液，每孔加入100μl按说明书比例稀释的HRP-兔抗鼠多克隆抗体，37℃孵

育h。

7. 以% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔200μl，每次洗5min)，然后用PBS洗3次(每次每孔200μl，每次洗5min)。

8. 弃洗涤液，每孔加入100μl底物液，室温孵育10min（视情况而定）。孔内的液体将显示为蓝色。

9. 每孔加入50μl稀硫酸(1M)终止反应。

10. 测定OD450和OD650，并以OD450的值减去OD650的值，作为最后的检测结果。

ELISA。